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TALLER DE
APLICACIONES
PRÁCTIAS 1
Dra. María Isabel Fonseca
Desnaturalización – renaturalización del DNA
Polymerase Chain Reaction (PCR)
Es objetivo de la PCR obtener un
gran número de copias de un
fragmento de ADN particular,
partiendo de un mínimo; en teoría
basta partir de una única copia de
ese fragmento original, o molde.
Se llama "cadena", porque los
productos de la primera reacción
se convierten en sustratos de la
siguiente, y así sucesivamente.
Kary Banks Mullis
Premio novel de
Química en 1993
Componentes necesarios para
realizar PCR
ADN target: que contiene la secuencia que se desea amplificar
Dos de cebadores (S y AS) que delimitan la secuencia que se va
a amplificar
dNTPs sustratos para la síntesis
ADN polimerasa termoestable que cataliza la reacción
Iones Mg++ Cofactor de la enzima
Sn buffer mantiene el pH y la fuerza iónica en la reacción
necesario para una adecuada actividad del enzima
agua
Controles utilizados en la PCR
+
-
Etapas del proceso
El equipo utilizado para realizar
la PCR
Tubos con PCR
TERMOCICLADOR
PCR
3’
5’
5’
3’
Desnaturalización
3’
5’
5’
3’
Templado
3’
5’
5’
3’
Elongación
3’
5’
5’
3’
*
*
El equipo utilizado para realizar
ANÁLISIS DE PCR
la PCR
Visualización
Electroforesis
-
+
Marcadores Moleculares
MARCADORES MOLECULARES
LOS MARCADORES MOLECULARES SE
DEFINEN COMO TODO O CUALQUIER
FENOTIPO MOLECULAR ORIUNDO DE UN
GEN QUE SE EXPRESA, COMO EN EL CASO DE
LAS ISOENZIMAS, O DE UN SEGMENTO
ESPECÍFICO DE ADN (CORRESPONDIENTE A
REGIONES QUE SE EXPRESAN O NO DEL
GENOMA).
PUEDEN SER MARCADORES MOLECULARES
LAS PROTEÍNAS (Ag E ISOENZIMAS) Y EL ADN
(REGIONES
CODIFICANTES
O
NO
CODIFICANTES)
DNA
Proteína
RNA
transcripción
Secuencias o
moléculas de
DNA
traducción
Secuencias o
moléculas de
RNA
Secuencias o
moléculas de
Proteínas
MARCADORES
MOLECULARES
Marcadores moleculares
• Secuencias conocidas
• Fáciles de detectar y seguir en la población
• Codificantes o no codificantes
• Secuencias conservadas
• Secuencias polimórficas
Secuencias polimórficas
• Variabilidad genómica poblacional
• Análisis de diversidad
• Identificación de individuos
• El grado de polimorfismo permite distinguir la
utilidad del marcador
Polimorfismo (mutaciones con frecuencia mayor al 1%)
- Varios alelos por locus.
ATGCCGCGCTT
ATGCCATGCTT
ATGCTGCGCTT
Polimorfismos
Génico
- Grupos del sistema ABO
- Isoenzimas
No génico
No ejercen
presión
selectiva
- Minisatélites y microsatélites
- SNP no génicos
Secuencias relativamente conservadas
• Grado de conservación y disponibilidad
determina la utilidad (ej. Especies, variedades,
formas especiales)
• Regiones STS para mapear genomas
• Regiones ETS para mapear transcriptomas
• Familias génicas y genes homólogos
Marcadores moleculares:
secuencias conservadas
STS (Sitios etiquetados por la secuencia)
DNA
ETS (secuencias etiquetadas expresadas)
mRNA
cDNA
Marcadores moleculares:
secuencias polimorficas
SNP (polimorfismo de simple nucleótido)
STR (microsatélites)
VNTR (minisatélites)
RFLP (sitios de cortes de enzimas de restricción)
RAPD (fragmentos amplificados al azar)
MARCADORES MOLECULARES (MM)
¿Secuencias conocidas o desconocidas?
Variabilidad - polimorfismo
Factibilidad técnica de reconocerla
¿Qué encontramos en un segmento de cromosoma
humano?
Brown, T. A. Genomes. 2nd ed. Oxford, UK: BIOS Scientific Publishers Ltd; 2002 . http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books
Secuencias repetidas en tándem
Minisatélites
Unidad de repetición: 10-65 pb
Bloque 100 a 1.000 u
ATGCGTGGTCTAGGCTCTAATGCCTGAACTAGGCTCTAATGCCTGAACTAGGCTCTAATGCCTGAATTCGG
Microsatélites
Unidad de repetición: 2-6 pb
Bloque <50 u
ATGCGAATGTGGTCTAGCTAGCTAGCTAGCTAGCTAGCTAGCTAGCTAGCTAGCTAGTTCGGCGTTTGAAGT
VNTR: minisatélites (variación del número de repeticiones)


Enzima de restricción
Alelo A
sonda
sonda
Alelo B
sonda
sonda
3 genotipos posibles
AA
AB
BB
AA
2 cortos
1 corto y 1 largo
2 largos
+
Electroforesis +
hibridación con sonda
(Southern blot)
AB
BB
ENZIMAS DE RESTRICCIÓN
EcoRI
Escherichia coli
HindIII
Hemophilus
influenzae
Sma I
Serratia
marcescens
......G-A-A-T-T-C......
......C-T-T-A-A-G......
......A-A-G-C-T-T......
......T-T-C-G-A-A......
A-A-T-T-C......
G......
......G
......C-T-T-A-A
A-G-C-T-T......
A......
......A
......T-T-C-G-A-A
......C-C-C-G-G-G......
......G-G-G-C-C-C......
G-G-G......
C-C-C......
......C-C-C
......G-G-G
ESTRUCTURA de STR
DISEÑO DE CEBADORES
Microsatélites
Amplificación: PCR
Alelo A
Alelo C
Alelo B
Alelo D
genotipos posibles
AA: 2 copias de 4 repeticiones = 4 repeticiones
AB: 4 repeticiones + 5 repeticiones
AC: 4 repeticiones + 6 repeticiones
AD: 4 repeticiones + 7 repeticiones
BB: 5 repeticiones
Electroforesis
BC: 5 repeticiones + 6 repeticiones
BD: 5 repeticiones + 7 repeticiones
CC: 6 repeticiones
CD: 6 repeticiones + 7 repeticiones
DD: 7 repeticiones
AA AB
+
AC AD
BC
BD CD
7
6
5
4
10 min para Resolver
SNP:
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/snp
Polimorfismos de simple nucleótido
CTAGGCTCTAATGCCTGAA
CTAGGCTTTAATGCCTGAA
Haplotipo 1:
Haplotipo 2:
Haplotipo 3:
TTCGCGTGTCCGTAATGCTGATGA
TTCGCGTGTCCGGAATGCTGCTGA
TTCGCATGTCCGTAATGCTGCTGA
G/A
T/G
A/C
RFLP: Variación en sitios de corte de enzimas de
restricción




Enzima de restricción
sonda
sonda
3 genotipos posibles
AA
AB
BB
AA
2 cortos
1 corto y 1 largo
2 largos
+
Electroforesis +
hibridación con sonda
(Southern blot)
AB
BB
RFLP: Variación en sitios de corte de enzimas de
restricción




Enzima de restricción
sonda
sonda
3 genotipos posibles
AA
AB
BB
AA
2 cortos
1 corto y 1 largo
2 largos
+
Electroforesis +
hibridación con sonda
(Southern blot)
AB
BB
RFLP: Ejemplo (detección de HbS)
Porción de DNA
del cromosoma 11

intrón Aexón 2 ...


exón 1
Alelo A
bA-globina
NORMAL
CCTTAGG CCTGAGG
CCTGAGG
dianas de Mst II
Alelo A
bS-globina
FALCIFORME
CCTTAGG CCTGAGG
CCTGAGG
dianas de Mst II
1,2 kb
0,2 kb
Digestión con Mst II
Sonda 1
AA
AS
Sonda 2
SS
AA
AS
SS
1,4 kb
1,2 kb
1,4 kb
1,2 kb
0,2 kb
0,2 kb
PCR-RFLP: análisis de sitios de restricción
Fragmento del gen X
intrón A

exón 1
Alelo A
Mst II
CCTGAGG
Alelo B
CCTTAGG
1,2 kb
AA
0,2 kb
Digestión con Mst II
AB
BB
1,4 kb
1,2 kb
0,2 kb
exón 2
15 min para Resolver
El polimorfismo A>G en el codón 655 del gen que codifica para la
región
transmenbrana
del
receptor
HER2
provoca
un
cambio aminoacídico de Ile>Val que impulsaría la actividad tirosina quinasa
del receptor de manera constitutiva. Como HER2 es el recepetor del factor
de crecimiento, su actividad constitutiva implicaría que envié señales al
nucleo activando genes involucrados en la proliferación celular. Las células
con este polimorfismo crecen descontroladamente generando tumores que
pueden derivar en un cáncer epitelial u otro dependiendo de donde se
produce el crecimiento descontrolado.
Producto de PCR: 300 pb
En sitio de reconocimiento para la enzima se encuentra G originado un
fragmento de 150 y otro de 200 pb.
Esquematice todos los posibles resultados que obtendría al realizar la
digestión con la enzima de restricción definiendo todos los genotipos
posibles.
Marcadores para genomas desconocidos
• Cuando no se disponen de datos genómicos.
• Asociación fortuita con fenotipos, pero de
base genómica.
• Identificación de especies, variedades, grupos
poblacionales acorde con el grado de
polimorfismo
 RAPD
Amplificación y análisis del rDNA
Marcadores de expresión: mRNA
Aplicaciones:
• análisis filogenético
•selección asistida por marcador
•pruebas de paternidad y trazabilidad de los alimentos
•Estudios de linfomas, sarcomas y otros tumores.
•Estudios de genes supresores de tumores y oncogenes.
• Agentes infecciosos
• Estudios de identidad
•etc…
…en conclusión
• Los marcadores moleculares constituyen
una herramienta de la Biología Molecular
que permiten el análisis del genoma a
través de diferentes estrategias.
Enlaces que se utilizaron en el diseño
Modern Genetic Analysis.
Griffiths, Anthony J.F.; Gelbart, William M.; Miller, Jeffrey H.; Lewontin, Richard C.
New York: W. H. Freeman & Co.; c1999.
Molecular Biology of the Cell. 3rd ed.
Alberts, Bruce; Bray, Dennis; Lewis, Julian; Raff, Martin; Roberts, Keith; Watson, James D.
New York and London: Garland Publishing; c1994.
Molecular Cell Biology. 4th ed.
Lodish, Harvey; Berk, Arnold; Zipursky, S. Lawrence; Matsudaira, Paul; Baltimore, David; Darnell, James E.
New York: W. H. Freeman & Co.; c1999.
Human Molecular Genetics 2. 2nd ed.
Strachan, Tom and Read, Andrew P.
Oxford, UK: BIOS Scientific Publishers Ltd; 1999.
Genomes. 2nd ed.
Brown, T. A.
Oxford, UK: BIOS Scientific Publishers Ltd; 2002