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Biol 3019
Biología del Desarrollo
Universidad de Puerto
Rico-Aguadilla
JA Cardé, PhD
Expresión Diferencial del
Genoma en el
Desarrollo - II
Objetivos
 Repasar los conceptos de equivalencia genómica
y de expresión diferencial del genoma.
 Repasar la anatomía de un gen y del mRNA
 Promotores, enhancers,
 TF y silencers
 Explicar los mecanismos de transcripción diferencial
 Discutir el procesamiento diferencial del mRNA
 Resumir los mecanismos de controlde expresión
genética: transcripcional, traduccional, postraduccional; y sus implicaciones en el desarrollo.
Mecanismos de Transcripción
diferencial
 TF: Ya se sabe quienes son, pero no
se sabía su rol?
 ChIP-Seq Technique:
 Aislar y crosslink la cromatina
 Cortar el DNA (sonicación/enzimas)
 Incubar con AB vs la proteína de
interés
 Precipitar complejo AB-Prot-DNA
 Separar el DNA, PCR y secuenciar
Mecanismos de Transcripción
diferencial
 ChIP-Seq, identifica dos tipos de promotores
 High CpG content promoters
 Default ON, DNA no metilado  activo; para
inactivarlo metilar las histonas
 En genes de control del desarrollo temprano
 Regulan la síntesis de TF y otras proteínas
reguladoras
 Low CpG content promotors
 proteínas características de etapas tardías,
células maduras
 Defaults OFF: DNA metilado  inactivo, hay
que demetilar y esto permite modificar las
histonas (H3K4me3) y la RNA pol II entra.
Transcripción diferencial: mecanismos
Metilación del DNA: ON/OFF switch
 Histonas metiladas para?________________
 … y el DNA? En las citosinas del promotor
 5 Metilcitosina (5ta base) estabiliza nucleosomas
previene transcripción
 Presente en 5% de las C (seguidas por G) luego de
la replicación
 Regulación transcripcional en vertebrados
 Metilación del DNA:
 Bloquea la unión de TF a enhancers con C metilada
 Facilita reclutamiento de metilasas y deacetilasas,
estabilizando el nuclesoma para evitar transcripción
(MeCP2)
Transcripción diferencial: mecanismos
Metilación del DNA: ON/OFF switch
Como comparan en (términos de
metilación) el promotor de las
globinas en RBC inmaduros vs RBC
maduros durante el desarrollo?
Metilación: Patrones
heredables: DNMT3DNMT1
DNA CpG
|
|
DNMT3
(de novo)
|
|
DNMT1
(forever)
Asignado: 3 estados de la cromatina: activa,
reprimida o “poised” (pag 51).
RNA
Procesamiento Diferencial:
 La clave de la diferenciación celular es la síntesis de
diferentes proteínas en diferentes tipos de células
 En bacteria el control es: transcripcion, traduccion y
postraduccion
 En eucariota: uno mas; procesamiento y transporte
 Splicing isoforms:
 En humanos 90% de los genes lo usan
 “Human Genes are multitaskers” – Christopher Burge
 Genoma: 20,000 genes < Proteoma: 20,000 proteínas
Genes
Cells
Proteins
C elegans
20,000
959
~20000
H sapiens
20,000
100,000 bil
~100,000
Alternative Splicing Variants
Bcl-XS vs Bcl-XL:
- large Bcl = inhibe apoptosis
- short Bcl = induce apoptosis
en tumores cual predomina?
Spliceosome
Factores de
splicing
- Expresados
diferencialmente
- snRNA U1 y
SF2 en 5’
- U2AF en 3’
RNAProcesamiento Diferencial:
ER - Drosphila Dscam gene
 La clave de la diferenciación celular es la síntesis de
diferentes proteínas en diferentes tipos de células
 Splicing isoforms:
Altenative Splicing: FGF
IIIb vs IIIc
- Ambos en
entre ex 7 y 8
- En mesenq
IIIC:
mesodermo
- En epitelio
IIIB
:ectodermo
- Metilaciones
marcan
splicing
Splicing enhancers y recognition
factors
 Splicing enhancer (cis) sequences (SES)
 Cerca de sitios de splicing
 Promueven el ensamblaje del spliceosome
 Recognition factors (trans) proteins
 Reconocen las SES y reclutan el splicesoma
 Polypirimidine track binding proteinas (PPT) reprimen la
formacion del spliceosoma
 Hay señales que sugieren que el contexto tambien es
importante
Aplicación clínica
Mutaciones en splicing sites:
 La mayoria resultan en proteinas NO
funcionales
 Distrofina: mutación en un “splicing site”
causa que se salte el exón
 Myostatin gene: mutacion en el induce
personas mas “fuertes”
 Su proteina es un regulador negativo
de division celular muscular
 Hipertrofia muscular – como miostatina
no esta, el musculo se sigue dividiendo
hasta mas tarde: musculos mas grandes
Myostatin Knockout
Control: Nivel traduccional:
longevidad diferencial
 Longevidad diferencial del
mRNA : media vida del mRNA
 Mientras mas estable mas dura
y mas copias de la proteína
 Longitud del poli A, secuencias
en el 3’UTR para mayor
longevidad
 Estabilización de ciertos mRNA
en ciertos momentos en ciertas
células
 mRNA caseína : 1.1 hr en tejido
mamario vs 28.5 hrs en
lactancia (prolactina)
Control: Nivel traduccional:
Inhibicion selectiva de mRNAs
 Ovocito: fabrica y almacena los mRNAs
que se usarán solamente luego de
fecundación.
 Se mantienen en estado durmiente hasta
que llegue la señal: polaridad / iones
 Ej de mRNAs en el huevo: histonas,
actina/tubulina, ciclinas
 Drosophila: bicoid, caudal, nanos
(homeobox)
 Regulación traduccional “negativa”:
inhibidores
Control: Nivel traduccional:
Inhibicion selectiva de mRNAs
 5’Cap, 3’ Poly A ; si no estan no traduccion
Circularización
de mRNA
- 5’ cerca de 3’
- eIF4E +
- eiF4A (helic)
- eiF4G (scaf)
- poliABP
-
Maskin
CPEB (3’UTR)
(uuuuau)
eIF4E
Fosforilacion
de CP y
Maskin
activa
Control: Nivel traduccional
- Tienen favoritismos los ribosomas? NO!
- a favor: mRNAs de Euc son traducidos por ribosomas
de Proc
- sistema reticuloendotelial: traduccion por excelencia
 SI: Selectividad ribosomal – Ribosomas
tienen proteinas distintas dependiendo
del tejido
 Observación de un gen que causaba
deformidad esqueleto axial
 Por la traducción diferencial del gen :
Rpf38
 Proteina 38 del ribosoma en las somitas,
controla expresion del Hox6
 Deficiencia de Rpf38 causa deformidad
vertebral
 Rpf38  Hox6
Control: Nivel traduccional
puede el RNA como las proteinas unirse a un
acido nucleico y bloquearlo? SI
 microRNAs – eficiente y específico medio
de regular la traduccion de un mRNA
 Pequeños, complementarios a mRNA o
parte de el
 Anti sense RNA, primera vez en C elegans
 Lin-4: RNA 21nctds  silencia mRNA de
lin 14 uniéndose a su 3’UTR, marcado para
degradación
 Lin14 usado en larva temprana, luego
inactivado
 miRNAs – sobre 1000 en humanos, regulan
50% de nuestros genes estructurales
- Conservado
- El precursor tiene
varios repeats, cada
uno forma un loop
- Estos loops son
procesados por
Drosha y Dicer
(RNAsas
- Estas lo hacen SS RNA
- Empacado en RISC
- Argonauta
- Se unen al 3’UTR
- Inhiben traducción
- Perfect
Prim-DroshaPremDicermicroAgo
microRNAs
 miR1- controla el balance entre crecimiento ventricular y
diferenciacion
 miR181 – esencial para la determinacion de celulas
progenitoras en celulas B
 miR430 – operacion limpieza de mRNAs maternales el
ovocito una vez traducidos (zebra fish)
 Fine tuning de Nodal: determinacion de
ectodermo/endodermo
 Son de 22 ncltds, pero con region “seed” de 5ncltd en el
5’
 mRNA con 3’UTR mutado y micro RNA no lo reconoce?
 Texel sheep: myostatin
 Mutacion en el previene splicing hipertrofia muscular,
por deficiencia de miostatina
 Otra forma: transicion AG en 3’UTR, mir1 y mir 206,
degradan el mRNA
Control de expresion de RNA:
localización citoplásmica
 Se regula el timing y la localizacion de la
expresion
 3’UTR – represion selectiva y localizacion
selectiva
 3 mecanismos de localizacion
 Difusion y anclaje por proteinas
activadoras (nanos)
 Proteccion por localizacion (hsp83)
 Libre difusion como nanos pero no es
degradada en unas zonas especificas
(polo posterior)
• Transporte
activo
(mecanismo
mas usado)
• Proteinas
motoras
ligan el 3’UTR
y lo
transportan
• Son ATPAsas
(Dineina y
kinesina, osar
y bicoid)