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Alianza para el Aprendizaje de Ciencias y Matemáticas (AlACiMa)
Transformación Bacteriana
Original de Essy Levy, M.S. y Julie Mathern
Temas
Cubiertos
• Introducción
• Transformación de bacteria con el plásmido
de pGLO
• Inducción de la expresión de GFP con
arabinosa y la subsecuente purificación de
la proteína
pGLO™ & GFP
Dogma
Central de la
Biología
Molecular
ADN
ARN
Proteín
a
Característica
El ciclo celular
De ADN a proteína
Kit de
Transformación
de Bacteria
con plásmido
pGLO™
Procedimiento de
Transformación
Day 1
Day 2
¿Qué es una
Transformación?
Alteracion de una
Bacteria como
resultado de la
incorporación de
ADN exógeno (que
viene de afuera de
la célula).
GFP
bacteria
Frecuentemente, el
ADN es circular y
llamado plásmido.
b-Lactamasa
plásmidos
Confiere
Resistencia
al
Antibiótico
Ampicilina.
Métodos de
Transformación
• Electroporación
– Un choque eléctrico resulta en que
la célula sea permeable al plásmido
ADN
• Cloruro de Calcio y Choque Térmico
– Las células químicamente
competentes absorben el ADN
después del choque térmico
¿Qué es un
plásmido?
Un pedazo circular
de ADN de doble
cadena, que se
replica
autónomamente.
Fue evolucionado
originalmente en
bacterias.
Puede expresar
resistencia a un
antibiótico o puede
ser modificado para
expresar una
proteína de interés.
Plásmido
pGLO
• Beta-Lactamasa
Confiere resistencia al
antibiótico ampicilina.
• Proteína Verde
Fluorescente
(“Green Fluorescent
Protein, GFP”)
Aequorea victoria, gen
de medusa
• araC: Regulador
Regula la transcripción
de GFP
Transformación
con pGLO
Pared celular
GFP
Cromosoma
Bacteriano
(ADN)
Bacteria
Beta-Lactamasa
(resistencia a ampicilina)
Plásmidos de pGLO
Proceso de
Transformacion
• Suspender las colonias en la Solución de
Transformación.
• Añadir el plásmido pGLO ADN.
• Incubar los tubos en hielo por 10 minutos.
• Choque térmico a 42°C por exactamente 50
segundos, y luego colocar en hielo por 2
minutos.
• Añadir el caldo nutriente LB e incubar a
temperatura ambiente.
• Esparcir 100 mL de la suspensión por la
superficie de las placas de agar.
¿Que es el
caldo
nutriente de
LB?
• Caldo Luria-Bertani (LB)
• Un medio que contiene los nutrientes para
el crecimiento bacteriano y la expresión de
los genes de interés.
– carbohidratos
– aminoácidos
– nucleótidos
– sales
– vitaminas
Importancia de
cada paso de la
transformación
O
Ca++
O P O
O
CH2
1. La solución de
transformación
contiene CaCI2 .
La carga positiva
del los iones de
Ca2+ neutralizan
la carga negativa
de los fosfatos del
ADN.
Base
O
Azúcar
O
Ca++
O P O
Base
O
CH2
O
Azúcar
OH
Importancia de
cada paso de la
transformación
2. Incubación en hielo
-disminuye la
fluidez de la
membrana celular.
Pared Celular
GFP
3. Choque térmico
-incrementa la
permeabilidad de la
membrana celular.
4. La recuperación
con LB permite la
expresión de la
beta-lactamasa.
Beta-Lactamasa
(resistencia a
ampicilina)
¿Qué observó
en las placas
de agar?
Crecimiento
de colonias
que no brillan.
Crecimiento
de colonias
que sí brillan.
Ningún
Crecimiento
de Bacterias.
Crecimient
o en área
completa.
De ADN a proteína
Relación de RNA con las
cadenas del DNA
Unidad transcripcional
Regulación de
Transcripción
• Operón de
Arabinosa
• Plásmidos de
pGLO
Regulación de
la expresión
del gen
Operón GFP
Operón ara
ara
C
B
A D
araC
Efector (Arabinosa)
Efector (Arabinosa)
araC
B A D
araC
B A D
Gen de GFP
ARN Polimerasa
ARN Polimerasa
ara
C
Gen de GFP
ara
C
Gen de GFP
¿Cómo podemos expresar genes eucariotas en
células procariotas?
Preparación de cDNA