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Genética reversa III. Mutagénesis dirigida.
Gene targeting mediante recombinación homóloga
El DNA transformante es llevado hasta el gen mediante secuencias
homólogas
•Knockout por inserción
•Mutación por conversión génica
Ventajas:
•El investigador elige el gen que quiere modificar
•El investigador tiene un control total sobre la forma en la que
modifica el gen (mutación puntual, cambio de expresión KO….)
Genética reversa III. Mutagénesis dirigida.
¿Por qué no se usa siempre?
La eficacia del proceso depende de la ratio HR/IR
Partners and pathways: repairing a double-strand break (2000). James
E. Haber. TIG 16 (6). 259-264.
DNA double strand break repair in mammalian cells (2000). Peter
Karran. Current Opinion in Genetics & Development, 10:144–150
Genetic aspects of targeted insertion mutagenesis in yeasts (2004)
U. Klinner *, B. Schäfer. FEMS Microbiology Reviews 28: 201–223
Genética reversa III. Mutagénesis dirigida.
HR/IR.
Genética reversa III. Mutagénesis dirigida.
Las proteínas implicadas en HR e IR se encuentran conservadas
desde levaduras a humanos.
El método preferente de reparación es, sin embargo, específico
Finalmente, la eficacia de gene targeting depende de la utilización
de HR en el organismo.
Gene targeting in Physcomitrella patens (2001). Didier G
Schaefer. Current Opinion in Plant Biology 2001, 4:143–150.
Gene targeting in mice: functional analysis of the mammalian
genome for the twenty-first century. Mario R. Capecchi. NATURE
REVIEWS. GENETICS VOLUME 6. JUNE 2005, 507
From sequence to phenotype: Reverse Genetics in Drosophila
melanogaster. Melissa D. Adams and Jeff J. Sekelsky. NATURE
REVIEWS. GENETICS. VOLUME 3. MARCH 2002. 189
Genética reversa III. Mutagénesis dirigida.
Genética reversa III. Mutagénesis dirigida.
Ratón
Genética reversa III. Mutagénesis dirigida.
Ratón
Genética reversa III. Mutagénesis dirigida.
Ratón
Genética reversa III. Mutagénesis dirigida.
Ratón
¿Análisis genético?
Genética reversa III. Mutagénesis
dirigida.
Análisis Genético
Nº de copias de la construcción?
Modificación del gen diana?
Ligamiento fenotipo alteración del gen diana?
Varias líneas
Genética reversa III. Mutagénesis dirigida
condicional, CRE-loxP targeting
Genética reversa III. Mutagénesis dirigida.
Generation of mice with a novel conditional null allele of
the Sox9 gene.
Sook Peng Yap, Xing Xing • Petra Kraus, V. Sivakamasundari, Hsiao Yun Chan, Thomas
Lufkin. Biotechnol Lett (2011) 33:1551–1558
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Sox9 es un factor de transcripción esencial en el desarrollo del cartílago y
regulador clave del desarrollo de testículos.
También participa en el desarrollo de otros tejidos: glia, cresta neural,
corazon, pancreas…..
Mutaciones en Sox-9 son responsables del desarrollo de displasia
campomélica, una enfermedad autosómica dominante (OMIM #114290)
La enfermedad está caracterizada por huesos arqueados, deformaciones
en pelvis, defectos craneofaciales, reversión sexual, malformaciones en
riñón, corazón, ………….
Genética reversa III. Mutagénesis dirigida.
La creación de un modelo en ratón no es fácil: los ratones Sox9+/mueren al poco de nacer, mientras que la deficiencia total en Sox9 da
lugar a letalidad embriónica temprana.
El problema podría ser resuelto mediante la generación de un alelo
mutante condicional de Sox9. La inactivación del gen en un tejido o
situación determinados permitiría el análisis de la función del gen en
esas situaciones.
Genética reversa III. Mutagénesis dirigida.
Para el desarrollo de un KO condicional se han empleado los sistemas de
recombinación FLP-FRT y CRE-LOXP
El vector linearizado fue introducido por electroporación en células madre
embrionarias de ratón. Las células transformadas se seleccionaron durante 8 días
con G418 (200–400 ug/ml). ¿Selección negativa?
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Las colonias G418r se utilizaron para microinyectar embriones en estadio 6-8 células.
Finalmente
se
obtuvieron
28
quimeras
Sox9+/floxFRTNeo, procedentes de 2 clones ES.
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El cassette Neo fue eliminado por recombinación mediada por
FLPe. Las quimeras se cruzarón con ratones FLPe-deleter lo cual
produjo una descendencia Sox9+/flox:WT 1:1.
La ausencia del cassette Neo fue determinada mediante Southern
blot genómico.
El alelo Sox9flox parece perfectamente funcional al menos en Het y
de hecho obtienen ratones homocigotos Sox9flox/flox de fenotipo WT
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Para activar la mutación, los ratones Sox9flox/flox se cruzaron con ratones Col2a1-Cre
que expresan fuertemente la recombinasa Cre en el cartílago del esqueleto axial
El genotipado se lleva a cabo mediante PCR con
ensayos diseñados para detectar Lox-P antes y
después de la recombinación
Genética reversa III.
Mutagénesis dirigida.
El cruzamiento inicial Sox9flox/flox por Col2a1Cre produjo doble heterocigotos Sox9+/floxdel;
Col2a1-Cre que ya mostraban cierto fenotipo
Estos heterocigotos se cruzaron con ratones
Sox9flox/flox para dar lugar a embriones
Sox9floxdel/floxdel; Col2a1-Cre (en cartílago) que
fueron utilizados en análisis histológicos
Genética reversa III. Mutagénesis dirigida.
La inactivación de Sox9 en el esqueleto axial determina osificación
prematura en heterocigotos y malformaciones severas en homocigosis.
Genética reversa III. Otro ejemplo
A Global In Vivo Drosophila RNAi Screen Identifies NOT3 as a
Conserved Regulator of Heart Function
Cell 141, 142–153, April 2, 2010
La función Not 3 en mamíferos es desconocida, los autores deciden
crear un ratón KO por recombinación homóloga.
Genética reversa III. Otro ejemplo
Los ratones heterocigotos para el KO muestran una expresión menor
del gen y defectos cardiacos agravados por la edad.
Genética reversa III. Otro ejemplo
Los defectos no se deben a la
ausencia de función Not3 en otros
tejidos, en experimentos “ex vivo”
los corazones muestran defectos
medidos de distintas formas.
Genética reversa III. Otro ejemplo
ETC…. Sobre caracterización fenotípica del heterocigoto not3+/not3-,
sometido a diferentes estreses….
Y en humanos? es posible la genética reversa?
En una revisión de proyectos de GWAS,
los autores encuentran una asociación
significativa entre un polimorfismo en el
promotor de Not3 y un fenotipo cardiaco:
repolarización cardiaca anormal, medida
como alteraciones en el intervalo QT, que
predispone a muerte súbita.