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Biología Molecular en
asistencia e investigación
Conferència donada
per Sílvia Pairet als
alumnes de 2on de
CFGS de Laboratori a
l’IES Pedraforca (2611-09)
Hospital
del
Mar
PRBB
Y después del CFGS, ¿Qué?
Tenemos varias opciones:
- Seguir estudiando una carrera: enfermería, fisioterapia,
biología, biotecnología, medicina, farmacia...
- Estudiar otro ciclo formativo: anatomía patológica
- Ponernos manos a la obra :
Dónde podemos trabajar...
• Laboratorios Privados
Tarea asistencial
• Centros Hospitalarios :
Diagnóstico y seguimiento
• Laboratorios de investigación :
Investigación básica conocer los fundamentos
Investigación traslacional  práctica clínica
El técnico de laboratorio
3 tipos de técnicos:
1) El técnico que se especializa
2) El técnico ayuda de manera general en el
laboratorio
3) El técnico asociado a un proyecto
Esquema
•
•
•
•
Bases de la Biología Molecular
Biología del Cáncer
El laboratorio de Biología Molecular
Fundamentos de las técnicas
Bases de la biología molecular
Bases
de la Biología
Molecular
Biología del Cáncer
El laboratorio de
Biología Molecular
Fundamentos de las
técnicas
El genoma
Los cromosomas están formados por ADN que
contiene toda la información genética de una célula.
Los genes determinan nuestro código genético.
El genotipo
• Es el contenido genético de un individuo en
forma de ADN
• La secuencia de
nucleótidos constituye
la cadena de ADN y
el conjunto de genes
de un organismo
El fenotipo
• Las características físicas de cada persona
vienen determinadas por nuestro código genético
• El Fenotipo es la
expresión del
Genotipo
de cada persona
individualmente
Un repaso a la molécula de ADN
Azúcar
+
Base
Nitrogenada
+
Grupo fosfato
Codón
Proteína
CODÓN
AMINOÁCIDO
¿Qué información nos están
dando los genes?
Al formar una frase lo que hacemos es enlazar un
conjunto de palabras : Sehr angenehm.
Es tut mir leid.
Para poder descifrar la información que
contiene necesitaremos traducirlo.
En el código genético, este paso sería
conocido como:
Dogma Central de la Biología
Síntesis de proteínas
Una enzima sintetiza un ARNm
que mantiene la información de
la secuencia de ADN para formar
una proteína.
Dicha proteína está
expresando la información
contenida en los genes de una
célula determinada
ADN
ARN
polimerasa
Expresión genética
La insulina es el resultado de la información codificada
que contenía el ADN.
Sin la correcta intervención
de todos estos componentes,
no tendríamos la Insulina
como expresión de
la información genética.
Todas las células de un individuo
tienen los mismos genes
99%
homología
Fenotípicamente, son muy diferentes…Porqué?
Expresión génica
Es la combinación de qué genes están activos y cuáles
inactivos lo que hace que cada célula sea diferente
Expresión
Genes
inactivos
Biología del cancer




Bases de la Biología Molecular
Biología del Cáncer
El laboratorio de Biología
Molecular
Fundamentos de las técnicas
Cáncer:
Un problema de frenos y acelerador
Enfermedad genética producida por la mutación
de determinados genes en una célula
determinada.
2 tipos de genes implicados en el cáncer...
Oncogenes
Genes supresores
de tumores
Mutación
Alteración de la secuencia del ADN original. Esto provoca
cambios en la información genética del individuo.
Oncogenes
• En condiciones normales hacen
Aceleradores
que la célula avance en su ciclo y
se divida.
• Si están hiperactivados debido a
una mutación, la célula se
reproduce sin control.
• Cuando estos genes se expresan más de la cuenta,
pueden causar cáncer.
Genes supresores de tumores
• Regulan el ciclo de división
celular, arreglan anomalías ADN y
si la célula tiene una lesión en el
ADN apoptosis
Frenos
• Mutados, la célula es incapaz de
suicidarse y continúa
dividiéndose de manera
defectuosa
• Cuando estos genes no se expresan, pueden causar
cáncer
El laboratorio de biología
molecular
Perspectivas de futuro
Bases de la Biología
Molecular
Biología del Cancer
El laboratorio de Biología
Molecular
Fundamentos de las técnicas
Biología molecular:
Estudio de los procesos que se
desarrollan en los seres vivos desde
un punto de vista molecular.
OBJETIVO DE LA BIOLOGÍA
MOLECULAR (I)
Conocer:
Cómo se regulan los genes
Cómo funcionan las proteínas resultantes
Cómo se alteran en situaciones
patológicas específicas
Translocación
OBJETIVO DE LA BIOLOGÍA
MOLECULAR (II)
Para hacer:
Un diagnóstico adecuado
Acciones terapéuticas curativas
(tratamientos dirigidos a la alteración molecular)
Permitir el diseño de pautas preventivas
(seguimiento del paciente)
100
12-may-05
Ratio BCR-ABL/GUS (%)
10
07-nov-05
1
13-feb-06
0,1
31-jul-06
06-nov-06
08-may-06
29-ene-07
0,01
30-abr-07
26-feb-08
17-dic-07
03-sep-07
30-may-08
0,001
19-ago-08
09-ene-09
Diagnóstico de la LMC (I)
Esta enfermedad presenta una alteración molecular debido
a la translocación de 2 cromosomas, que dan lugar al
cromosoma Filadelfia.
Diagnóstico de la LMC (II)
El gen ABL es un proto-oncogén que actúa de forma
normal como un acelerador en la célula.
Translocación
La proteína BCR-ABL actúa como acelerador del ciclo
celular haciendo que las células se dividan de forma
descontrolada e inhibiendo la reparación por daño al ADN
Diagnóstico de la LMC (III)
Si se detecta la presencia de esta alteración molecular
podemos corroborar el diagnóstico con la ayuda de otros
criterios
Activación del gen
Existen tratamientos con
fármacos
que van dirigidos a bloquear la
proteína que se activa por la
fusión de este gen BCR-ABL,
y de esta manera evitar la
proliferación descontrolada
Fármaco que impide
la activación del gen
Diagnóstico de la LMC (IV)
La pauta preventiva se realizaría comprobando la
cantidad de copias del gen durante el seguimiento del
paciente para determinar si este gen sigue expresándose
o no.
Gráfica del seguimiento del paciente
100
12-may-05
Ratio BCR-ABL/GUS (%)
10
07-nov-05
1
13-feb-06
0,1
31-jul-06
06-nov-06
08-may-06
29-ene-07
0,01
30-abr-07
26-feb-08
17-dic-07
03-sep-07
30-may-08
0,001
19-ago-08
09-ene-09
Técnicas de biología molecular
Bases de la Biología
Molecular
 Biología del cáncer
 El laboratorio de Biología
Molecular
 Fundamentos de las
técnicas de Biología
Molecular

Técnicas Moleculares para
el Diagnóstico de la LMC
1. Extracción de ácidos nucleicos
2. Cuantificación
3. RT-PCR
4. PCR Convencional
5. Secuenciación Directa
6. PCR Cuantitativa
Recepción de muestras
• Recepción de muestras :
SP, MO, Tejido, Citologías
• Extracción de ADN y/o ARN
• Valoración de la calidad
• Diferentes técnicas en función de los estudios
relacionados con las diferentes neoplasias
Empieza el juego...
Densidad
pH
Separación de células
1. Separación de las células que nos interesan
mediante centrifugación por Gradientes de densidad.
Los componentes de la mezcla se reparten en diferentes
fases en función de la densidad y de la afinidad por los
componentes químicos que utilizamos
Obtención de los ácidos nucleicos
2. Desnaturalización de los ácidos nucleicos. Se provoca
la ruptura de la pared celular para que el ADN quede libre
en la mezcla
3. Purificación del resto de
componentes mediante
centrifugación
Precipitación de los ácidos
nucleicos
3. Precipitación de los ácidos nucleicos para formar un
pellet celular que resuspenderemos en un tampón adecuado
y a una concentración óptima
Valoración calidad/pureza
El Espectrofotómetro mide la absorbancia de la luz a través
de la muestra a una longitud de onda determinada
RATIO:
Abs 260/280
Concentración (ng)
de ácidos nucleicos
Restos de proteínas
y alcoholes
Técnicas Moleculares para
el Diagnóstico de la LMC
1. Extracción de ácidos nucleicos
2. Cuantificación
3. RT-PCR
4. PCR Convencional
5. Secuenciación Directa
6. PCR Cuantitativa
Reacción en Cadena de la
Polimerasa (PCR)
Es como hacer un caldo...
+
=
PCR (I)
1. DNA MOLDE. Segmento de ADN de doble cadena que
contiene la secuencia diana que queremos amplificar
2. PRIMERS. Pequeños fragmentos de
ADN de cadena simple.
Complementarios a los extremos
flanqueantes del ADN molde.
Marcarán el punto de partida y
delimitarán la zona de ADN a amplificar
PCR (II)
A C G T
3. dNTPs. Suplemento de nucleótidos.
Sustrato que usará la Polimerasa cuando
produzca el nuevo ADN
4. DNA POLIMERASA. (Taq Polimerasa)
Enzima que produce las copias de ADN
5. Tampón y MgCl2 . Adición de sales y un tampón que
mantenga el pH adecuado en la mezcla
Veamos que pasa dentro del
caldo...
Ciclos de amplificación
Desnaturalización
La muestra se lleva a una temperatura de 9496°C para que se rompan los puentes de
hidrógeno y las dos cadenas del ADN molde se
separen
Hibridación
Los primers o cebadores que hemos añadido en la
muestra actúan a una temperatura de entre 50 y 70ºC
para unirse uno por cada extremo a las cadenas de
ADN molde de manera complementaria. De esta
manera delimitarán la zona a amplificar
Extensión
La ADN polimerasa actúa a 72ºC para que se realice
la extensión de las cadenas de ADN por
complementariedad de bases entre los dNTPs y la
cadena molde
Y esto es lo que ocurre...
Original DNA target region
Thermal cycle
En 32 ciclos, al 100% de eficiencia, se
crean más de mil millones de copias del
ADN de interés!
Identificación de bandas
Para visualizar el producto
de la PCR utilizamos la
electroforesis en gel de
agarosa. Como conocemos
el tamaño del gen a
estudiar, visualmente
podemos observar si está o
no presente en la muestra.
PCR enTiempo Real
Es una variante de la PCR que permite cuantificar el
producto de la amplificación.
Añadimos un fluorocromo que emitirá una fluorescencia con
cada copia del ADN. Esto nos indicará si el gen está presente
o no en la muestra, y de ser positivo, si se encuentra en mayor
o menor cantidad
100
12-may-05
PCR
+
Ratio BCR-ABL/GUS (%)
10
07-nov-05
1
13-feb-06
0,1
31-jul-06
06-nov-06
08-may-06
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0,01
30-abr-07
26-feb-08
17-dic-07
03-sep-07
30-may-08
0,001
19-ago-08
09-ene-09
MUCHA SUERTE!!