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Tema 3. Análisis estructural de enzimas.
1.-Determinación de la Masa molecular.
2.- Determinación de la composición aminoacídica y estructura
primaria.
3.- Estructura secundaria y terciaria.
Determinación estructural: RMN, Cristalografia.
4.- Estructura cuaternaria.
Determinación sub-unidades, tipo
Funcionalidad
1.- Determinación de la Masa molecular.
Técnicas electroforéticas
Electroforesis en gel.
Distancia en cm
Podemos estimar la masa molecular
relativa con el uso de marcadores
Controlar la pureza
Técnicas cromatográficas
Cromatografía por filtración en gel: Tamaño
Las proteínas se separan por exclusión molecular mediante el uso de bolitas
porosas de un polímero insoluble como dextrano o agarosa (Sephadex, Sepharosa).
Se determina Vo con Blue Dextran
Ve se determina para cada proteína
Vt se calcula de la fórmula  r 2 x h
Kav =Ve-Vo / Vt-Vo
Espectrometria de masas
MALDI-TOF: matrix-assisted laser desorption-ionization-time of flight
ESI: electrospray ionization mass spectrometry
MALDI-TOF
Se generan iones de las proteínas
y se aceleran a través de un campo
eléctrico.
Se determina el tiempo que tardan
en ser detectados que es función
de su masa.
Resultado de una espectrometría de masas
Información del peso molecular
Permite la conversión en concentración de proteínas en
solución a Molaridad
1. Composición:
¿cuántos aminoácidos de un tipo hay en la molécula?
2.- Actividad catalítica
¿cuántas moléculas de substrato son transformadas por
una molécula de enzima por segundo?
3.- Uniones a ligandos
¿cuántas moléculas de ligando se une por molécula de
enzima?
2.- Determinación de la composición aminoacídica y
estructura primaria.
Las proteínas son polímeros lineales formados por monómeros llamados aminoácidos
1. Ayuda a conocer su mecanismo de acción. Identificación
de regiones funcionales en una enzima
2. Interpretar datos estructurales cristalográficos, RMN.
3. La secuencia determina la estructura tridimensional
Los aminoácidos se unen entre si mediante enlace covalente de tipo amida
(R-CO-NH-R) para formar péptidos
Las proteínas son polímeros lineales formados por monómeros llamados aminoácidos
Enlace peptídico
-El equilibrio está más desplazado hacia la hidrólisis, por ello la formación del enlace requiere un
aporte de energía (ATP).
-Sin embargo el enlace peptídico es cinéticamente muy estable y en ausencia de un catalizador, el
tiempo de vida en disolución acuosa es de 1000 años.
Estructura primaria
Corresponde a la posición de cada aminoácido en la secuencia codificada por
el ADN
Cada proteína tiene una secuencia de aas única y definida con precisión
Enlace peptídico
METODOS TRADICIONALES DE SECUENCIACIÓN
Composición aminoacídica de cadenas polipeptídicas
Identificación del extremo amino terminal
Reacciones del grupo amino:
- Reacción de Edman: Fenilisotiocianato. Absorbancia a 254nm
- Reacción de Sanger: 1-fluoro,2,4 dinitrobenceno (FDNB). Ab. 360nm
- Reacción con el cloruro de dansilo: compuestos fluorescentes.
- Reacción con la ninhidrina o fluoroescamina. compuestos fluorescentes.
Reacción de EDMAN
l: 254 nm
Fenilisotiocianato
Degradación de EDMAN
Hasta 50 residuos contiguos de un polipéptido
Polipéptidos de gran tamaño
1. Romper la proteína en fragmentos por métodos químicos o enzimáticos
2. Romper puentes disulfuros
3. Purificar cada fragmento y secuenciarlo por Degradación de EDMAN
4. Determinar el orden de los fragmentos y dónde se localizan, si los hay, los
puentes disulfuros.
Rotura de
puentes disulfuros
Métodos para fragmentar las cadenas polipeptídicas
METODOS ACTUALES DE SECUENCIACIÓN
Secuenciación MS-MS
3.- Determinación de la estructura secundaria y terciaria.
Estructura secundaria
Disposición regular y repetida del esqueleto de la cadena polipeptídica en
una dirección determinada. No se tienen en cuenta las cadenas laterales
F y
Sólo se permiten los giros alrededor de los enlaces Ca-N y Ca-C
El carácter parcial de doble enlace del enlace peptídico limita la capacidad de
rotación del mismo
Los ángulos de giro (ángulos de torsión) se denominan: (fi) f y (psi)y.
Estructura secundaria
Los valores para los giros fi y psi están comprendidos
entre 180º y -180º
Estructura secundaria
¿ Cuáles son los valores estéricamente permitidos ?
Indica los valores de los ángulos fi y psi de conformaciones permitidas
Plot de Ramachandran
Las posibilidades de giro van a determinar en
gran medida el plegamiento de las proteínas
Estructura secundaria
En principio un péptido puede adoptar muchas conformaciones diferentes
según los ángulos phi y psi
Adopta la más favorable desde el punto de vista energético:
• menores impedimentos estéricos
• menor repulsión electrostática
Existen dos tipos de estructuras secundarias
termodinámicamente favorables
a-Hélice
Hoja b plegada
Estructura secundaria: a-hélice
Puente de H
n y n+4
Estructura secundaria: a-hélice
f: - 57º
y: - 47º
Estructura secundaria: a-hélice
Radicales hacia el exterior
de la hélice
NO PARTICIPAN DE LA
ESTRUCTURA SECUNDARIA
Restricciones para la formación de una a-hélice
1- Repulsión o atracción electrostática entre aminoácidos cargados.
2- Volumen de los grupos R adyacentes. No podrían ir seguidos varios
aminoácidos voluminosos.
3- Interacciones entre cadenas laterales de aminoácidos separados por
3 ó 4 residuos.
4- Presencia de prolina. X-Pro.
Estructura secundaria: hojas-b
Los puentes de H conectan un residuo con dos
residuos de la cadena adyacente (grupo NH de R1
y el CO de R2 de la cadena adyacente y entre el grupo CO de
R1 y el NH de
R3 de la cadena adyacente)
Las hojas antiparalelas son más estables
por la alineación de los puentes de H
Proteína globular con alto contenido en estructura b
Concanavalina A
Las diferentes estructuras secundarias co-existen
en una misma proteína
Estructura secundaria: giros, codos o lazos b
Permiten el giro de 180º en la dirección de las cadenas polipeptídicas
Estabilizado por puentes de H entre el aa1 y el aa4 (aai e aai+3)
Estructura suprasecundaria
Agrupaciones estables de estructuras secundarias frecuentes en las proteínas.
Motivos estructurales
Todo alfa
Unidad aa
Todo beta
Barril b
Meandro b
Alfa-beta
Unidades bab
Estructura supersecundaria o motivos
Todo alfa
Todo beta
Alfa-beta
-
Hélice-vuelta-hélice.
Siete hélices transmembrana.
Mano EF.
Cremallera de leucina.
- Horquilla b.
- Meandro b.
- Barril b
- Dedo de Zn.
- Motivo bab
Dos a-hélices cortas.
Todo alfa
Siete hélices
transmembrana
Dos a-hélices yuxtapuestas
Interaccionan entre sí mediante
cadenas laterales de leucina
(cremallera de leucina)
bacteriorrodopsina
Mano EF
Proteínas de unión
al ADN reguladoras
de la transcripción
(c-fos, c-jun)
Presente en proteínas
que se unen a calcio
como calmodulina o troponina
Todo beta
Horquilla beta
Barril beta
Dos estructuras b adyacentes
orientadas de forma antiparalela
Proteína que se une al retinol humano
Meandro b
Alfa-beta
Dedos de Zinc
Estructuras alfas y betas unidas por un átomo
de Zinc que interacciona con Cys e His
Proteínas de unión a ADN
Dedo de Zn
Motivo bab
Estructura subterciaria
Dominio:
Parte de la cadena polipeptídica que tiene un plegamiento propio
e independiente del resto de la proteína (Unidad de plegamiento).
La unión estable de varios motivos da lugar a los dominios.
Frecuentemente asociado a una función específica.
Proteínas de más de 200 residuos
Estructura subterciaria
Dominio
Dominio
Dominio
Regiones de 100 a 150 aminoácidos
Estructura terciaria
Disposición tridimensional de todos los átomos de una proteína
Mioglobina
Estructura terciaria
Fuerzas que estabilizan la estructura terciaria
Interacciones débiles
•
•
•
•
Iónicas (puentes salinos)
Hidrofóbicas
Enlaces de hidrógeno
Fuerzas de Van derWaals
Interacciones covalentes
Entre restos de Cys
RESONANCIA MAGNÉTICA NUCLEAR
Núcleos en diferentes ambientes resonaran a
frecuencias de radiación distintas
Proteína con 55 aminoácidos
B-sheet
Efecto de la proximidad de dos núcleos
NOESY “Nuclear Overhause Enhancement Spectroscopy”
Muestra pares de protones muy cercanos menor de 5 A
Magnetización se transfiere
Proteína de 55 aminoácidos
Diagonal
Primera dimensión
Genración de proteínas marcadas 13C,
15N y 2H
RMN en tres dimensiones
Dominio de dedo de Zn
CRISTALOGRAFÍA RAYOS X
Longitud de onda igual longitud
que el enlace covalente
Proteínas cristalizan en la configuración biológica activa
Los electrones de los átomos dispersan los rayos X
La forma de dispersión dependen del ordenamiento
atómico
Transformación de Fourier
Mapas de densidad electrónica
4. Estructura cuaternaria
Hace referencia al ordenamiento de
diferentes subunidades en una
proteína multimérica
Uniones no covalentes
Interacciones débiles
•
•
•
•
Iónicas (puentes salinos)
Hidrofóbicas
Enlaces de hidrógeno
Fuerzas de Van derWaals
1. ¿Cuantas sub-unidades y de que tipo?
Estudios de evaluación Peso Molecular
Estudios de determinación de peso molecular. Agentes desnaturalizantes (Guanidina)
Tipos y número de subunidades (precaución trazas de proteasas, al disociar las sub-unidades)
Estudios de crosslinlinking
Agentes químicos: Dimetilsuberimidato
Desnaturalización SDS
Determinación
Peso molecular
SDS-PAGE
4X
3X
2X
X
Estudios de uniones a ligandos
Número de sitios de una enzima por un substrato indica el número
de sub-unidades (Disposición de las sub-unidades)
Alcohol DH Levadura
Hígado
2 moles de NADH/mol ADH (Dímero)
4 moles de NADH/mol ADH (Tetramero)
Estudios de simetria
Estudios de Cristalografía Ejes de simetria
Aspartato carbamoiltransferasa 6 unidades catalíticas y 6 regulatorias
Estudios de identidad de sub-unidades
Secuenciación N-terminal y C-terminal
Espectrometría de masas de las sub-unidades
2.Enzimas oligoméricas: Funcionalidad
1. Aumenta la posibilidad de regulación catalítica
2. Variaciones en la propiedades catalíticas
Ej.Triptofano Sintasa Proteínas Multienzimáticas.
3. Estabilidad. Lactato DH
4. Generación de estructuras complejas con funciones
biológicas. Economía información genética
Proteasoma