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Infección de cultivos celulares por el
virus de la hepatitis C
Identificación de nuevas dianas y compuestos antivirales
Curso de Hepatología Básica-AEEH
Pablo Gastaminza, Madrid, 22-2-2013
Contenidos:
Introducción: Virología de VHC
Estructura genómica
Ciclo de replicación
Modelo de Infección Basado en JFH-1:
Principios y componentes
Aplicaciones
Aspectos fundamentales
Identificación de nuevas dianas
Rastreo de compuestos antivirales
Conclusiones y Perspectivas
Modelos Experimentales en Virología
Hospedador Natural
Cultivo Celular
Modelos in vivo
Hospedador Natural
Modelos animales pequeños
Cultivos Celulares
Susceptibles
Modelos en primates
Epidemiología
Genética viral
Patogénesis
Immunología
Genética reversa
Factores celulares
Antivirales
Patogénesis
Immunología
Vacunas
Antivirales
(seguridad, eficacia)
Modelos Experimentales en VHC
Hospedador Natural
Cultivo Celular
Modelos in vivo
Hospedador Natural
Ratones inmunoKO quiméricos
Hepatocitos primarios
(alta variabilidad y acceso limitado)
Epidemiología
Genética viral
Patogénesis
Immunología
Genética reversa
Factores celulares
Antivirales
Chimpancés
Patogénesis
Immunología
Vacunas
Antivirales
(seguridad, eficacia)
Hepatitis C Virus (Flaviviridae)
Virión
Replicasa
Ensamblaje
Hepatitis C Virus (Flaviviridae)
Virión
Replicasa
Ensamblaje
Ciclo de Infección de VHC
HCVpp
Bartosch et al J Exp Med 2003
Hsu et al J Virol 2003
CLDN1
OCDN1
Ciclo de Infección de VHC
CLDN1
OCDN1
REPLICONS
Lohman et al. Science 1999
Blight et al. Science 2000
Replicones para identificar inhibidores de VHC
5’UTR
Luc
IRES
NS3-NS5B
Electroporation
into Huh-7 cells
Luciferase Activity
3’UTR
Relative Luciferase Activity (LOG)
Transfección de ARN subgenómico en células Huh-7
2.5 Luciferase Activity
DMSO
2
2mAde
1.5
1
0.5
0
5
10
24
Hours post-transfection
48
Ciclo de Infección de VHC
CLDN1
OCDN1
HCV INFECTION CELL CULTURE MODEL (JFH-1)
Wakita et al. Nature Med 2005
Lindenbach et al. Science 2005
Zhong et al. PNAS 2005
Contenidos:
Introducción: Virología de VHC
Estructura genómica
Ciclo de replicación
Modelo de Infección Basado en JFH-1:
Principios y componentes
Aplicaciones
Aspectos fundamentales
Identificación de nuevas dianas
Rastreo de compuestos antivirales
Conclusiones y Perspectivas
Células Susceptibles (Huh-7 y Derivados)
Obtenidas por cultivo primario de un hepatocarcinoma bien diferenciado
de un paciente japonés de 57 años
(Nakabayashi et al. Cancer Research 1982)
Línea celular capaz de sostener la replicación de replicones de VHC
(Lohmann et al 1999; Blight et al. 2000)
Subclones de la línea Huh-7 (Huh-7.5) obtenidos por selección de células
con mayor capacidad de replicación de replicones de VHC.
(Blight et al.2002)
Clon molecular infeccioso JFH-1 (2a)
Japonese patient
with Fulminant
Hepatitis
Sequencing of
different
quasispecies
Dr. Takaji Wakita
Construction of a consensus
molecular clone (JFH-1)
Rescate de virus infeccioso a partir de cDNA de JFH-1
Clon Molecular
(cDNA)
Transcripción
In vitro
ARN
Genómico
(desnudo)
VIRUS RECOMBINANTE=OMG: LABORATORIO P3 !!!
Transfección
Virus infeccioso en
cultivo y en
modelos animales
Producción de Virus Infeccioso en Cultivo
cDNA
(plásmido
bacteriano)
vRNA
JFH-1
Transfección
Huh-7
Huh-7.5.1
Líneas de
hepatoma humano
Sobrenadante
Sin diluir
1:10
1:100
NS5A
nucleo
Undiluted
1:10
1:100
La infectividad se expresa como unidades formadoras de foco por mililitro (ffu/ml)
Propagación de Virus Infeccioso en Cultivo
5
Diluted
supernatant
JFH-1 RNA
Transfection
Huh-7
Huh-7.5.1
Infection
Infectivity ( log ffu/ml)
Huh-7
Huh-7.5.1
Supernatant
Infectivity
4
3
2
1
0
day 3
day 8
5
10
Days post-infection
15
Características Básicas de Viriones de VHC
Gastaminza et al. J Virol 2010
Estructura 3D de Complejos de Replicación
Romero-Brey I. Plos Pathogens 2012
Estudios de Genética Inversa
Clon Molecular
(cDNA)
Transcripción
In vitro
MUTACIÓN
ARN
Genómico
(desnudo)
Transfección
FENOTIPO
Mutaciones en regiones del genoma viral de
función desconocida
Crecimiento del virus
Mutaciones que aparecen como consecuencia de
tratamientos farmacológicos.
Resistencia a fármacos
Genética Inversa De La Viroporina P7
Steinmann et al Plos Pathogens 2007
Factores Celulares Implicados en la Infección por VHC
Clon Molecular
(cDNA)
Transcripción
In vitro
MUTACIÓN
ARN
Genómico
(desnudo)
Transfección
FENOTIPO
Silenciamiento (RNAi) y sobreexpresión de genes celulares
Inhibidores de procesos celulares conocidos
Factores Celulares Implicados en la Infección por VHC
AUTOFAGIA
Dreux M et al. PNAS 2009;106:14046-14051
BIOGÉNESIS DE VLDL
Gastaminza P. et al.J Virol. 2008 March; 82(5): 2120–2129.
Visualización de la Infección en Tiempo Real
Marcador de Infección
Marcador Celular de Interés
Realizado en la Unidad de
Microscopía Confocal
CNB-CSIC
Metodología en
Jones et al. Nat Prot 2010
Identificación De Nuevos Compuestos Antivirales
Rastreo de colecciones de compuestos
Identificar compuestos químicos no tóxicos con actividad frente a VHC:
Para utilizarlos como herramientas para estudios básicos.
Para identicar moléculas con potencial terapéutico.
Gastaminza et al. PNAS 2010
Rastreo De Colecciones De Compuestos
Con Potencial Antiviral
Gastaminza et al. PNAS 2010
Fármacos de uso clínico con actividad Antiviral
Cyproheptadine
Toremifene
Fluphenazine
Trifluoperazine
Pizotyline
Pterostilbene
CGS 12066B
Prochlorperazine
Rabeprazole
Doxepin
Ketotifen
MK886
CPD000058431
CPD000469213
CPD000058411
CPD000059133
CPD000466272
CPD000440694
CPD000468733
CPD000466275
CPD000469174
CPD000449270
CPD000058462
CPD000466278
Amiodarone
Nafadotride
Imatinib
Lacidipine
SB 205607
Lofepramine
Rimcazole
Mifepristone
Clobenpropit
Salmeterol
Azelastine
Desloratadine
AM-251
Rifabutin
Indatraline
Nelfinavir
Haloperidol
Benproperine
Methyl Paroxetine
Ezetimibe
Carvedilol
Calcipotriol
Efevirenz
Ritonavir
Nitazoxanide
CPD000058296
CPD000466292
CPD000469175
CPD000466342
CPD000466296
CPD000469292
CPD000466293
CPD000058481
CPD000469632
CPD000466295
CPD000469183
CPD000149358
CPD000466284
CPD000466322
CPD000449273
CPD000469186
CPD000449283
CPD000469294
CPD000469181
CPD000466334
CPD000449280
CPD000466353
CPD000466351
CPD000466395
CPD000466367
EC50 Error
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0.2
0.5
0.0
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0.3
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0.1
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0.1
1.0
0.0
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0.7
1.6
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4.0
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4.9
3.1
2.1
0.1
0.9
1.5
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1.8
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2.3
1.5
2.3
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3.5
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2.3
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0.0
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0.3
1.5
1.3
0.0
0.3
0.8
0.5
1.1
0.2
1.4
3.0
0.1
0.3
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1.0
0.4
0.5
0.5
3.4
0.4
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LD50
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2.0
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Step Targeted
Entry
Entry/Replication/Secretion
Entry
Entry
Entry
Assembly
Entry
Entry
Unknown
Entry
Entry
Replication
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0.0
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6.0
0.0
7.5
0.8
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4.0
2.5
4.6
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2.2
4.7
Entry
nd
Entry
nd
Entry
Entry
Entry
Replication
Entry
Entry
Entry
Entry
Assembly
nd
Entry
Replication
Entry
Entry
Entry
Entry
nd
nd
nd
nd
nd
Reported
Antiviral
activity
EBV
Clathrin
HCV
SARS
HIV-HCV?
HCV-HIV
EBV
HIV
HIV
HCV
Gastaminza et al. PNAS 2010
Descubrimiento De Nuevos Compuestos Antivirales
Screening de compuestos de actividad desconocida
Compuesto
PNAS Dic 2007
Modo de acción
Viricida
(no específico)
Péptido lineal
Chemistry and Biology 2011
Péptido cíclico
Entrada viral
(específico)
J Virol Jun 2011
Moléculas bajo Pm
Iniciación de la
replicación
(específico)
Sistema JFH-1 de Infección en Cultivo
Permite medir infectividad de muestras generadas en diferentes
condiciones experimentales (antes solo posible en chimpancés)
Permite manipular la información genética del virus y analizar las
consecuencias de dichos cambios en cualquier aspecto de la infección
(genética inversa)
Permite el estudio fenotípico de un virus en cultivos celulares
sometidos a variaciones experimentales controladas: silenciamiento
génico, tratamientos farmacológicos, etc…
No permite el estudio sistemático de cualquier aislado clínico de VHC,
aunque se han generado virus quiméricos que producen viriones de
diversos genotipos.
Depende de líneas celulares transformadas con escasa diferenciación
hepática.
RELEVANCIA???
Futuros Desafíos
Desarrollo de un sistema de infección con aislados primarios de
pacientes: línea(s) celular(es) susceptibles.
Desarrollo de un sistema de infección para otros genotipos:
clones infecciosos en cultivo celular.
Agradecimientos
Lidia
Mingorance
Martina
Friesland
Claudia
Vasallo
Gema Calvo Chiara Sorbo
http://www.cnb.csic.es/index.php/es/home/bio1/infeccion-por-el-virus-de-la-hepatitis-c.html