Download Dr. J. Domínguez

ALTERNATIVAS A LA
TUBERCULINA
Servei de
Microbiologia.
Hospital Universitari
Germans Trias i Pujol
Introducción
8 millones de nuevos casos cada año,
el 95% en paises en vías de desarrollo
2 millones de personas mueren anualmente
1/3 de la población mundial está infectada
Relación huésped-parásito
Llegada de M.tuberculosis a los alveolos
pulmonares donde es fagocitado por los
macrófagos alveolares.
El bacilo es capaz de multiplicarse en el
fagosoma y destruir posteriormente al
macrófago.
Los macrófagos segregan citocinas que atraen
neutrófilos, linfocitos y macrófagos para que
fagociten bacilos extracelulares, así como para
generar un foco inflamatorio.
Relación huésped-parásito
Los linfocitos T CD4 específicos se
transforman en linfocitos Th1 bajo la
influencia de IL-12 secretada por los
macrófagos.
Th1 segrega TNF-  que permiten la
llegada de más macrófagos, e IFN- que
activa a los que están infectados.
Relación huésped-parásito
Los linfocitos T también segregan IFN-
para activar macrófagos e IL-12 para que
proliferen Th1.
El macrófago sintetiza IL-12 que estimula
a las cél NK que también sintetizan IFN-.
Relación huésped-parásito
El IFN- es la citocina efectora clave en el
control de la infección micobacteriana
mediante la activación de los macrófagos.
IFN- es la citocina esencial en el
desarrollo de la inmunidad protectora
contra M. tuberculosis.
En combinación con TNF- consigue
unos efectos bactericidas del 90% de la
concentración bacilar en los tejidos.
Relación huésped-parásito
Sin embargo, mientras se desencadena
esta RI innata, los bacilos se van
diseminando hacia los nódulos linfáticos
regionales y los vasos sanguíneos.
La RI específica consta no tan sólo de la
proliferación de T CD4, sino también del
estímulo de una sensibilidad retardada
tipo IV (que se pone de manifiesto
mediante TST).
Relación huésped-parásito
En un 5% puede originarse una
enfermedad primaria.
Pero, en un 95% de los casos suele
resolverse el complejo primario, quedando
M. tuberculosis en estado latente.
En un 5% de estos casos, puede
originarse una enfermedad posprimaria de
reactivación durante toda la vida del
huésped.
Objetivos propuestos para
controlar la tuberculosis
Pautas antibióticas más cortas y con menos
efectos secundarios
Una vacuna eficaz y accesible a toda la
población
Métodos diagnósticos rápidos, sensibles y
específicos
Métodos diagnósticos
Un diagnóstico rápido y fiable de la
tuberculosis constituye un elemento
fundamental en las medidas de control de
la enfermedad.
Los métodos microbiológicos de
referencia en el diagnóstico de la TB
continúan siendo el examen microscópico,
cultivo y aislamiento de M. tuberculosis y
la detección de sus ácidos nucleicos.
Métodos diagnósticos
Se requiere de métodos diagnósticos
para la detección de pacientes con el
bacilo latente.
Las personas infectadas con el
microorganismo latente representan un
peligro potencial de nuevos casos de TB.
La única manera de controlar la TB es
interrumpir la cadena de infección.
Tuberculina
La tuberculina (TST) es una prueba de
intradermoreacción que permite la
detección de individuos infectados:
Evitando el paso de infección a enfermedad.
Rompiendo la cadena de transmisión.
Tuberculina
Evalúa la hipersensibilidad retardada que
determinados compuestos antigénicos del
bacilo provocan en el infectado.
La tuberculina se obtiene del filtrado del
cultivo de M. tuberculosis esterilizado y
concentrado. Actualmente está constituido
por un derivado proteico purificado (PPD).
Tuberculina
Tuberculina
CPA
Célula T
Liberación citocinas
Induración
visible y palpable.
Respuesta inflamatoria.
Infiltración perivascular
linfomonocitaria.
Inconvenientes Tuberculina
Algunos de los constituyentes proteicos
del PPD son compartidos por
micobacterias ambientales y por el bacilo
vacunal (BCG).
Falta de respuesta en pacientes con
alteraciones de la inmunidad celular.
Errores en la administración y
subjetividad en la interpretación de los
resultados.
Visita de lectura. Conmoción social.
IFN- test
Nueva estrategia en el diagnóstico de la infección latente
Basándose en el fundamento de la
tuberculina se han diseñado nuevas
estrategias in vitro para evidenciar la
sensibilización de las células T.
Se han empleado diferentes antígenos
micobacterianos para la estimulación de
las células.
Revelar la sensibilización mediante
detección de IFN-.
Fundamento de la tecnología
Fundamento de la tecnología
Estimulación
antigénica
Célula T
Liberación
IFN-
Determinacíon IFN-
CPA
Principales antígenos evaluados
PPD
ESAT-6 y CFP10
Resultados empleando PPD como antígeno
Autor
TST NEG
TST POS
TBC
BCG
Converse.
1997
54
89-100
-
-
Streeton.
1998
90pos y neg.
83
6798
ADVP. HIV
253 voluntarios Etiopia.
Pottumarthy.
952 voluntarios
89-81-81
64-67-86 TST77
Mayor concordancia
y IFN1999
1226 adultos.
35%
concordancia
TST y IFN- test

test
en
HIV
positivos
390 TST + / 349 IFN- test +
Katial. 2001 455 individuos.
80
80
-
-
TST
+Inmigrantes
/Baltimore.
IFN- test -. 7x en vacunados
175
G1:
Mazurek.
Personal
Sanitario
PersonalG2:
sanitario.
83
78
43
68
%
concordancia
TST
y
IFN-
test
2001
G3: TBC activa
20 TST +,
TST - en extrapulmonar vs
Bellete.
No20
diferencias
85
71
2002
pulmonar ni si baciloscopia positiva
ESAT-6 y CFP-10
Early Secretory Antigen Target-6.
Culture Filtrate Protein 10.
Proteínas secretadas por M.tuberculosis
complex.
No está presente en la mayoría de
micobacterias ambientales.
No está presente en el bacilo vacunal
(BCG).
Especificidad de ESAT-6 y CFP-10
Tuberculosis
complex
M tuberculosis
M africanum
M bovis
BCG substrain
gothenburg
moreau
tice
tokyo
danish
glaxo
montreal
pasteur
Antígenos
ESAT
CFP
+
+
+
+
+
+
-
-
Micobacterias
ambientales
M abcessus
M avium
M branderi
M celatum
M chelonae
M fortuitum
M gordonii
M intracellulare
M kansasii
M malmoense
M marinum
M oenavense
M scrofulaceum
M smegmatis
M szulgai
M terrae
M vaccae
M xenopi
Antígenos
ESAT
CFP
+
+
+
-
+
+
+
-
Resultados empleando ESAT-6 y CFP-10
Autores
Ravn.
1999
TST NEG
TST POS
TBC
BCG
0 sínteticos
65 de ESAT-6.
32’35
6’9
8 péptidos
Células mononucleares. ELISPOT.
Arend.
8 péptidos0sintéticos de
75 ESAT-6.92
36
2000 En supuestos TST neg: 3 pos/11 (33’8%)
Células mononucleares. ELISA.
Lalvani.
Dinamarca.
33’8
84
96
1’6
ESAT
6 recombinante.
2001
Etiopia.
Células
mononucleares. ELISA
11/34 (32,5%)
HªTB:
consistente
con LTBI en presencia de inmunidad
Contactos con TB: 14/30 (46’6%)
Resultados empleando ESAT-6 y CFP-10
Pathan A et al. 2001. J. Immunol. 2001.
Control no expuesto: 0%
Convivientes expuestos: 85%
TBC pulmonar: 88-92%
La frecuencia de linfocitos T antígeno
específico (ESAT-6) disminuyen con el
tratamiento.
Efecto tratamiento en IFN-
RESPUESTA
TST
IFN-
Carga
Micobacteriana
Infección
Enfermedad
Rx
TIEMPO
Resultados empleando ESAT-6 y CFP-10
Doherty T et al. J. Clin. Microbiol. 2002.
Convivientes expuestos (24).
Seguimiento de 2 años.
Desarrollaron TBC (7):
TST pos (7), IFN- test pos (6)
No desarrollaron TBC (17):
TST pos (14), IFN-  test pos (3)
Indicador de riesgo de progresión a TBC.
Resultados empleando ESAT-6 y CFP-10
Arend S. et al. J. Infect. Dis. 2002
Grupo
ESAT-6
TST POS
M. marinum
5/7
3/5
M. kansasii
4/5
2/4
Alta exposición
micobacterias
ambientales
12/18
0/18
Resultados empleando ESAT-6 y CFP-10
Cardoso F.L. et al. Infect. Immun. 2002.
Resultados positivos del IFN- test:
60% TBC
50% Leprosos
60% Pacientes control
59% Vacunados (todos TST pos)
36% de similitud de la ESAT-6 de
M.tuberculosis y M.leprae.
Resultados empleando ESAT-6 y CFP-10
Ewer K et al. Lancet. 2003.
ESAT-6 recombinante y 12 pools de
proteínas derivadas del ESAT-6 y CFP-10
89% de concordancia con la tuberculina.
Correlaciona mejor que la tuberculina con
exposición a M.tuberculosis en términos de
tiempo (p=0.007) y proximidad (p=0.03).
No correlación con vacunados con BCG
(p=0.44).
Estudios comparativos PPD y ESAT-6
Autores
Johnson.
1999
Brock.
2001
TST NEG
TST POS
TBC
BCG
ESAT-6:
3’4 Sangre-total y ELISA
63
20’37
19 Vacunados:
ESAT-6 9 + por
0 PPD y 2- + por ESAT-6
58
0
PPD
PPD
Vacuna
0 estudiantes
78
47
a 60
de Medicina.
ESAT-6: Sangre total y ELISA
ESAT-6
0
-
78
10’5
Métodos in vitro estandarizados
QuantiFERON-TB Gold
ELISPOT
QuantiFERON-TB Gold
El QuantiFERON- TB Gold (QFN) es un
método basado en la estimulación de
sangre total mediante ESAT-6 y CFP-10.
Determinación de la síntesis de IFN- por
las células T sensibilizadas mediante
técnica de ELISA.
Fase 1: Estimulación linfocitos T
Nil ESAT-6 CFP-10 Mitogen
Control
Control
Extracción
Transferir sangre total sin diluir
en los pocillos de una placa
de cultivo y añadir antígenos.
Tiempo límite
para el procesamiento
de la muestra: 12 horas
Incubar overnigth a 37oC
Los individuos infectados por TB
responden secretando IFN-
Fase 2: Determinación de IFN-
COLOR
Recoger el plasma del
sobrenadante de las células
e incubar 120 min en un
ELISA tipo ‘Sandwich’
Lavar, añadir Substrato,
incubar 30 min
y parar la reacción
Curva Standard
OD 450nm
TMB
IFN- IU/ml
Determinación niveles de IFN-
ELISPOT
Método basado en la estimulación de
células monocíticas extraidas de sangre
periférica mediante la proteína ESAT-6.
Determinación de la síntesis de IFN- por
las células sensibilizadas mediante
técnica de ELISPOT.
ELISPOT
Medio de cultivo con células y el antígeno
Anticuerpos específicos fijados a membrana
ELISPOT
24-28 horas a 37ºC. CO2
ELISPOT
- Anticuerpo secundario. 2’5h. TA. Humedad.
- Streptavidina-HRP. 2h. TA
ELISPOT
- Añadir sustrato cromogénico.
- Incubar 15-70’ a TA.
Lectura de los resultados
Se considera positivo si el pocillo de la
muestra contiene una media de 5 spotforming cells más que el control negativo.
CDC Guidelines para la utilización del QFN
El test de la tuberculina y el QFN no
detectan los mismo componentes de la
respuesta inmune.
Debe ser utilizado en laboratorios con
experiencia en el test.
Grupo de
pacientes
Población
Personas con sintomas de
Sospecha de TB
TB activa
Elevado riesgo
de progresión
hacia TB activa
Riesgo elevado
de TB latente
Otras razones
en personas de
bajo riesgo de
TB latente
Contactos frecuentes.
RX TB antigua. HIV.
Immunosuprimidos
Diabetes, silicosis, Fallo
renal crónico. Leucemia.
Linfomas. Otras neoplasias.
Gastrectomia. Bypass
intestinal. Pérdida superior
al 10% del peso ideal
Inmigrantes recientes.
ADVP. Personal laboral y
residentes de colectivos de
riesgo para propagación de
TB.
Sin factores de riesgo para
desarrollar TB ni
pertenecientes a grupos con
alta prevalencia de TB
Test
Tuberculina.
QFN no
recomendado
Tuberculina.
QFN no
recomendado
Resultados
positivos
 5 mm
 5 mm
Tuberculina.
QFN no
recomendado
 10 mm
Tuberculina o
QFN
 10 mm
%RT  15
Tuberculina o
QFN
 15 mm
% RT  30
Recomendaciones
CDC Guidelines para la utilización del QFN
Utilización
Personas con elevado riesgo de
infección latente.
Personas con bajo riesgo de infección
tuberculosa y sin factores
predisponentes.
Recomendaciones
CDC Guidelines para la utilización del QFN
Confirmación del resultado de QFN
Bajo riesgo: QFN pos requiere
confirmación por tuberculina. Si TST neg
no quimioprofilaxis.
Alto riesgo: QFN pos requiere
confirmación por tuberculina. Si TST neg,
quimioprofilaxis a juicio clínico.
QFN neg no requiere confirmación.
Contraindicaciones
CDC Guidelines para la utilización del QFN
En personas con sospecha de TB activa.
En estudio de contactos de tuberculosos.
Niños y jóvenes < 17 a., embarazadas, o
personas con patologías subyacentes que
aumenten el riesgo de progresión a TB.
No test confirmatorio de la tuberculina.
Ventajas de esta tecnología
No subjetividad en la interpretación.
Posibilidad de repetir determinaciones.
Resultados rápidos.
Se elimina la visita de lectura.
Controles de falta de respuesta inmune.
De fácil estandarización.
No interferencia con la vacuna BCG.
Antígenos lipídicos y glicolipídicos
Ulrichs T. et al. 2003
Se ha descrito un subtipo de cél T
dependientes de moléculas CD1. Estas
moléculas presentan antigenos lípidos y
glicolipídicos. Las T que reconocen estos
antígenos también producen IFN-.
Mayor respuesta frente a estos antígenos
en individuos TST pos que en TST neg.
Mayor respuesta en tuberculosos a las
dos semanas de tratamiento que en el
momento del diagnóstico.
Conclusiones finales
La detección de la infección tuberculosa
mediante el test de la tuberculina es
imperfecta.
Se han realizado esfuerzos para la
estandarización de técnicas in vitro
basadas en la respuesta inmunológica del
huésped frente al patógeno.
Conclusiones finales
Las técnicas actualmente disponibles se
muestran como una posible alternativa al
test de la tuberculina.
Las investigaciones han de ir
encaminadas a identificar nuevos
antígenos específicos de M.tuberculosis
para desarrollar técnicas in vitro para el
diagnóstico de la infección tuberculosa
aún más eficaces.
Conclusiones finales
Los nuevos tests no sólo deben
discriminar entre individuos sensibilizados
de pacientes vacunados con BCG y
infectados con micobacterias ambientales,
sino también de cualquier potencial nueva
vacuna contra la TB.
En el futuro próximo quizás dispongamos
de una técnica de laboratorio que
sustituya al TST en el control de la TB.