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Aplicaciones de la ingeniería
genética a la cría y salud
animal.
Bases fundamentales de la terapia génica.
Aplicaciones en salud animal.
-Formas de actuación mediante terapia génica.
-Mecanismos de introducción del gen terapéutico.
Terapia génica “in vivo” y “ex vivo”. Ingenieria
Tisular.
- Enfermedades candidatas para un tratamiento
con terapia génica.
¿QUÉ es la Terapia génica?
“Proceso por el cual un nuevo
gen es introducido en células de
un individuo para producir un
efecto terapéutico.”
DNA como medicamento
o Curar con genes
¿QUÉ es Gene Marking?
“Proceso que utiliza técnicas
comunes a la Terapia Génica
pero sin buscar un efecto
terapéutico.”
Ej. Seguir la pista a determinadas
células en el organismo.
“Añadir función”
Terapia Génica
“Suprimir función”
“Añadir función”
Terapia Génica
Añadir función
• Sustitución del gen deseado.
• Reparación de una mutación.
• Añadir un gen
Añadir función
• Recombinación homológa
(sustitución o reparación puntual)
• Introducción del transgen al
azar
(añadir un gen)
Terapia Génica
“Suprimir función”
Suprimir función
• Muerte celular (suicidio de
las células)
• Oligonucleótidos antisentido
(expresión).
• Ribozimas (Ruptura).
OLIGONUCLEÓTIDOS ANTISENTIDO
iRNA: RNA de interferencia
MODOS DE
INTRODUCCIÓN
“In vivo”
Terapia Génica
“Ex vivo”
IN VIVO/EX VIVO
DIRECTAMENTE EN EL INDIVIDUO ADULTO
REALIZABLES EN CULTIVOS CELULARES
EX VIVO
SOLO EN CULTIVOS CELULARES
IN VIVO/EX VIVO
•DIRECTOS
EX VIVO
DNA desnudo
DNA desnudo
• Inyección de la molécula de DNA.
• Músculo , Piel, Mucosas y Timo.
• Introducción por “nuclear pore complex”.
-
Talla ILIMITADA.
Bajo porcentaje de transfección
No hay integración en el genoma.
No hay amplificación del DNA.
IN VIVO/EX VIVO
•DIRECTOS
•INDIRECTOS
EX VIVO
DNA desnudo
- Mediados por
vectores
¿Qué es un vector?
• “Son sistemas que ayudan en el
proceso de transferencia de un
gen exógeno a la célula,
facilitando la entrega,
biodisponibilidad intracelular del
mismo de modo que pueda
funcionar correctamente”
Características del vector ideal
•
•
•
•
•
Especificidad de órgano o tejido.
Protección del DNA.
Elevada disponibilidad.
Expresión eficaz.
No inmunógeno/sin repuestas
inflamatorias.
• Seguro paciente/entorno.
IN VIVO/EX VIVO
•DIRECTOS
DNA desnudo
- Retrovirus
•INDIRECTOS
-Adenovirus
- Adenovirus asociados
- Liposomas
EX VIVO
- Fragmentos específicos
VECTORES RETROVIRALES
•
•
•
•
Una cadena de RNA.
Protegidos por una cápside.
Talla de 80 a 130 nm.
Tres genes importantes:
–
–
–
–
gag: proteínas de la cápside
pol: transcriptasa inversa e integrasa
Env: proteínas de envoltura y reconocimiento de receptor
Zonas LTR: Long Terminal Repeat
Construcción Retroviral
MMLV: Moloney Murine Leukemia Virus
Producción de
vectores retrovirales
CÉLULAS EMPAQUETADORAS
(helper free)
RNA
Producción de
vectores retrovirales
CÉLULAS EMPAQUETADORAS
(helper free)
Retrovirus Recombinantes
Características de los
vectores retrovirales
•
•
•
•
•
•
•
•
•
Alta eficacia de transducción.
Tamaño del inserto 8Kb.
Alta expresión una vez introducido en el genoma.
Sistema muy bien estudiado.
Proteínas del vector no se expresan en el
huésped.
Necesita células en división.
Se consiguen títulos muy bajos de virus.
Integración al azar en el genoma.
Transducción “in vivo” poco efectiva.
IN VIVO/EX VIVO
•DIRECTOS
DNA desnudo
- Retrovirus
•INDIRECTOS
-Adenovirus
- Adenovirus asociados
- Liposomas
EX VIVO
- Fragmentos específicos
VECTORES ADENOVIRALES
• DNA lineal de cadena doble.
• Más complejos que los retrovirus.
• Tres genes importantes:
–
–
–
–
E1:
E2:
E3:
E4:
rescata células de la quiescencia.
proteínas relacionadas con la replicación del DNA.
defensa ante el sistema inmunitario.
regulación de la transcripción.
VIRUS RECOMBINANTES E1 Y E3 ELIMINADOS
Características de los
vectores adenovirales
• Eficaces a la hora de transferir el gen
episomal a una gran cantidad de células.
• Fácil producción en el laboratorio.
• Gran respuesta inmunitaria.
• Dificultad para repetir la inyección de
virus.
IN VIVO/EX VIVO
•DIRECTOS
DNA desnudo
- Retrovirus
•INDIRECTOS
-Adenovirus
- Adenovirus asociados
- Liposomas
EX VIVO
- Fragmentos específicos
VECT. ADENOASOCIADOS
• DNA lineal de cadena doble.
• Se insertan en el genoma.
• Dos genes :
– rep: replicación e integración del virus.
– cap: tres proteínas estructurales víricas.
– TR: repeticiones terminales-145 nucleótidos.
VIRUS RECOMBINANTES SOLO CONTIENEN TR
Células que poseen los genes rep y cap.
Características de los
vectores adeno-asociados
• Expresión a largo plazo.
• No hay respuesta inmunitaria.
• Talla limitada del gen a introducir (aprox
5 Kb).
• Dificultad para obtener grandes
cantidades.
http://140.116.60.1/mdlai/Handout/cancer-gene-therapy/sld014.htm
IN VIVO/EX VIVO
•DIRECTOS
DNA desnudo
- Retrovirus
•INDIRECTOS
-Adenovirus
- Adenovirus asociados
- Liposomas
EX VIVO
- Fragmentos específicos
LIPOSOMAS
• CATIÓNICOS
– Su carga positiva reacciona con la negativa
del DNA formando un complejo.
• pH SENSIBLE O ANIÓNICO
– Mediante una desestabilización por bajo pH el
DNA entra en “núcleo del liposoma”.
POSIBILIDAD DE UNIR RECEPTORES
ESPECÍFICOS
Características de los liposomas
–
–
–
–
–
–
–
Protegen al DNA
No hay limite de tamaño
Enviar a lugares específicos.
Baja eficacia
Expresión transitoria.
Toxicidad celular
Inhibición por componentes séricos.
IN VIVO/EX VIVO
•DIRECTOS
DNA desnudo
- Retrovirus
•INDIRECTOS
-Adenovirus
- Adenovirus asociados
- Liposomas
EX VIVO
- Fragmentos específicos
•QUIMICOS
Precipitación con
fosfato de calcio
•FISICOS
Electroporación
MÉTODOS “EX VIVO”
(Cultivos celulares)
Las células modificadas
genéticamente deberán ser
introducidas posteriormente
en el enfermo
MECANISMO “EX VIVO”
MODO DE INTRODUCCIÓN
Algunas...
• Enfermedades monogénicas.
• Cancer.
• Enfermedades infecciosas o
parasitarias.
• Enfermedades
neurodegenerativas
Enfermedades Monogénicas
- Conocidas por la mayoría como las
únicas candidatas para el
tratamiento.
- Aporte de la proteína/enzima
deficitaria.
- Posibilidad de realizar terapia
génica germinal..
Algunas...
Deficiencia Inmune Severa Combinada
Deficiencia Inmune Severa Combinada
ligada al cromosoma X
Fibrosis Quística
Enfermedades lisosomales (Gaucher,
etc.)
Deficiencia Inmune Severa
Combinada
- Deficiencia en la enzima Adenosin
Desaminasa.
- 1/100.000 (25% de mortalidad).
- Fragilidad de los linfocitos T..
INMUNOSUPRESION
David "niño burbuja",
(Fuente: M.R. Cummings. Herencia humana (3ª ed.), Interamericana (1995)
Tratamientos
- Aportación de la enzima
recombinante:
ADA
PEG-ADA
- Transplante de médula osea.
1ª Experiencia de Terapia génica:
Deficiencia Inmune Severa
Combinada
- 1990. Dr Blaese (EEUU)
Dr. Bordignon (Italia)
-1995 Demuestran la eficacia del
tratamiento
Ashanti de Silva tratada a los cuatro años de edad.
(Fuentes: W.F. Anderson, Scient. Amer., 273(3):96-98(1995).
X-SCI Imunodeficiencia Severa
combinada
-Mutación en el Cromosoma X
- Deficiencia en la cadena g del
receptor para la interleukina IL2RG
- Hospital Necker de Paris (11
niños)
X-SCI Imunodeficiencia Severa
combinada
-3 de los niños sufrieron una
leucemia.
- ¿Por qué?
-Efecto posición (LMO2)-2003
-Efecto sobreexpresión- 2006
Fibrosis Quística
- Deficiencia en el CTFR (Cystic
factor transmembrane receptor).
- 1/2.800 (Muerte a los 29).
- No hay tratamiento.
Problemas para clonar el CTFR
2.-Tumores
-
-
Muerte celular
Genes supresores de tumores.
Producción de linfoquinas
Inmuno Terapia con antígenos MHC
Los más tratados:
Melanoma.
Leucemias
Glioblastoma
Tumores de pulmón, hígado, etc.
3.- INFECCIOSAS Y/O
PARASITARIAS
-
- Estimular el sistema inmunitario.
- Vacunas de DNA desnudo con antígenos.
- Linfocitos recombinantes para los
anticuerpos que actuan contra el virus.
Algunos ejemplos:
SIDA
Vacunas de DNA desnudo en animales.
4.- Enfermedades
neurodegenerativas
-
- Inhibición de apoptosis neuronal.
- Producción de L-dopa o factores
neurotróficos en cerebro.
Algunos ejemplos:
Enfermedades de la motoneurona
(E.L.A. Y E.M.)
Parkinson y Alzheimer.
ENFERMEDADES TRATADAS
¿FASES?
¿Dónde se están tratando?
CIFRAS POR PAISES
CIFRAS POR CONTINENTES