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Herramientas de Biología
molecular. PCR. Protocolos
recomendados
Dra. Alicia Lapierre
FUNDAMENTO PCR
 Es la amplific. enzimática de un fragmento de ADN
flanqueado por dos secuencias de oligonucleótidos
que hibridan en la cadena complementaria de la
molécula molde que se va a amplificar (cebadores
o “primer”) y que son utilizados por una DNA
polimerasa termoresistente para copiar la
secuencia de la misma.
 Consta de 3 etapas: desnaturalización, hibridación
y extensión.
PCR
 Aspectos generales
 Ampliamente sensible, detecta mínimas cantidades
de un gen o secuencia.
 Rápida. En pocas horas permite obtener resultados
 Múltiples aplicaciones
PCR ventajas en
diagnostico de Chagas:
- puede diferenciar infec. por otros hemoflagelados
- no depende de estado inmunológico del paciente
(como lo es la detección de Ac)
-es muy sensible en pacientes en et. crónica de la
enfermedad,
-también es útil para el diagn. de inf. congénita.
Componentes de la reacción
 Tres elementos
1. El ADN o material genético
2. Los “primers” o iniciadores
3. La ADN polimerasa termoestable
Instrumentación
 Automatización de los procesos cíclicos de
temperatura-termociclador
 Cuba electroforesis
ETAPAS DE LA PCR
 Desnaturalización: Es preciso que las
moléculas de ADN molde se encuentren
en forma de cadena simple.
 Calentando a temp. de 90 a 95ºC p/q
produzca la rotura de los enlaces puente
de hidrogeno intercatenarios y la
separación de ambas cadenas.
 Hibridación:
 Se disminuye la temperatura de la
reacción entre 40- 60ºC p/q se pueda
producir la hibridación específica de los
cebadores a las secuencias
flanqueantes del fragmento que se
desea amplificar.
 Extensión: la ADN polim. termoresistente
incorpora nucleótidos en el extremo 3´ del
cebador utilizado como molde la cadena de
ADN previamente desnaturalizada.
La temp. suele ser de 72ºC ya que la “Taq
polimerasa” tiene máx. actividad.
 Al finalizar c/u de los ciclos el nro de copias
obtenidas se duplica y luego de 20 ciclos ya
tenemos aproximadamente 1 millón de copias
de c/u de las moléculas molde iniciales ADN.
PCR
 Esta técnica sirve, entre muchas otras posibilidades,
para detectar la presencia de ADN de genes
específicos de Trypanosoma cruzi en muestras de
sangre periférica de individuos con sospecha de
infección chagásica
Detección de ADN mini circular T.
cruzi en pacientes cardíacos crónicos
ambulatorios en diferentes hospitales
de El Salvador / Guatemala
Estudio realizado por : Dr. Gilberto Ascencio
Carmen Villagran de Tercero1, Rafael Cedillos 2, Salomón Campos
2, Verónica Pérez 2, Ramón Rivera2, Norma Marroquin 1 and Inger
Ljunström 3
Introducción
 La enf. de Chagas, es considerada por la
OMS, como uno de los ppales problemas
sanitarios en Centro y Sud América.
 16-18 millones de personas están
infectadas por T. cruzi, y el 25 % de la
población de América vive con el riesgo de
ser infectada, debido a las malas
condiciones de vida y a la presencia del
vector.
DISTRIBUCION
GEOGRAFICA DE
LA ENFERMEDAD
DE CHAGAS
En rojo
Vector de la
enfermedad de chagas
Familia reduviidae
Insectos hematófagos
Transmiten al parasito
por medio de las heces
Trypanosoma cruzi
Agente causal de la
enfermedad de chagas
Fase sanguínea
tripomastigota
El parásito forma
poblaciones muy
heterogéneas con un
comportamiento
clonal, que dan origen
a diversas cepas en
distintas zonas
geográficas.
El parásito
 Existen dos genotipos o linajes de T. cruzi, llamados T.
cruzi I y T. cruzi II c/subgrupos IIa, IIb, IIc, IId y IIe.
 El linaje I se asocia a los ciclos de transmisión selvática
y que al parecer son los genotipos que se encuentran en
México; mientras que el linaje II se asocia a los ciclos de
transmisión doméstica donde el humano se ve
seriamente involucrado.
 El diagnóstico de la enfermedad en fase
indeterminada y crónica, se establece por mét.
serológicos y por xenodiagnóstico, debido a la
poca cantidad de parásitos circulantes.
 La PCR ha sido propuesta como una alternativa
en el diagnóstico por la capacidad de detectar
muy pequeñas cantidades de DNA parasitario
PCR DETECTA
PEQUEÑAS CANTIDADES
DE ADN DEL PARASITO Y
LUEGO MULTIPLICA POR
MILLONES DE VECES
PARA HACER VISIBLE LA
REACCION. SE HACE EN
UN EQUIPO ESPECIAL
LLAMADO
TERMOCICLADOR.
PCR ventajas:
- puede diferenciar infec. por otros hemoflagelados
- no depende de estado inmunológico del paciente
(como lo es la detección de Ac)
-es muy sensible en pacientes en et. crónica de la
enfermedad,
-también es útil para el diagn. de enf. congénita.
 El kinetoplasto, es una masa de ADN circular
dentro de una gran mitocondria que contiene
numerosas copias del genoma mitocondrial.
Sólo se encuentran en los org. de la clase
Kinetoplastidea.
ADN mini circular T.cruzi
 Los minicirculos de kDNA , son punto clave e ideal
para la amplificación, debido a que están en un alto
nro de copias ( 10-20.000 copias por parásito).
Además k ADN es altamente específico para T.
cruzi.
 Otros parásitos como Leishmania y T. brucei NO
son amplificados y T. rangeli, es amplif. pero
produce bandas de dif. tamaños que las de T. cruzi.
Objetivo:
 Demostrar la utilidad de PCR del DNA del
minicirculo de T. cruzi en muestras
sanguíneas tomadas y conservadas a
temperatura ambiente, en 110 pacientes
adultos con diagnóstico de enfermedad
de
Chagas
en
fase
crónica
e
indeterminada.
Población
 110
personas adultas de las mismas áreas
endémicas con serología negativa para enfermedad.
 71 pacientes adultos en fase indeterminada
 39 con diagnóstico de fase crónica de enfermedad
 El diagnóstico, se estableció en el banco de sangre
de los hospitales y en la comunidad.
 Los pacientes con enf. crónica, fueron diagnost. en
los servicios de cardiología de los hospitales.
SEROLOGIA DE LA POBLACIÓN DE LAS ÁREAS
ENDÉMICAS ESTUDIADAS
AREA
PROCEDENCIA
SEROLOGIA
CASOS
EN
TOTAL
NEGATIVA
POSITIVA
BANCO
DE
SANGRE
Y
COMUNIDAD
CUILAPA
GUATE.
144
134
10
JUTIAPA
NATIONAL
HOSPITAL
JUTIAPA
GUATE.
220
170
50
ROSALES
HOSPITAL
EL
SALVADOR
280
230
50
644
534
110
HALLAZGOS CLINICOS DE LOS 39 PACIENTES EN FASE
CRONICA DE
LA ENFERMEDAD DE CHAGAS
Cardiomegalia
Bloqueo
derecha
de
20
rama
Arritmia
Bloqueo
ventricular
16
2
auriculo
4
Fibrilación
1
Hipertrofia ventricular
6
Taquicardia
7
Resultados de PCR en controles
seronegativos
Estado
clínico
Serología
negativa
PCR
negativo
PCR
positiva
No
síntomas
110
108
2
Total
110
108
2
Resultados de PCR en pac. en
fase indeterminada y crónica
Estado
clínico
Serología
negativa
Serología
positiva
PCR
positiva
No
síntomas
0
71
68
Pacientes
cardíacos
0
39
39
Total
0
110
107
T. rangeli
1
2
3
4
5
6
7
MW
t. cruzi
235mw
1 T. cruzi control + ,
2 and 3: pacientes cardíacos ag. Serol +,
4: T. rangeli control +,
5 y 6 pacientes Serol +,
7: control negativo y 8 : MW
PCR en pacientes en fase
crónica:
235
Discusión
 Se encontró la característica banda de 235
bp en los pacientes fase indeterminada y
cardíacos crónicos
 Se encontró una banda de > tamaño que es
el resultado de amplificar dos regiones
variables del minicirculo de T.cruzi ya que
este minicirculo tiene 4 regiones
conservadas alrededor, donde los primers
pueden combinarse, probablemente se
obtuvo ¼ del minicirculo o probablemente
la mitad.
Discusión
 Encontramos tres pacientes con
serología + que NO presentaron
banda de 235 bp, probabl. x reacción
serológica cruzada con otros
parásitos.
 Se detectaron 2 casos + para PCR y
con serología -, puede deberse a falta
de produc. de Ac específicos anti T.
cruzi.
CONCLUSIONES
 La toma y conservación de M sanguíneas
para PCR es de utilidad y puede ser aplicada
en condiciones de trabajo de campo en la
comunidad.
 Los Primers TC1 TC2 amplifican en forma
específica secuencias de DNA de minicirculo
de T. cruzi.
Estudio Internacional para
Evaluar distintas metodologías
para Detección de ADN de T.
cruzi en muestras sanguíneas

International Study to Evaluate PCR Methods for Detection of
Trypanosoma cruzi DNA in Blood Samples from Chagas Disease
Patients
 Alejandro G. Schijman. Instituto de Investigaciones en Ingeniería Genética y
Biología Molecular (INGEBI-CONICET),

www.plosntds.org 2 January 2011 | Volume 5 | Issue 1 | e931
 El diagnóstico de la enf. de Chagas en
las mujeres durante el embarazo se
realiza de manera eficaz mediante técn.
Inmunológicas.
 S/E hasta el momento no se conoce
cómo evitar que algunos bebes se
contagien la infección por vía
transplacentaria c/ las consecuencias
que esto trae.
 “Existe un tratam. eficaz para los bebés con Chagas
congénito, pero cuando falla el diagnostico, la infecc.
evoluciona a la et. crónica c/riesgo de compromiso
cardíaco y digestivo a lo largo de su vida”.
 “La conducta durante el embarazo es, en general,
expectante, realizándose el tratamiento al RN una
vez que el diagnóstico de la enfermedad da positivo.
 S/e es preciso seguir investigando cómo se comporta
la infecc. dte el embarazo a fin de diseñar estrategias
para evitar el Chagas Congénito.
 Aún no se sabe fehacientemente por qué en
algunos casos los bebés nacen sin el
Trypanosoma cruzi pese a que sus madres
están infectadas con ese parásito.
-La posibilidad de contagio podría depender de
“factores relacionados con la carga parasitaria
o la cepa del parásito que causa la infección.
(A > carga parasitaria en sangre periférica la
madre, > probabilidad de contagiar a su bebé).
- Tb tendrían cierto peso las carácter. genéticas e
inmunológicas de la mujer embarazada.
Son varias las preguntas que se intentan
responder a través de estudios científicos.
 Una estrategia de prevención es
diagnosticar la infección en niñas o mujeres
jóvenes, para que realicen su tratamiento y
de esta manera, lograr disminuir la
posibilidad de transmisión, en el caso que
esa mujer se embarace.
Objetivos del presente trabajo:
 Elaborar un protocolo estandarizado de la técnica
de PCR
 Schijman coordinó un estudio en el que
participaron 26 laboratorios de 16 países
(Argentina, Brasil, Chile, Colombia, Estados
Unidos y Holanda, entre otros) c/ fin de
seleccionar los mejores proced. de diagnóstico
 P/ evaluar las distintas técnicas disponibles de PCR
p/enf. de Chagas, Schijman diseñó, un estudio ciego c/
distintos paneles de M conteniendo:
- diluciones seriadas de ADN de cepas de T. cruzi
pertenecientes a distintos linajes filogenéticos,
-M de sangre no infectada inoculada con parásitos
cultivados in vitro
- M de pacientes infectados con T. cruzi
- M de individuos no infectados
Todas la M obtenidas por consentimiento informado y enviadas a los lab.
participantes.
 Los grupos participantes debían informar los
resultados usando sus propios métodos y
controles de calidad.
 Se informaron 48 mét. distintos de los que
finalmente se eligieron los 4 mejores en base a
los resultados de sensibilidad y especificidad.
 Estos lab. debieron dar conocer sus proced.
experimentales p/ser transferidos a todos los
participantes y desarrollar así:…
 un procedimiento operativo estándar
consensuado, definiendo así: un
protocolo único y estandarizado de
diagnóstico molecular
 El estudio, publicado en
la revista científica PLoS
Neglected Tropical
Diseases, fue
coordinado por el Dr.
Schijman y la OMS.
 Por su relevancia el trabajo publicado en la
revista PLoS Neglected Tropical Diseases ha
sido considerado dentro del 2 % de los
trabajos más destacados de un total de 1500
estudios del área de investigación biológica y
clínica publicados a lo largo de un mes en
destacadas revistas científicas.
 El desarrollo de nuevas drogas terapéuticas
para la enf. de Chagas exige que se cuente
con un método indicador de respuesta al
tratamiento.
 Para lograr este propósito es crucial disponer
de un proced. operativo estandarizado de
diagnóstico p/ poder comparar y validar
resultados de ensayos clínicos.
 El procedimiento de PCR tiene niveles variables de
-
-
sensibilidad y especificidad dependiendo de
numerosos factores tales como:
vol. de M recolectada,
cond. de conservación,
mét. utilizados para aislamiento de DNA,
las secuencias del parásito y
los primers seleccionados,
los react. usados
condic. del termociclado etc
 La variabilidad en la sensibilidad de la
PCR podría ser explicada por la
presencia intermitente y cantidad
circulante variable de parásitos en el
momento de la extracción de sangre.
 Debido al gran número de falsos negativos
(por interferencias de sust. que inhiben la
PCR) se realizaron diferentes estrategias
para la detección del ADN de T. Cruzi que
incluyeron controles de DNA purificados de
cultivos de referencia q se utilizaron para
spikear las muestras.
PCR procedimiento standarizado
 Amplificación de una secuencia de los mini círculos del




ADN del kinetoplasto (ADNk)
1.4 kb organizados en 4 segmentos, cada uno consta de
una región corta altamente conservada y una larga con
alta variabilidad de secuencia
Los primers utilizados anillan en las regiones
conservadas, amplificando regiones variables
comprendidas entre ellos.
Generan un producto de 330 pb
Previamente liberar minicirculos calentando a 100ºC
Optimización de la detección de
Trypanosoma cruzi mediante PCR
 Objetivos Generales:

Poner a punto la detec. por PCR de T. cruzi en
sangre de recién nacidos hijos de madres
seropositivas para Chagas.
 Objetivos específicos:


Estandarizar la detección de T. cruzi mediante PCR
utilizando protocolos ya publicados que detectan el
kDNA del parásito.
Determinar el límite de detección de la metodología.
Obtención de ADN de sangre
entera
 No utilizar heparina – si EDTA
 Sangre + solución de lisis
 Hervir (desarmado de los mini círculos)
 Extracción con Fenol: cloroformo: isoamilico
 Resuspender
 Conservar a – 20 °C
Áreas y flujo de trabajo
Área 1: pre-armado de la reacción de
PCR.
En esta área se mezclarán los
componentes de la mezcla de PCR,
excluyendo las muestras a analizar. En esta
área no deberán ingresar instrumentos ni
insumos provenientes de las otras áreas.
Área 2: extracción y preparación
de muestras de ADN.
La extracción, cuantificación y
análisis del ADN a utilizar como
templado en las reacciones de PCR
se realizarán en esta área.
Área 3: PCR y análisis de amplicones.
En esta área se llevará a cabo la reacción de
PCR y se analizarán los productos mediante
electroforesis en geles de agarosa.
PCR
 Se amplificará mediante PCR la secuencia
variable del kDNA de T. cruzi, utilizando los
siguientes oligonucleótidos:
 121: AAATAATGTACGGGKGAGATGCATGA
 122: GGTTCGATTGGGGTTGGTGTAATATA
Templado
 Se utilizará ADN de T. cruzi previamente
cuantificado, a partir del cual se realizarán
diluciones seriadas.
 ADN k 1ng/ul
Protocolo de PCR
 Se optimizarán diferentes condiciones
 Concentración de Mg+2,
 Temperatura de annealing,
 Polimerasa utilizada.
Cálculo del límite de detección
(LD) de la técnica
 Se utilizará diluciones seriadas del ADN de T.
cruzi purificado y cuantificado.
 Repetir 5 veces en 5 días diferentes.
 La menor cantidad de DNA detectado
reproduciblemente en los 5 ensayos será el LD
de la técnica.
Protocolo utilizado
Temperature
Time
4ºC
94 ºC
94 ºC
68 ºC
72 ºC
94 ºC
64 ºC
72 ºC
72 ºC
4 ºC
3 minutos
3 minutes
1 minute
1 minute
1 minute
45 second
5 cycles
45 second
45 second
10 minutes
Hold
35 cycles
P/c/ciclo se requieren 3
temp diferentes:
-desnaturalización del
duplex de DNA (94oC)
-Annealing: de U de los
primers a los extr. de la
región a amplificar (68oC) en
hebras complementarias.
-Polimerización: Temp que
requiere la Taq p/elongar los
fragmentos amplificados
(72oC)
Componentes de la Mix
 Mix p/1x30:
30ul







12,7 ul
3 ul
3,6 ul
1,5 ul
1,5 ul
1,5 ul
1,2 ul
H2O:
Buffer (10x) Taq:
MgCl2 (25mM):
dNTPs (5mM):
Primer 121 (50pmol/ml):
Primer 122 (50pmol/ml):
Taq (0,8ul/20ul):
TOTAL: 25 ul (1x25ul)
25ul mix + 5 ul (muestra)
Termociclador
Análisis de productos
 Electroforesis en geles de agarosa 1,5%
 Teñidos con GelRed.
 Loading Buffer
 Marcador de peso molecular
 Voltaje y tiempo de corrida
Preparación del gel de
Agarosa
Cuba electroforética
 DNA k 0,2 ng/ul
(1ng/5ul)
 DNA k 2 pg/ul
(10pg/5ul)
 DNA k 20 fg/ul
(100fg/5ul)
 H2O
Gracias
Por su
atención!!!!!!!!!!!!