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INGENIERÍA GENÉTICA TÉCNICAS Y APLICACIONES INGENIERÍA GENÉTICA La ingeniería genética es el conjunto de métodos y técnicas que permiten el acceso y la manipulación del ADN y su introducción en otrod organismos. Organismos transgénicos son aquellos que han sido modificados por ingeniería genética. Obtención de ADN recombinante Clonación de ADN PCR Secuenciación de ADN INGENIERÍA GENÉTICA: TÉCNICAS BÁSICAS OBTENCIÓN DE ADN RECOMBINANTE La molécula de ADN se corta y los fragmentos de interés se introducen en otro organismo mediante un vector. INGENIERÍA GENÉTICA: TÉCNICAS BÁSICAS OBTENCIÓN DE ADN RECOMBINANTE Puede realizarse mediante distintos procedimientos: Tecnología del ADN recombinante Formación de un ADN complementario por HIBRIDACIÓN Síntesis de un ADNc a partir de un molde ARNm INGENIERÍA GENÉTICA: TÉCNICAS BÁSICAS OBTENCIÓN DE ADN RECOMBINANTE: TECNOLOGÍA DEL ADN RECOMBINANTE. La molécula de ADN se corta por lugares concretos gracias a las enzimas o endonucleasas de restricción: Reconocen en el ADN pequeñas secuencias de bases denominadas sitios de restricción, que suelen ser secuencias palindrómicas (se leen igual en ambas hebras). El corte se produce en ambas hebras, por hidrólisis de los enlaces fosfodiéster que unen a los nucleótidos entre sí. Tras el corte en el sitio de restricción, queda al menos un extremo monocatenario cohesivo o pegajoso, que podrá unirse con otra secuencia de bases complementaria. INGENIERÍA GENÉTICA: TÉCNICAS BÁSICAS OBTENCIÓN DE ADN RECOMBINANTE: TECNOLOGÍA DEL ADN RECOMBINANTE. Moléculas de distinto origen cortadas con una misma enzima de restricción, podrán unirse por sus extremos cohesivos. Las uniones se sueldan de forma permanente mediante una ADN ligasa. INGENIERÍA GENÉTICA: TÉCNICAS BÁSICAS OBTENCIÓN DE ADN RECOMBINANTE: TECNOLOGÍA DEL ADN RECOMBINANTE. Como resultado, obtendremos un ADN recombinante o transgén que podremos incorporar a otros organismos (E. coli, frecuentemente) en los que expresará su información. INGENIERÍA GENÉTICA: TÉCNICAS BÁSICAS OBTENCIÓN DE ADN RECOMBINANTE: TECNOLOGÍA DEL ADN RECOMBINANTE. Eco RI Eco RI ADN recombinante INGENIERÍA GENÉTICA: TÉCNICAS BÁSICAS OBTENCIÓN DE ADN RECOMBINANTE: FORMACIÓN DE UN ADN COMPLEMENTARIO POR HIBRIDACIÓN. Alterando las condiciones fisiológicas de temperatura y pH, el ADN se desnaturaliza y se separan las dos hebras de la doble hélice. Manteniendo la temperatura a 65º se produce el proceso inverso de renaturalización o hibridación y vuelve a formarse la doble hélice. Mediante este procedimiento pueden obtenerse moléculas híbridas, a partir de dos hebras de cualquier ácido nucleico con cierta complementariedad de bases. INGENIERÍA GENÉTICA: TÉCNICAS BÁSICAS OBTENCIÓN DE ADN RECOMBINANTE: FORMACIÓN DE UN ADN COMPLEMENTARIO POR HIBRIDACIÓN. A mayor relación o complementariedad de bases entre dos secuencias de ácidos nucleicos, mayor hibridación. INGENIERÍA GENÉTICA: TÉCNICAS BÁSICAS OBTENCIÓN DE ADN RECOMBINANTE: FORMACIÓN DE UN ADN COMPLEMENTARIO POR HIBRIDACIÓN. UTILIDADES Y APLICACIONES Detección de secuencias complementarias. Localización de genes relacionados en distintas especies o poblaciones. Diagnóstico de enfermedades genéticas. INGENIERÍA GENÉTICA: TÉCNICAS BÁSICAS OBTENCIÓN DE ADN RECOMBINANTE: SÍNTESIS DE UN ADNc A PARTIR DE UN MOLDE ARNm. La enzima transcriptasa inversa o retrotranscriptasa puede sintetizar ADN complementario (ADNc) a partir de un molde de ARNm maduro. El ADNc sirve como molde para la síntesis de la hebra complementaria, obteniéndose ADN bicatenario. AAAAAA 3’ 5’ TTTTTT 5’ 5’ Transcriptasa inversa AAAAAA 3’ 3’ TTTTTT 5’ ADNc Degradación del ARN TTTTTT 5’ 3’ Nucleasa S1 elimina el bucle Síntesis de la otra cadena de ADN ADN polimerasa I ADN de doble cadena INGENIERÍA GENÉTICA: TÉCNICAS BÁSICAS OBTENCIÓN DE ADN RECOMBINANTE: ADN SINTÉTICO. Mediante secuenciadores automáticos, es posible sintetizar directamente fragmentos de ADN a la carta (limitación de unos 100 nucleótidos de longitud de hebra). INGENIERÍA GENÉTICA: TÉCNICAS BÁSICAS CLONACIÓN DEL ADN La clonación es un proceso natural que consiste en la producción de individuos genéticamente idénticos (mediante reproducción asexual). Dolly fue el primer mamífero clonado. Vivió siete años (19962003), mientras que una oveja normal vive entre 18 y 20 años. INGENIERÍA GENÉTICA: TÉCNICAS BÁSICAS CLONACIÓN DEL ADN: Dolly no fue la primera y tras ella llegaron otras muchas clonaciones. ¿Seré yo el próximo? INGENIERÍA GENÉTICA: TÉCNICAS BÁSICAS CLONACIÓN DEL ADN Referido al ADN, consiste en producir múltiples copias de un gen específico o de un fragmento de ADN, en el interior de un organismo hospedador. INGENIERÍA GENÉTICA: TÉCNICAS BÁSICAS CLONACIÓN DEL ADN Las condiciones que debe cumplir el hospedador son: De crecimiento rápido. No patógeno Que favorezca la entrada del transgén. Ampliamente estudiado y fácil de manipular (Ej.: Escherichia coli) INGENIERÍA GENÉTICA: TÉCNICAS BÁSICAS CLONACIÓN DEL ADN VECTORES DE CLONACIÓN: Son moléculas que pueden transportar ADN extraño al interior del hospedador y replicarse en él. Contienen su propio origen de replicación y genes marcadores que permiten identificarlos o seleccionarlos (bioluminiscencia, resistencia a antibióticos, etc.) Pueden ser: Plásmidos Virus bacteriófagos Cósmidos INGENIERÍA GENÉTICA: TÉCNICAS BÁSICAS CLONACIÓN DEL ADN VECTORES DE CLONACIÓN: PLÁSMIDOS Pequeñas moléculas de ADN bicatenario y circular que se localizan en las bacterias y no forman parte del cromosoma bacteriano. Tienen replicación independiente. Poseen puntos de corte específicos con enzimas de restricción. INGENIERÍA GENÉTICA: TÉCNICAS BÁSICAS CLONACIÓN DEL ADN VECTORES DE CLONACIÓN: VIRUS BACTERIÓFAGOS Son virus que infectan bacterias. Transportan genes bacterianos de una célula huésped a otra. Se emplean más frecuentemente los bacteriófagos lambda, capaces de llevar mayor cantidad de ADN que un plásmido. INGENIERÍA GENÉTICA: TÉCNICAS BÁSICAS CLONACIÓN DEL ADN VECTORES DE CLONACIÓN: CÓSMIDOS Son híbridos entre el fago lambda y un plásmido. Pueden replicarse en la célula como un plásmido o empaquetarse como un fago. INGENIERÍA GENÉTICA: TÉCNICAS BÁSICAS CLONACIÓN DEL ADN Se aísla en ADN humano y del plásmido. Se mezclan los fragmentos de ADN humano con los plásmidos, obteniéndose plásmidos recombinantes. Se mezclan los plásmidos con bacterias. Se siembran las bacterias sobre una placa Petri, con un antibiótico frente al que proporciona resistencia nuestro plásmido. INGENIERÍA GENÉTICA: TÉCNICAS BÁSICAS CLONACIÓN DEL ADN: Almacenamiento de genes clonados • Una genoteca es una colección de clones, cada uno de los cuales contiene un vector al que se le ha insertado un fragmento de ADN derivado del ADN o el ARN totales de la célula o tejido. • La colección de clones debería contener, teóricamente, todas las secuencias existentes en la fuente original de ADN, es decir, debería contener muestras de todo el ADN del organismo. • Para encontrar el gen de interés hay que utilizar sondas de ácidos nucleicos. INGENIERÍA GENÉTICA: TÉCNICAS BÁSICAS CLONACIÓN DEL ADN: Para encontrar el gen de interés hay que utilizar sondas de ácidos nucleicos. Una vez localizadas las colonias que contienen el gen de interés, se cultivan en gran cantidad. INGENIERÍA GENÉTICA: TÉCNICAS BÁSICAS REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA:PCR Técnica desarrollada en 1983, de enorme impacto en la investigación biológica. Permite amplificar en poco tiempo muestras muy pequeñas de ADN. La PCR permitió la secuenciación del genoma completo de la momia de Ötzi, el 'Hombre de los hielos', un individuo de hace 5.300 años cuyo cuerpo se halló congelado en los Alpes italianos en 1991. La PCR se utiliza en el diagnóstico del virus del Ébola. Sin PCR no habria 14 temporadas de CSI-Miami. INGENIERÍA GENÉTICA: TÉCNICAS BÁSICAS REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA:PCR Es un proceso cíclico en el que ocurre: Desnaturalización: la molécula de ADN que va a copiarse se calienta para que se separen las dos hebras (moldes). Hibridación: se enfría la mezcla para que los cebadores se unan a a los extremos de ambas hebras. Extensión: la ADN-polimerasa copia ambas hebras a partir del extremo 3´de los cebadores. http://www.maxanim.com/genetics/PCR/pcr.swf INGENIERÍA GENÉTICA: TÉCNICAS BÁSICAS SECUENCIACIÓN DEL ADN Método del didesoxi de Sanger – método de la interrupción controlada de la replicación enzimática (de la polimerización de DNA). Elementos necesarios: ADN polimerasa Oligonucleótido (cebador) complementario al extremo 3’ del fragmento de DNA que queremos secuenciar. Desoxirribonucleótidos trifosfato y Didesoxirribonucleótidos trifosfato (ddATP* o ddCCTP* o ddGTP* o ddTTP* marcados con una molécula fluorescente). INGENIERÍA GENÉTICA: TÉCNICAS BÁSICAS SECUENCIACIÓN DEL ADN El ADN se desnaturaliza y se mezcla con el resto de los componentes de la reacción. Comienza la síntesis de ADN, que termina cuando la ADN polimerasa incorpora un ddNTP marcado. INGENIERÍA GENÉTICA: TÉCNICAS BÁSICAS SECUENCIACIÓN DEL ADN Se obtienen fragmentos de distinta longitud, todos ellos acabados en un ddNTP*. INGENIERÍA GENÉTICA: TÉCNICAS BÁSICAS SECUENCIACIÓN DEL ADN Un detector identifica cada uno de los ddNTP* finales gracias al color. El espectrograma resultante nos indica la secuencia de bases. http://smcg.ccg.unam.mx/enp-unam/03EstructuraDelGenoma/animaciones/secuencia.swf INGENIERÍA GENÉTICA: APLICACIONES Medicina • Diagnóstico de enfermedades / Terapia génica • Medicina forense • Producción de medicamentos y vacunas Agricultura • Plantas resistentes • Mejora del producto • “Fábricas” de medicamentos Ganadería • Mejora del rendimiento • Obtención de órganos • Obtención de medicamentos Medio ambiente • Biorremediación • Bioadsorción INGENIERÍA GENÉTICA: APLICACIONES APLICACIONES EN MEDICINA Obtención de productos farmacéuticos Medicina forense Diagnostico de enfermedades Terapia génica Insulina Huella genética Clonación de genes Ex vivo Hormona de crecimiento Marcadores genéticos Identificación en el enfermo In vivo Identificación en portadores In situ Vacunas INGENIERÍA GENÉTICA: APLICACIONES APLICACIONES EN MEDICINA Obtención de productos farmacéuticos Insulina Hormona de crecimiento Vacunas El interferón se utiliza como tratamiento de la esclerosis múltiple, con un coste anual por paciente de entre 9000-17000 euros al año. INGENIERÍA GENÉTICA: APLICACIONES APLICACIONES EN MEDICINA Los seres humanos difieren en un 0.1% del genoma. Estas diferencias están localizadas en regiones cromosómicas concretas que se usan como marcadores genéticos. Con la identificación de los marcadores se hace la huella genética (método de Southern blot) La comparación de huellas genéticas permite hacer análisis de paternidad y resolver casos policiales. Medicina forense Huella genética Marcadores genéticos INGENIERÍA GENÉTICA: APLICACIONES APLICACIONES EN MEDICINA Southern Blot: buscando en el ADN INGENIERÍA GENÉTICA: APLICACIONES Diagnóstico prenatal Diagnostico de enfermedades Clonación de genes Identificación en el enfermo Ej.: Síndrome del X-frágil (secuencias repetidas en el cromosoma X), Síndrome del maullido del gato (deleción en el brazo corto del cromosoma 5). Medicina preventiva: Identificación en portadores Ej: Detección de una mutación en la secuencia del gen BRCA1, un cambio que aumenta drásticamente las posibilidades de desarrollar cáncer de mama y ovarios en mujeres. INGENIERÍA GENÉTICA: APLICACIONES Consiste en la inserción de un gen funcional en las células del paciente para corregir un defecto genético o dotar a las células de una nueva función. Terapia génica Aunque los tratamientos no siempre han sido exitosos, en algunos casos la terapia génica ha logrado restaurar la función inmune en pacientes con inmunodeficiencia severa combinada (niños burbuja). Ex vivo: células del paciente extraídas y corregidas en el laboratorio. In vivo: transferencia de genes terapéuticos mediante un vector, al paciente In situ: introduciendo genes funcionales directamente, en las células del paciente. INGENIERÍA GENÉTICA: APLICACIONES APLICACIONES EN AGRICULTURA Resistencia a herbicidas Mejora del producto Plantas farmacéuticas (utilizadas para la fabricación de sustancias de interés en la industria farmacéutica). Arroz dorado, que contiene un precursor de la vitamina A) El cultivo de algodón transgénico está prohibido en la Unión Europea. Lo importamos de los Estados Unidos para crear, entre otras cosas, los billetes de euro. INGENIERÍA GENÉTICA: APLICACIONES APLICACIONES EN GANADERÍA Mayor productividad Mejora de la calidad Crecimiento más rápido Cerdos que producen grasas con Omega 3 Vacas que producen leche de fórmula para bebés. INGENIERÍA GENÉTICA: APLICACIONES APLICACIONES EN MEDIO AMBIENTE Biorremediación: Bacterias que degradan materia orgánica con mejor rendimiento o en condiciones adversas. Bioadsorción: Bacterias que adsorben (fijan en su superficie) metales o sustancias contaminantes (suelos contaminados). INGENIERÍA GENÉTICA: APLICACIONES PROYECTO GENOMA HUMANO En 1980, científicos de todo el mundo decidieron secuenciar el genoma humano. En 1988, el Congreso de los EEUU autorizó su financiación y puso al frente a James Watson. En 1990 nace el PGH (Proyecto Genoma Humano), cuyo objetivo era secuenciarlo por completo e identificar todos sus genes. En 2003 concluye, con la secuenciación completa del genoma humano. OTRAS DISCIPLINAS QUE SURGEN DE LA INGENIERÍA GENÉTICA LA PROTEÓMICA: Proteoma: Conjunto de proteínas de un genoma, una célula o un tejido. Proteómica: Disciplina que estudia, desde el punto de vista estructural y funcional, todas las proteínas codificadas por el genoma completo de un organismo. Fundamental para comprender el funcionamiento celular y del organismo.