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Concepto de Terapia Génica
•
Es la introducción de material exógeno (natural o
recombinante) en humanos para corregir deficiencias
celulares expresadas en el nivel fenotípico.
•
Es una estrategia terapéutica basada en la modificación del
repertorio genético de células somáticas mediante la
administración de ácidos nucleicos y destinada a curar tanto
enfermedades de origen hereditario como adquirido.
•
Es la transferencia de material genético nuevo a células de un
individuo dando lugar a un beneficio terapéutico para el
mismo.
Objetivo de la Terapia Génica
• El principal objetivo de la terapia génica es erradicar o mejorar
los síntomas de distintos tipos de enfermedades en las cuales no
se han obtenido resultados satisfactorios aplicando terapias
tradicionales.
• Todas estas enfermedades podrían ser potencialmente tratadas
por terapia génica, pero siguiendo diferentes estrategias:
- Enfermedades Infecciosas (producidas por virus o bacterias patógenas)
- Cáncer
- Enfermedades Heredadas (deficiencia genética estructural de un producto
génico o de sus niveles de expresión)
- Enfermedades del Sistema Inmune (Alergias, inflamación y enfermedades
autoinmunes)
Tipos de terapia génica
Según la estirpe celular
Somática
Germinal
Células diploides
Células haploides
Ideal para enfermedades genéticas hereditarias
Bioética (abuso y eugenesia)
Uso en biotecnología (animales transgénicos)
Largo plazo
Sin consecuencias evolutivas
TRANSFERENCIA GÉNICA
1) Genes integrados al genoma humano
2) Episomas
MÉTODOS DE TRANSFERENCIA GÉNICA
• Inyección directa de ADN “desnudo”
• Métodos químicos: DEAE-dextrán, precipitación con
fosfato cálcico
• Métodos
físicos:
Bombardeo
de
partículas,
Electroporación,
Sonoporación,
Magnetofección,
Transferencia Génica Hidrodinámica
• Vectores: Virales, liposomas, polímeros
NATURALEZA DEL ENFOQUE
TERAPÉUTICO
1. AUSENCIA DE
EXPRESIÓN PROTEICA
2. EXPRESIÓN PROTEICA
CON PÉRDIDA DE
FUNCIÓN
3. EXPRESIÓN PROTEICA
CON GANANCIA DE
FUNCIÓN
A. CORRECCIÓN DIRECTA
DE LA MUTACIÓN
ENFERMEDADES
HEREDITARIAS
MONOGÉNICAS
B. SUPLEMENTACIÓN
GÉNICA
ENFERMEDADES
POLIGÉNICAS NO
HEREDITARIAS
C. SILENCIAMIENTO
GÉNICO
NATURALEZA DEL ENFOQUE
TERAPÉUTICO
A. CORRECCIÓN DIRECTA
DE LA MUTACIÓN
- QUIMERAPLASTOS
- NUCLEASAS CON DEDOS
DE ZINC
B. SUPLEMENTACIÓN
GÉNICA
VECTORES
(VIRALES Y NO VIRALES)
C. SILENCIAMIENTO
GÉNICO
ARN DE INTERFERENCIA,
OLIGONUCLEÓTIDOS
ANTISENTIDO, ARNm
ANTISENTIDO, RIBOZIMAS
QUIMERAPLASTOS
OLIGONUCLEÓTIDOS ARN/ADN
ACTIVACIÓN DEL
SISTEMA DE
REPARACIÓN DE
ERRORES
EFICAZ EN SISTEMAS IN VITRO
EN ESTUDIOS IN VIVO NO HA SIDO AÚN PROBADO
QUIMERAPLASTOS
EFICAZ EN SISTEMAS IN VITRO
EN ESTUDIOS IN VIVO NO HA SIDO AÚN PROBADO
NUCLEASAS CON DEDOS DE ZINC
NUCLEASAS CON DEDOS DE ZINC
VECTORES
VIRALES
NO VIRALES
- ADENOVIRUS
- ADENOVIRUS
ASOCIADOS
- RETROVIRUS
- HERPESVIRUS
- VACCINIA
- LIPOSOMAS
- POLÍMEROS
Vectores virales
Ventajas
• Tecnología basada en la evolución
• Variedad de tropismos celulares disponibles
• Frecuencia de transducción robusta
• 2 tipos de virus: ADN y ARN
• Genes pueden ser llevados episomalmente o integrados en el
genoma
Desventajas
• Tecnología viral con evolución por infección y proliferación (no
benigno)
• Puede haber replicación de virus competentes
• Riesgos de recombinación con virus salvaje in vivo
• Oncogénesis
• Riesgo por respuesta inmune
Adenovirus
• Vector más usado
• Facilidad de infectar tejidos (principalmente del sistema
respiratorio)  90% seres humanos poseen anticuerpos 
Rápida degradación (24hs)
• No hay integración del gen en el genoma humano
• Bueno para células divisibles y no divisibles
• Produce altas concentraciones de proteína en células
mamíferas
• Administración: ex vivo o in situ
• Efectos adversos: Alta inmunogenicidad
Adenovirus
Inyección
del nuevo
gen en virus
Célula
humana
Tratamiento exitoso: síntesis de una
proteína funcional
Virus Adeno-asociados
•
•
•
•
•
•
Amplio espectro de células
Puede infectar células divisibles y no divisibles
Infección latente  Expresión a largo plazo de gen
Buena relación de bioseguridad  no patógenas
No estimulan la respuesta inmune
Se encuentran en células infectadas con adenovirus (helper)
Infección productiva
• Integración altamente específica (en un solo lugar) con baja
frecuencia
• Administración: ex vivo
Virus Adeno-asociados
Limitación: baja capacidad de empaquetamiento (en
resolución)
Fase I de terapia génica: fibrosis quística, hemofilia B
Considerado para: hemofilia A, deficiencia de g antitripsina y
amaurosis congénita de Leber
Tratamiento para infarto del miocardio
cirrosis y tumores pancreáticos o
de colon
Alfavirus
• Infectan células divisibles y
no divisibles.
• Amplio espectro de células.
• No se integran al genoma
humano.
• Infección transitoria.
• Efectos adversos:
Apoptosis.
IDEAL PARA LA
TERAPIA GÉNICA
DEL CÁNCER
Herpesvirus
• Infectan células divisibles y no
divisibles.
• Tiene tropismo por las células del
sistema nervioso.
• No se integran al genoma humano.
• Infección latente y prolongada.
• Alta capacidad de empaquetamiento
(20kb)
• Efectos adversos: respuesta inmune.
Herpesvirus en la terapia génica
del cáncer: terapia «suicida»
Gen suicida: Timidino quinasa (TK)
Prodroga no tóxica: Ganciclovir
Retrovirus
• Administración: ex vivo o in situ
• Se integran en células divisibles
• Efectos adversos: oncogénesis y
respuesta inmune.
Virus Vaccinia
• Infectan células divisibles y no
divisibles.
• No se integran al genoma humano.
• Infección transitoria muy eficiente.
• Efectos adversos: altamente
inmunogénico.
Obtención de virus Vaccinia
recombinante
RESUMEN
Adenovirus
Adenovirus
-asociado
Alfavirus
Herpesvirus
Retrovirus/
Lentivirus
Virus
vaccinia
Adenoviridae
Parvoviridae
Togaviridae
Herpesviridae
Retroviridae
Poxviridae
Genoma
DNA doble
cadena
DNA simple
cadena
RNA simple
cadena
DNA doble
cadena
RNA simple
cadena
DNA doble
cadena
Células
divisibles y
no divisibles
Células
divisibles y
no divisibles
Células
divisibles y no
divisibles
Células
divisibles*
Infección/ tropismo
Células
divisibles y no
divisibles
Células
divisibles y
no
divisibles
Interacción con el
genoma humano
Episomal
Integrado**
Episomal
Episomal
Integrado
Episomal
Expresión del
transgén
Transitorio
Puede ser
prolongado
Transitorio
Puede ser
prolongado
Prolongado
Transitorio
Capacidad de
empaquetamiento
7,5kb
4,5kb
7,5kb
>30kb
8kb
25kb
Familia
* Los lentivirus pueden también infectar células que no se dividen.
** Los adenovirus-asociados pueden integrarse en 95% de los casos a una región específica del
cromosoma 19.
Virus quiméricos o seudotipos
• Envoltura de los alfavirus + cápside de los retrovirus
• Combina lo mejor de los dos tipos de vectores:
- Infecta un amplio espectro de células (alfavirus)
- El transgén puede ser integrado al genoma humano (retrovirus)
Vectores no virales
Ventajas
• Pueden infectar cualquier tipo celular.
•No son tóxicos (en general).
•No generan efectos adversos.
•No tienen un límite máximo de ADN a transportar.
Desventajas
• Ingreso en la célula poco eficiente.
• Sólo para terapias ex vivo.
• No se integran al genoma humano.
Vectores no virales
LIPOSOMAS
POLÍMEROS
SILENCIAMIENTO GÉNICO
POST-TRANSCRIPCIONAL
Oligonucleótidos Antisentido
• Se une a pre-mRNA o mRNA
• Interfiere en el procesamiento (splicing, poliadenilación, exportación,
estabilidad) y en la traducción del RNAm
• Down-regulation: clivaje del ARNm por una RNAsa H o impide la traducción.
• Up-regulation: Por manipulación del sitio de splicing
• Desventaja La presencia de estructuras secundarias en el ARN que impide
que se una el oligonucleótido antisentido. Se requieren pruebas previas para
buscar regiones simple cadena.
• Efecto adverso Off-targeting
• ESTRATEGIA
1. Diseño del oligonucleótido antisentidos
2. Producción de la molécula por síntesis química
3. Incorporación a la célula blanco por liposomas o electroporación
4. Nueva generación de oligonucleótidos con modificaciones químicas que los
hacen más estables.
Oligonucleótidos Antisentido
DOWN-REGULATION
Oligonucleótidos Antisentido
UP-REGULATION
Restauración
del sitio de
splicing
Ribozimas
Pequeñas moléculas de RNA con actividad de endonucleasas
Catalizan la hidrólisis de enlaces fosfodiéster específicos
Fragmentos largos o cortos:
Largos  intrones del GII o GI
Cortos  hammerheads (40nt)
Debe conocerse la secuencia previamente
Iguales problemas que los oligos antisentidos
Ingresan mediante plásmidos o administrados exógenamente
Hammerheads sintéticos son más estables
Ribozimas
RNA de interferencia
- Sistema descubierto en la década de 1990s en
plantas y animales inferiores como mecanismo de
regulación de la expresión génica.
- Debido a su gran capacidad inhibitoria de la
expresión de proteínas, esta tecnología es
empleada en la terapia génica.
dsRNA
siRNA
RESUMEN DEL
MECANISMO
DE ACCIÓN DE
LOS siRNAs Y
miRNAs EN LA
NATURALEZA
RESUMEN DEL
MECANISMO DE
ACCIÓN DEL ARN
DE
INTERFERENCIA
EN LA
NATURALEZA
RNA de interferencia
ESTRATEGIA
• Diseño de siRNA (secuencias de nucelótidos probables)
• Producción de la molécula de siRNA:
a. Síntesis química
b. Transcripción in vitro
c. Clonado
• Incorporación a la célula blanco por:
a. Microinyección
b. Absorción
c. Inoculación
d. Bombardeo
e. Electroporación
f. Vectores virales
• Nueva generación de siRNA con modificaciones que los hacen más
estables (shRNA)
Diseño de un siRNA sintético
OLIGONUCLEÓTIDO ANTISENTIDO vs. RNAi
Oligonucleótido antisentido
RNA de interferencia
Efecto transitorio y regulable, por esto es más fisiológico que el knock down de
genes
Sistema eficaz y potente
Similares niveles de reducción de RNAm y proteínas
Off targeting (silenciamiento de un RNAm no deseado)
Up o down regulation
Down regulation
Incorporación a la célula blanco:
limitada por liposomas o
electroporación
Incorporación a la célula blanco: más
uniforme por vectores virales
1/20 molécula efectiva/testeadas
1/2 a 1/4 molécula efectiva/testeadas
Más barato
Más caro
No induce IFN
Puede inducir IFN
SILENCIAMIENTO GÉNICO
POST-TRADUCCIONAL
ADN o ARN simple cadena con
afinidad a una proteína o flia.
de proteínas para inihibir su
función
Systematic Evolution of Ligands by Exponential
Enrichment (SELEX)
¿Cuáles son los puntos para lograr una
terapia génica exitosa?
 TARGETING La terapia actúe sobre la célula blanco (y no otra)
 ACTIVAR el gen transferido
 INTEGRAR el gen transferido al genoma de las células blanco
(para tener un efecto más duradero)
 EVITAR efectos adversos dañinos