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DEPARTAMENTO DE CIENCIAS DE LA VIDA
INGENIERÍA EN BIOTECNOLOGÍA
EVALUACIÓN DE BIOAEROSOLES, BACTERIAS Y
HONGOS, EN EL LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA –
BIOTECNOLOGÍA DE LA ESPE Y CONSTRUCCIÓN PREVIA
DE UN MUESTREADOR DE BURBUJEO EXPERIMENTAL.
Tesista:
Directora:
Codirector:
Andrés López M.
M. Sc. Alma Koch
Ing. Mat. Pedro Romero
I. INTRODUCCIÓN
Problemática
Bioaerosoles
Conjunto de partículas en suspensión de origen
biológico variable en un medio gaseoso
0,001 – 1 µm
1 – 5 µm
5 – 10 µm
Tamaño
Fuentes
Trabajadores
Asociados a
• Enfermedades
• Rol ecológico
I. INTRODUCCIÓN
2. Objetivos de la Investigación
Objetivo General
Evaluar los bioaerosoles (bacterias y hongos) en el Laboratorio de Microbiología Biotecnología de la ESPE y construir previamente un muestreador de burbujeo
experimental.
Objetivos Específicos
1. Determinar la existencia de bioaerosoles.
2. Establecer las posibles fuentes de emisión
de bioaerosoles.
3. Evaluar tareas y puestos de trabajo y su
relación con los bioaerosoles.
4. Construir un muestreador de burbujeo
experimental en base al diseño de
Agranovski et al. (2002).
5. Tomar muestras de bioaerosoles con el
muestreador de burbujeo experimental
(Agranovski et al., 2002).
6. Identificar las muestras de bioaerosoles
recolectadas usando técnicas de cultivo
convencionales.
7. Cuantificar la concentración de bioaerosoles.
8. Documentar la presencia de bioaerosoles.
I. INTRODUCCIÓN
3. Hipótesis
Hipótesis nula
• La presencia de bioaerosoles, bacterias y hongos en el Laboratorio
de Microbiología - Biotecnología de la ESPE no es significativa.
Hipótesis alternativa
• La presencia de bioaerosoles, bacterias y hongos en el Laboratorio
de Microbiología - Biotecnología de la ESPE es significativa.
II. MATERIALES Y MÉTODOS
1. Participantes
Tesista:
Directora:
Codirector:
Andrés López M.
M. Sc. Alma Koch
Ing. Mat. Pedro Romero
Área de Investigaciones
Área de Docencia
Personal del Laboratorio
Estudiantes
Centro de Investigaciones Científicas
(CEINCI) de la ESPE
Área de Biología Molecular
2. Zona de Estudio
Investigación de campo y análisis de
laboratorio:
Laboratorio de Microbiología - Biotecnología
de la ESPE (constituido por tres áreas).
II. MATERIALES Y MÉTODOS
Laboratorio de Microbiología - Biotecnología de la ESPE.
Área de Investigaciones, Área A.
Área aproximada de 30,16 m2
II. MATERIALES Y MÉTODOS
Laboratorio de Microbiología - Biotecnología de la ESPE.
Área de Docencia, Área B.
Área aproximada de 53,65 m2
II. MATERIALES Y MÉTODOS
Laboratorio de Microbiología - Biotecnología de la ESPE.
Área de Biología Molecular, Área C.
Área aproximada de 46,34 m2
II. MATERIALES Y MÉTODOS
3. Diseño experimental (Gutiérrez & De La Vara, 2008).
Diseño de bloques completos al azar (DBCA)
Modelo estadístico
Pruebas
• LSD de Fisher
• Shapiro Wilks
• Levene
• Independencia
Hipótesis
Arreglo de los datos en el DBCA para la investigación
Número de tratamientos
3 áreas x 3 días x duplicado = 18
II. MATERIALES Y MÉTODOS
4. Procedimientos
Construcción del
muestreador
experimental
•De acuerdo al diseño de
Agranovski et al. (2002), con
modificaciones
Muestreo de bioaerosoles
(bacterias y hongos)
•De acuerdo a la norma NIOSH
0800 Bioerosols Sampling, con
modificaciones
Inspección detallada del
edificio
•Inspección exterior
•Inspección interior
Determinación de las
concentraciones de
bioaerosoles
•Partículas totales
•Bioaerosoles viables y no viables
•UFC/m3
Descripción de
actividades del área de
trabajo
•Identificar los posibles
mecanismos de propagación de
bioaerosoles
Identificación de los
bioaerosoles muestreados
•Mediante técnicas de
Microbiología tradicional
•Bacterias (Género y especie)
•Hongos (Género)
II. MATERIALES Y MÉTODOS
4.1. Construcción del muestreador experimental
Diseño
Muestreadores experimentales construidos
Material de
construcción
Acrílico
(b)
Esquema del muestreador: (a) vista tridimensional y
vista lateral, y (b) vista de planta (Agranovski,
Agranovski, Reponen, Willeke, & Grinshpun, 2002)
Material de
construcción
PVC
II. MATERIALES Y MÉTODOS
4.1. Construcción del muestreador experimental
Principio de funcionamiento
Producción de burbujas para fotografías
(Agranovski, Braddock, & Myojo, 1999)
Muestreador en funcionamiento
Absorción de aerosoles en burbujeo
• Circulación de aire en el interior de la burbuja
• Deposición inercial
• Sedimentación
• Difusión
II. MATERIALES Y MÉTODOS
4.2. Inspección detallada del
edificio (exterior e interior)
4.3. Descripción de actividades
del área de trabajo
Registro de inspección exterior e interior
Registro de actividades durante la evaluación
II. MATERIALES Y MÉTODOS
4.4. Muestreo de bioaerosoles (bacterias y hongos)
Tipos de bioaerosoles a muestrear
Bacterias y hongos
Puntos de muestreo
2 puntos de muestreo por cada área
Número de muestras
3 áreas x 3 días x duplicado = 18
Tiempo y flujo de muestreo
• 8 h continuas diarias
• 4 L/min
Temperatura, humedad relativa
y presión atmosférica
Fluido de recolección
Tripticase Soy Broth (TSB)
Medios de cultivo
• Bacterias  Tripticase Soy Agar (TSA) con
0,04% de actidiona
• Hongos  Malt Extract Agar (MEA) con
0,01% de cloranfenicol
Registro muestreo de bioaerosoles
II. MATERIALES Y MÉTODOS
4.4. Muestreo de bioaerosoles (bacterias y hongos)
Limpieza y desinfección del equipo muestreador
Limpieza
Desinfección
Equipos muestreadores
sellados y listos
Preparación de los equipos muestreadores
Relleno del dispositivo muestreador de bioaerosoles con 40
mL de medio TSB mediante un dosificador
Equipos muestreadores B1, B2 y B3
con 40 mL de medio TSB listos
II. MATERIALES Y MÉTODOS
4.4. Muestreo de bioaerosoles (bacterias y hongos)
Uso del equipo muestreador In situ
Equipos muestreadores B1, B2 y B3
Bombas de succión de aire
Puntos de muestreo en área A
II. MATERIALES Y MÉTODOS
4.4. Muestreo de bioaerosoles (bacterias y hongos)
Uso del equipo muestreador In situ
Equipos muestreadores B1, B2 y B3
Puntos de muestreo en área B
Bombas de succión de aire
II. MATERIALES Y MÉTODOS
4.4. Muestreo de bioaerosoles (bacterias y hongos)
Uso del equipo muestreador In situ
Equipos muestreadores B1, B2 y B3
Puntos de muestreo en área C
Bombas de succión de aire
II. MATERIALES Y MÉTODOS
4.4. Muestreo de bioaerosoles (bacterias y hongos)
Procesamiento de las muestras de bioaerosoles
Volumen final (80 mL)
Equipos al finalizar la toma de muestras
División en alícuotas (40 mL)
Enjuague y recuperación
Refrigeración
II. MATERIALES Y MÉTODOS
4.5. Determinación de las concentraciones de bioaerosoles
Recuento total de partículas biológicas y no biológicas
Conteo en la Cámara de Neubauer
Recuento de bioaerosoles viables y no viables
Diluciones seriadas (10-1 y 10-3) y cultivo en
medios MEA y TSA
II. MATERIALES Y MÉTODOS
4.5. Determinación de las concentraciones de bioaerosoles
UFC/m3 de aire
(Agranovski, Agranovski, Reponen, Willeke, & Grinshpun, 2002)
Corrección de las mediciones observadas
(TULAS, 2011)
II. MATERIALES Y MÉTODOS
4.6. Identificación de los bioaerosoles muestreados
Selección de bioaerosoles (bacterias y hongos)
Evaluación morfológica, se
escogieron las colonias distintas
Aislamiento de bioaerosoles (bacterias y hongos)
Medios de cultivo
• Bacterias  Tripticase Soy Agar (TSA) con
0,04% de actidiona
• Hongos  Malt Extract Agar (MEA) con
0,01% de cloranfenicol
• Algunas bacterias y hongos  Potato
Dextrose Agar (PDA)
II. MATERIALES Y MÉTODOS
4.6. Identificación de los bioaerosoles muestreados
Bacterias
Hongos
•
•
•
•
•
Tinción Gram
Prueba de la Catalasa
Prueba de Oxidasa
•
•
Software Identax Bacterial identification
System
Evaluación macroscópica
Evaluación microscópica
• Técnica del celo
• Tinción de KOH y azul de
metileno modificada
• Tinción Gram
Determinación del género 
Bergey’s Manual of
Determinative Bacteriology,
2001
III. RESULTADOS Y DISCUSIÓN
1. Construcción previa del muestreador de burbujeo experimental
Equipos muestreadores B1, B2 y B3 (Agranovski et al., 2002) construidos para
la Evaluación de Bioaerosoles (bacterias y hongos)
III. RESULTADOS Y DISCUSIÓN
2. Inspecciones exterior e interior del edificio
• Buenas condiciones,
• Poco polvo
• No había evidencias visibles de fuentes
microbianas, nutrientes o agua.
Interior
• No existen sistemas de ventilación o
filtración de aire
• La infraestructura física (pisos,
mesas de trabajo, ventanas) no
cumplen con los requerimientos
adecuados para un laboratorio de
Microbiología.
Exterior
Área B
III. RESULTADOS Y DISCUSIÓN
3. Actividades en el entorno de trabajo
Área A
Área B
III. RESULTADOS Y DISCUSIÓN
3. Actividades en el entorno de trabajo
Área C
Acciones comunes
Movimiento del aire generado por
• Caminar
• Hablar
• Toser
• Estornudar
• Reaerolización de partículas del
piso y de las superficies
Fuentes:
• Bacterias  aire interior, ocupación
humana, sus actividades
• Hongos  aire exterior, plantas, suelo
III. RESULTADOS Y DISCUSIÓN
4. Temperatura, humedad relativa y presión atmosférica
Aumento temperatura
• Recuentos elevados de microorganismos
y esporas de hongos en el aire
Humedad relativa interior
• Desecación puede conducir a la pérdida
de viabilidad
III. RESULTADOS Y DISCUSIÓN
5. Recuento total de partículas biológicas y no biológicas
Observación de dos partículas (posibles bioaerosoles),
III. RESULTADOS Y DISCUSIÓN
6. Recuento de bioaerosoles viables y no viables
Conteo de bioaerosoles (bacterias y hongos) viables en el
contador de colonias Quebec
III. RESULTADOS Y DISCUSIÓN
7. Concentración de bioaerosoles, UFC/m3
Bacterias y hongos
ANOVA
Límites permisibles sugeridos
• Holanda  10000 UFC/m3
(p<0,05)
III. RESULTADOS Y DISCUSIÓN
7. Concentración de bioaerosoles, UFC/m3
Bacterias
ANOVA
Límites permisibles sugeridos
• Unión Europea  10000 UFC/m3
• OMS  500 UFC/m3
(p<0,05)
III. RESULTADOS Y DISCUSIÓN
7. Concentración de bioaerosoles, UFC/m3
Hongos
ANOVA
Límites permisibles sugeridos
• Unión Europea  10000 UFC/m3
(p<0,05)
III. RESULTADOS Y DISCUSIÓN
8. Selección de bioaerosoles (bacterias y hongos)
Selección de dos colonias distintas
de bioaerosoles (bacterias),
III. RESULTADOS Y DISCUSIÓN
8. Selección de bioaerosoles (bacterias y hongos)
Selección de una
colonia distinta de
bioaerosoles (bacterias
resistentes al
cloranfenicol),
Selección de la colonia del
bioaerosol hongo,
III. RESULTADOS Y DISCUSIÓN
9. Aislamiento de bioaerosoles (bacterias y hongos)
Medio TSA
Medio MEA
Medio PDA
III. RESULTADOS Y DISCUSIÓN
10. Identificación de los bioaerosoles bacterias
Pruebas bioquímicas
Antibiograma
Catalasa
Oxidasa
Identax
Tinción Gram
III. RESULTADOS Y DISCUSIÓN
10. Identificación de los bioaerosoles hongos
Tinción de KOH y azul de metileno
Hongo filamentoso
Técnica del celo (cinta adhesiva)
Tinción Gram
Bacterias resistentes
al cloranfenicol
Tinción de Azul de Lactofenol
III. RESULTADOS Y DISCUSIÓN
11. Localización de los bioaerosoles encontrados
Área de Investigaciones
7 especies
8 bacterias
III. RESULTADOS Y DISCUSIÓN
11. Localización de los bioaerosoles encontrados
Área de Docencia
11 especies
1 género
15 bacterias
1 hongo
III. RESULTADOS Y DISCUSIÓN
11. Localización de los bioaerosoles encontrados
Área de Biología Molecular
16 especies
18 bacterias
IV. CONCLUSIONES
•
Las posibles fuentes de emisión de los bioaerosoles encontrados fueron el movimiento del aire
generado por las personas al caminar, al hablar, toser, estornudar, la reaerolización de
partículas del piso y de las superficies y también el aire proveniente del ambiente exterior.
•
Se analizaron las tareas y puestos de trabajo durante la evaluación de bioaerosoles y se
descubrió que la apertura y cierre de puertas constituye la acción predominante que
probablemente permite la proliferación de los bioaerosoles, además de la presencia de seres
humanos, otras actividades y el aire exterior.
•
La viabilidad de los bioaerosoles en las tres áreas analizadas se mantuvo entre 0,654% y
2,386% y los factores principales que posiblemente los afectaron son la humedad y la
temperatura ambiental durante la evaluación.
•
El área de Biología Molecular registró la mayor concentración de bioaerosoles, la de Docencia
mostró una concentración intermedia y la de Investigaciones reveló la menor concentración.
IV. CONCLUSIONES
•
Se evidenció que casi todas las concentraciones de bioaerosoles detectadas excedieron los límites
sugeridos por la Organización Mundial de la Salud, la Unión Europea, y Holanda.
•
De las tres áreas del Laboratorio de Microbiología - Biotecnología se aislaron 42 bioaerosoles (41
bacterias y 1 hongo), 38 bioaerosoles bacterias fueron bacilos Gram negativos, mientras que 3
fueron bacilos Gram positivos, de igual manera se halló un sólo bioaerosol hongo filamentoso.
Los bioaerosoles bacterias fueron predominantes sobre los hongos.
•
Sobre los géneros de bioaerosoles descubiertos se obtuvo que 2 son de Enterobacter, 3 de
Yersinia, 1 de Serratia, 5 de Ewingella, 4 de Burkholderia, 1 de Klebsiella, 2 de Proteus, 19 de
Pseudomonas, 1 de Hafnia, 3 de Bacillus y 1 de Alternaria spp.
•
Se comprobó que la presencia de bioaerosoles, bacterias y hongos, en el Laboratorio de
Microbiología - Biotecnología de la ESPE es significativa.
V. RECOMENDACIONES
Se debería:
• Ampliar la información sobre bioaerosoles en el Ecuador realizando nuevas investigaciones en
otros ambientes laborales.
•
Investigar los bioaerosoles recolectados ya que algunos tienen diversas aplicaciones.
•
Incrementar la concentración del agente antibacteriano cloranfenicol en el medio de cultivo MEA
o utilizar otras alternativas.
•
Extender el número de muestras y la inversión económica para mejorar la inferencia estadística.
•
Implementar algún sistema de control de bioaerosoles para disminuir sus concentraciones en el
Laboratorio de Microbiología - Biotecnología de la ESPE.
•
Rediseñar y adecuar las instalaciones del Laboratorio de Microbiología – Biotecnología de la
ESPE para lograr un eficiente desarrollo de sus actividades.
AGRADECIMIENTOS
• A la Escuela Superior Politécnica del Ejército por el apoyo y recursos brindados.
• A mi querida madre Sarita, que me enseñó, apoyó y respaldó mis anhelos y sueños
para convertirme en el ser humano que soy.
• A todos esos dilectos amigos y amigas de mi madre, que se preocuparon y me
apoyaron para que culmine con éxito mi estudio.
• A M. Sc. Almita Koch Kaiser y al Ing.-Mat. Pedro Romero, Directora y Codirector de
mi Tesis, por su acogida, respaldo y conocimientos brindados.
• A Ing. Jessie Maisincho y la Dra. Ligia Ayala por su apoyo y colaboración.
• A mis apreciados amigos y amigas.