Download QUE ES EL ADN???

BIOLOGIA MOLECULAR
APLICADA AL LABORATORIO
DE MICROBIOLOGIA
Dra Daniela Centrón
Depto de Microbiología, Parasitología e Inmunología
de la Facultad de Medicina
de la Universidad de Buenos Aires
CONICET
Que es la biología molecular?
• Estudio de la biología a nivel molecular
Se superpone con áreas de
la biología y la química, en
particular genética y
bioquímica
• Estudio de los procesos celulares
De la genética clásica a la biología molecular
al diagnóstico especializado……
CONTENIDOS
I. CONCEPTOS BASICOS INTRODUCTORIOS
A. Biosíntesis de ácidos nucleicos: replicación, transcripción.
B. Biosíntesis de proteínas: traducción.
C. Marcos de lectura abiertos. Operones y regulones.
II. TECNOLOGIA DEL ADN RECOMBINANTE
A. Enzimas utilizadas en biología molecular.
B. Vectores de clonado y de expresión.
C. Construcción de bibliotecas genómicas.
III. CONCEPTOS BASICOS DE GENETICA MICROBIANA
A. Mutaciones y mutantes.
B. Elementos extracromosómicos. Plásmidos.
C. Adquisición de material genético exógeno.
IV. METODOLOGIAS BASADAS EN LA IDENTIFICACION
DE SECUENCIAS DE A. NUCLEICOS
A. Reacción en cadena de la polimerasa (PCR).
B. Hibridización de ácidos nucleicos.
C. Epidemiología molecular bacteriana.
D. ADN ramificado (branched DNA).
E. Secuenciación de ácidos nucleicos.
V. DIAGNOSTICO MOLECULAR DE AGENTES
ETIOLOGICOS MICROBIANOS
A. Bacterias
B. Virus
C. Hongos
D. Mecanismos de resistencia a antibióticos
VI. SEMINARIOS DE INTEGRACION
CRONOLOGÍA
Genética AM
y DM
Mendel 1866
GENÉTICA AM
 Las partículas de la herencia se
mezclaban
 Un parental aporta más que el otro
 Herencia de caracteres adquiridos
MENDEL Y LOS “FACTORES”
DE LA HERENCIA
GENÉTICA DM
LA GENÉTICA Y
LOS GENES......
ADN o PROTEÍNAS?
….en busca del material hereditario….
Que características debería presentar
el material hereditario?
 Perpetuarse (replicarse)
 Manifestarse (expresarse)
 Cambiar (mutar)
 Combinarse (recombinarse)
1902-Theodore Boveri- William Sutton
1865
Establecen la hipótesis según la cual los cromosomas,
segregados de modo mendeliano,
son unidades hereditarias.
1865
1915 - T.H. Morgan
Los genes se
disponían
linealmente en el
cromosoma
Se comienza a hablar de genética.....
1865
1928 - Frederick Griffith
Colonias “Rugosas”
Colonias “Lisas”
Transformación de
Streptococcus pneumoniae
Células L
vivas
Bacteria
Inyección
Resultados
Células L
Células R muertas por
vivas
calor
cápsula
Células L muertas por
calor junto a celular R
vivas
“factor de
transformación”
1865
1944 - Avery, MacLeod & McCarty
El ADN purificado es “el factor de transformación”
El ADN de las células lisas
transformaba a las rugosas
Oswald Avery
Colin MacLeod
Maclyn McCarty
Su teoría fue rechazada por dos razones:
De ser así cada especie debería tener un tipo diferente de ADN
La composición química del ADN era demasiado simple para
contener toda la información para la vida
1865
1952 - Hershey & Chase
El ADN viral (no las proteínas) programa
las células
Martha Chase & Alfred Hershey
Bacteriófagos
… “los genes se componen de ADN, base
química de la herencia”…
LA ESTRUCTURA DEL ADN...
1947 - Erwin Chargoff
1865
Las bases de ADN siguen
ciertas reglas
 La composición es especie
específica
 A = T, C = G en todas las especies
AT
GC
1865
1953 - Franklin & Wilkins
La naturaleza helicoidal del ADN
Rosalind Franklin
Film
fotográfico
Fuente de rayos X
DNA cristalizado
Maurice Wilkins
1865
1953 - Watson & Crick
Descripción de la estructura tridimensional
del ADN
Francis Crick & James Watson
1865
1953 - Watson & Crick
Que dedujeron de:
Datos de R. Franklin
• hélice doble
• ancho uniforme de 2 nm
• bases separadas por 0.34 nm
Chargoff
• la adenina se aparea con la
timina
• la citocina se aparea con la
guanina
1865
1953 - Watson & Crick
Que dedujeron ellos
mismos?
• Las bases están hacia adentro,
y los fosfatos y las azúcares
hacia afuera
• Enlaces de hidrógeno
• Hebras antiparalelas
• Sugirieron un modo semiconservativo de replicación
ESTRUCTURA DEL ADN
... 2 de abril de 1953,
Molecular Structure
of Nucleic Acids.
A Structure for Deoxyribose
Nucleic Acid.
Nature 171: 737.
No más de 900 palabras…..
J. D. WATSON and F. H. C. CRICK
QUE ES EL ADN???
POLÍMERO LARGO,
NO RAMIFICADO,
COMPUESTO POR
CUATRO TIPOS
DE SUBUNIDADES
Bases nitrogenadas
Se combinan con
azúcares y fosfatos
DESOXIRIBONUCLEÓTIDOS
Nucleótido=base+azúcar+fosfato
Nucleósido=base+azúcar
MONÓMERO
Del nucleótido al ADN
5´
ENLACE FOSFODIESTER ENTRE
EL CARBONO 5´ DE UNA
DESOXIRRIBOSA CON EL GRUPO
FOSFATO DEL SIGUIENTE
NUCLEÓTIDO FORMANDO UN
NUCLEÓTIDO MONOFOSFATO.
EL POLÍMERO SE FORMA AL
ENLAZAR LOS FOSFATOS AL 3´
DEL OTRO NUCLEÓTIDO
DIRECCIÓN
(5´a 3´)
5´
Estructura estabilizada por
puentes hidrógeno
•Doble hebra
5´
•Antiparalela
3´
5´
3´
ESTRUCTURA PRIMARIA
Apareamiento:
A-T
G-C
Polímero uniforme
10 bases por
vuelta
Surco menor
Surco mayor
ESTRUCTURA SECUNDARIA
REGION
REGULATORIA
Codón de iniciación
Codón de terminación
1865
ADN en Procariotas
ESTRUCTURA
TERCIARIA
Cromosoma bacteriano
ADN doble cadena (1mm long)
circular
cerrado
Condensado y ordenado (“supercoiled” o superenrollado)
1865
•
•
•
•
•
Plásmidos en Procariotas
Tamaño de 1 a 400Kb
Cantidad variable de copias en una célula
Origen de replicación propio
Pueden movilizarse a otros genomas
Puede integrarse al cromosoma bacteriano
1865
ADN en Eucariotas
•1 o más cromosomas de ADN (hasta 1200 en helechos)
•Localizado en núcleo
•Empaquetado por histonas y otras proteínas cromatina
Moléculas de ADN en mitocondrias y cloroplastos
1865
Replicación del ADN
Semiconservativa:
dos hebras generan una copia cada
una
1865
Iniciación
comienza siempre en una secuencia específica de nucleótidos
conocida como origen de replicación,
en el que hay un gran contenido de adenina y timina.
Iniciación
1865
iniciador
Síntesis de primers
de ARN
Iniciación de la
replicación
Unión de
iniciador
Horquillas se mueven en
dirección opuesta
Formación de
dos hebras de
replicación
ADN circulares
(Procariotas)
Origen de replicación (oriC)
ADN lineales
(Eucariotas)
Varios replicones
Elongación
1865
ADN primasa
ARN primer
ADN polimerasa
III
ADN ligasa
Hebra
retrasada
Frag. de Okazaki
Hebra líder
Topoisomerasa
ADN polimerasa III
Helicasa
Proteínas de unión al ADNss
La ADN polimerasa sintetiza las nuevas cadenas, complementarias a cada
una de las cadenas primitivas, en sentido 5´ → 3´ partiendo de un ARN corto
específico llamado ARN cebador –molécula formada por nucleótidos de ARN
catalizados por ARN primasas- que determina el punto por donde la ADN polimerasa
comienza a añadir nucleótidos.
“Proof-reading”
DNA polimerasa comete un error cada 108 – 1010 bases
Incorporación de G X A
Pol III escinde G con actividad
exonucleasa 3´ a 5´
Incorporación de A
1865
Terminación
Fragmentos de Okazaki
Ligasa
Cuando una ADN polimerasa hace contacto con el extremo de otro fragmento
de Okazaki contiguo, el ARN cebador de este es eliminado y otra enzima, la ADN ligasa,
conecta los dos fragmentos de Okazaki de ADN recién sintetizado, catalizando
las reacciones de condensación que unen los grupos fosfato y azúcar de los
nucleótidos contiguos y así, una vez unidos todos los fragmentos de Okazaki
se completa la doble hélice de ADN.
1865
1957 - Francis Crick
Propuso el dogma central
ADN
ARN
PROTEINAS
Transferencia de información
biológica
1865
El ADN y el ARN
•Ácidos nucleicos
•Macromoléculas
•Polímeros (monómero de nucleótidos)
•Uniones fosfodiéster
•Moléculas más grandes que se conocen.
Diferencias entre la química del ADN y el ARN
1865
 El ARN tiene como carbohidrato a la ribosa
en lugar de la desoxirribosa.
 El ARN tiene como base el uracilo en lugar
de la timina.
Una célula típica contiene 10 veces más ARN que ADN.
 El ARN no es una doble cadena excepto en algunos virus.
1865
Estructura del ARN
1865
Tipos de ARN según sus funciones
Componente principal del ribosoma
•Decodifica el ARNm para sintetizar las proteínas
•Interacciona con ARNt durante la traducción
•En Procariotas, dos subunidades principales 30Sy 50S
•En Eucariotas, 40S y 60
ARNr
(ribosomal)
1865
Tipos de ARN según sus funciones
ARNt
(de transferencia)
aa
•Encargados de transportar los aminoácidos a los ribosomas
para incorporarlos a las proteínas, durante el proceso de
síntesis proteica.
•Decodificación mediante apareamiento con el codón del
ARNm
anticodón
1865
Tipos de ARN según sus funciones
ARNnc o ARN no codificante: ARN funcional que no codifica para síntesis proteica
(ARNr y ARNt)
ARN corto de interferencia (siARN: del inglés: small interfering RNA ): son
componentes de una gran respuesta antiviral denominada interferencia del ARN
involucrados en la regulación.
Ribo-llaves (ribo-switches): son formas de ARN que actúan como llaves "encendidoapagado" de gran precisión.
ARN catalíticos o ribozimas: ARN con estructura secundaria que le confiere a la
molécula propiedades catalíticas como corte de ARN o ADN y ligación.
El ARN posiblemente
fue el primer biopolímero
que apareció en la corteza terrestre
durante el transcurso de la evolución.
Como se leen los ARNm??
1961- Nirenberg y Ochoa
1865
Sistema libre de células
UUUUUUUU
AAAAAAAA
CCCCCCCC
GGGGGGG
fenilalanina
lisina
prolina
glicina
El código genético
43=64
ARNm
Demostraron que hay 61 tripletes -o codonesque codifican aminoácidos,
muchos de los cuales son codificados por más de un codón,
por lo que se dice que el código está degenerado.
y los tres restantes no son codificantes sino que son utilizados
como señales de terminación.
1865
TRANSCRIPCIÓN
ADN
ARN
PROTEINAS
Requerimientos:
 Cadena de ADN
como matriz
 ARN polimerasa
 Ribonucleósidos
trifosfatos
 Región promotora
TRANSCRIPCION
ARN polimerasa
Principio de un gen
ADN
Iniciación
La ARN polimerasa junto a factores de transcripción se une a sitio donde
va a iniciar la transcripción
Promotor
En bacterias
•Dos regiones conservadas en el ADN (-10 y -35) que son
reconocidas por factor sigma.
•ARN polimerasa luego se une y sintetiza ARN de 5´ a 3´
•Un promotor expresa varios genes (OPERÓN)
Promotor en Eucariotas
•Región promotora
•Involucra varios
factores de
transcripción
(proteínas)
•Cada gen tiene su
promotor
TRANSCRIPCION
Hebra antisentido
Dirección de la transcripción
3´del gen
5´del gen
5´del ARNm
3´ del ARNm
Hebra sentido:
contiene la información
genética
Hebra antisentido:
provee el molde para
la síntesis del ARNm
ARNm
Elongación
Una cadena de ARN se une por apareamiento de bases a la cadena de ADN
y la ARN polimerasa es la encargada del enlace fosfodiéster.
TRANSCRIPCIÓN
La ARN polimerasa
deja el ADN
ARN mensajero liberado
El ADN se aparea nuevamente
Terminación
Desestabilización del
complejo
ARN-ADN
•Rho-independiente (Secuencias palindrómicas del ADN que en
estadio de ARN adopta una estructura en horquilla)
•Rho-dependiente (mediada por la proteína)
1865
TRANSDUCCIÓN
ADN
El nombre proteína proviene
de la palabra griega proteios,
que significa lo primero.
ARN
PROTEÍNAS
Las proteínas son macromoléculas
formadas por aminoácidos
TRADUCCION
ARNt
Sitio de unión
al aminoácido
Uniones hidrógeno entre
pares de bases
Iniciación
La iniciación procariótica es el resultado de la asociación de las subunidades pequeña
y grande del ribosoma y el acoplamiento del primer aminoacil-ARNt (fmet-ARNt)
con el codón de iniciación mediante el emparejamiento de bases anticodón-codón.
TRADUCCION
Elongación
La elongación de la cadena polipeptídica
consiste en la adición de aminoácidos al extremo carboxilo de la cadena.
TRADUCCION
Continua la elongación
Polipéptido
Creciente
Este proceso continua hasta
que llega a un codón stop
TRADUCCION
Nueva proteína sintetizada
Carboxilo terminal
Amino terminal
Terminación
La terminación ocurre cuando se llega a uno de los tres codones de terminación
del ARNm, que no son reconocidos por ningún ARNt.
QUÉ ES UN GEN ?
Un segmento de ADN que contribuye a un
fenotipo/función. En ausencia de una función
demostrable, un gen puede ser caracterizado por
secuencia, transcripción u homología.
Human Gene Nomenclature Committee
En Procariotas.....
Operón
Transcripción policistrónica (ARNm de varios genes)
En Eucariontes...
REGION
REGULATORIA
+1
EXONES
FIN
TRANSCRIPCION
INTRONES
Un promotor para cada gen
LA DECADA DE LOS
70
1865
1970 - Smith & Nathans
Descubrimiento de las enzimas de restricción
Hamilton Smith
• Descubrió HindII en
Haemophilus influenzae
Daniel Nathans
• Utilizó HindII para hacer el
primer mapa de restricción del
SV40
1972 - Paul Berg
1865
El primer ADN recombinante utilizando EcoRI
Sitios de reconocimientoEcoRI
DNA
plasmidico
EcoRI corta el DNA en
fragmentos
Extremos
pegajosos
DNA
recombinante
SV40 DNA
DNA ligasa
1865
1973 - Boyer, Cohen & Chang
Transformación de E. coli con plásmidos
Gen resistente a la canamicina
recombinantes
Plasmid
pSC101
Gen resistente a
la tetraciclina
Stanley Cohen &
Annie Chan
Medio con canamicina y tetraciclina
E. coli
transformada
con plásmidos
recombinantes
Sólo crecen colonias recombiantes
Herbert Boyer
1865
1977 - Genentech, Inc.
La primera proteína humana producida por una
bacteria transgénica (somatostatina)
• Compañía fundada por
Herbert Boyer y Robert
Swanson en 1976
• Considerada el
advenimiento de la edad de
la biotecnología
LA DECADA DE LOS
80
1865
1980
• La suprema corte de U.S. permite patentar formas de
vida
1985
• Se prueban plantas modificadas genéticamente
En 1988 el National Center for Biotechnology
Information (NCBI) y el GenBank
Margaret Dayhoff
LA DECADA DE LOS
90
1865
LOS 90: GENOMAS Y CLONES
1995
• primer genoma: Haemophilus influenzae.
1996
• Genoma de Saccharomyces cerevisiae
•1997
• Se clona Dolly
1998
• Genoma de C. elegans
COMO FUNCIONA UN GENOMA?
GENÓMICA Y PROTEÓMICA
26 de junio del 2000: se concluyó
el proyecto del GENOMA HUMANO,
en el cual se invirtió más de 3.000 millones de dólares…..
EL
FUTURO......
Genómica y sociedad
Genómica y salud
Genómica biológica
MUCHAS GRACIAS!!!!!!!!!!!
dcentron@gmail.com