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El super-organismo humano
Ecología Microbiana del Tracto
Gastrointestinal (GI).
 400-500 especies bacterianas habitan el
tracto intestinal humano.
 El 99% de las bacterias totales pertenecen
a 30-40 especies.
 La mayor población se halla en el colon,
con 1014 células bacterianas. (10 veces
más que todas las células del cuerpo).
Patógenos intestinales
 Diarrea asociada a Clostridium difficile
 Gastritis y úlceras asociadas a Helicobacter
pylori
 Enterocolitis asociada a Salmonella,
Escherichia, Pasteurella.
 Diarreas asociadas a rotavirus.
 Colitis y mala absorción Giardia intestinalis
(parásito intestinal).
Probióticos
Microorganismos que
producen efectos
benéficos en la salud
del consumidor.
(Bifidobacterias,
Lactobacilos)
Prebióticos
Compuestos no digeribles
que favorecen el desarrollo
y establecimiento de la
flora bacteriana benéfica
en el colon. (galactooligosacáridos de leche
materna, fructooligosacáridos de plantas,
sorbitol, xilitol, isomaltosa)
Simbióticos
Lister Joseph (1857)
Empleando leche hervida como medio de
cultivo aisló un cultivo puro “Bacterium
lactis”. (Lactobacillus, 1901)
Lactobacillus
Elías Metchnikoff, 1907


Estudios originados por la
longevidad de ciudadanos
búlgaros.
Primeros estudios científicos
que respaldan los efectos
benéficos en la salud por
consumo de leche fermentada
con “Bulgarian bacillus”
(Lactobacillus bulgaricus).
Producción de compuestos benéficos
Exclusión de patógenos en la mucosa intestinal.
Estimulación del sistema inmune
Eliminación de productos tóxicos
Henry Tissier (1906)
•Observó abundantes bacterias “Y” en heces de niños
saludables, y escasas en aquellas de niños con diarreas.
(Bacillus bifidus).
•Nueve de cada diez niños tratados con B bifidus se
recuperaron rápidamente de la diarrea.
Bifidobacterium
Definición
Lilly & Stilwell, 1965
Sustancias secretadas por un organismo y capaces deestimular
el crecimiento de otro.
Guarner & Shaafsma, 1998
Microorganismos vivos que después de ser ingeridos
en cantidades adecuadas, otorgan beneficios a la
salud que superan las inherentes necesidades
básicas nutricionales
Organización de las Naciones Unidas para la Alimentación y la
Agricultura. Organización Mundial de la Salud (FAO/WHO), 2001
Microorganismos vivos que cuando se consumen en
cantidades adecuadas como parte de un alimento,
confieren al huésped un beneficio para la salud.
Condiciones a cumplir por los microorganismos probióticos
Criterios de seguridad
 Inocuidad (GRAS, QPS).
 Identificación taxonómica de la cepa
probiótica
 Estabilidad genética
 Resistencia frente a antibióticos
Kakisu E, 2010
Condiciones a cumplir por los microorganismos probióticos
Criterios tecnológicos
 Viabilidad en el producto
 Factibilidad de reproducción a mayor
escala
 Resistencia a fagos
 Si forman parte de un alimento,
estabilidad de propiedades probióticas
durante vida útil del mismo
Condiciones a cumplir por los microorganismos probióticos
Criterios funcionales
 Resistencia a condiciones del tracto GI
 Viabilidad y eventual proliferación en intestino
 Capacidad de adherirse y colonizar fácilmente el
tracto gastrointestinal compitiendo con patógenos.
 Presentar actividad antagónica frente a patógenos
in vitro e in vivo.
 Sinergismos de cepas probióticas
 Capacidad comprobable de otorgar beneficios al
huésped
Criterios de seguridad: Identificación de la cepa probiótica:
Resolución taxonómica de las técnicas de uso más frecuente
RFLP
PFGE
Ribotipificación
AFLP, AP-PCR, rep-PCR, RAPD
ARDRA
Tipificación mediante bacteriocinas, fagotipificación
Serotipificación
Zimogramas
Patrones electroforéticos de proteínas celulares totales
Hibridaciones DNA-DNA
% G+C
Marcadores quimiotaxonómicos
Fingerprinting de ácidos grasos celulares
Estructura de pared celular
Fenotipo
Secuencia de rRNA
Sondas de DNA
Secuencias de DNA
Modificado de Vandamme et al., 1996
Criterios funcionales: Efectos benéficos sobre la salud
 Prevención y tratamiento de diarreas, úlceras y
enfermedades inflamatorias crónicas de tracto GI
 Remodelación de las comunidades bacterianas
gastrointestinales (Bifidobacterium spp, Lactobacillus
reuteri)
 Modulación de la respuesta inmune
 Prevención y disminución de efectos pro-inflamatorios en
alergias
 Profilaxis y tratamiento de enfermedades urogenitales
 Aumento de la digestibilidad de la lactosa por aporte de
beta galactosidasa
 Efectos hipocolesterolemiantes ?
 Efectos terapéuticos en el tratamiento del cáncer ?
Criterios funcionales: Efectos benéficos sobre la salud
Lutgendorff et al, 2010
La administración de probióticos reduce la apoptosis intestinal en pancreatitis aguda
en ratas. Aumento del antioxidante glutatión (GSH)
Probiótico multicepa: Lactobacillus acidophilus (W70), Lactobacillus casei (W56), Lactobacillus
salivarius (W24), Lactococcus lactis (W58), Bifidobacterium bifidum (W23), and Bifidobacterium
lactis (W52) (previously classifiedas Bifidobacterium infantis) (EcologicH 641, Winclove Bio
Industries, Amsterdam, the Netherlands).
Efecto dosis-respuesta de diferentes cepas
probióticas sobre perfiles lipídicos
Ooi & Liong, 2010
Efecto dosis-respuesta de diferentes cepas probióticas
sobre perfiles lipídicos: estudios en humanos
Existen algunos datos
controversiales,
atribuíbles a diferencias
en las cepas
empleadas, dosis y
duración del
tratamiento, grupos
contol inadecuados, etc
Ooi & Liong, 2010
Efectos inmunológicos
Modulación de la respuesta inmune:
aumento de IgA, activación células NK,
incremento de la actividad fagocítica,
proliferación de linfocitos B, producción
de citoquinas (IL2, IL6, IL10) o factor de
necrosis tumoral (TNF) (Takeda et al,
2006; Sheih et al, 2001; Kitazawa et al,
2001; Galdeano y Perdigón, 2006;
Humen et al, 2005)
Efectos inmunológicos
Estudio de la cinética de infección
en merión.
Muestras:
IgA especifica.
Materia fecal
Antígenos específicos
de Giardia
Sangre
IgG esp.
Intestino
Recuento de Trofozoitos
Enzimas
Histología
Giardia intestinalis
Cepa WB clon C6
(5x105
Día 0
28
por animal)
7
Grupo Tratamiento:
Grupo Placebo:
Sacrificio y
muestreo
Sacrificio y
muestreo
14
21
Sacrificio y
muestreo
Administración de Lactobacillus johnsonii
LA1 (108 UFC/animal/día)
Agua mineral
(Humen et al, 2005)
Efectos inmunológicos
Cinética de infección:
time post-inoculation (days)
0
10
20
Days post-inoculation
30
Day 7
infection rate
1
0,8
Infecction rate
0,6
Placebo
0,4
Fisher test (p)
Day 14
Day 21
La1
Placebo
La1
Placebo
La1
Placebo
3/11
10/12
0/12
6/14
0/6
3/6
0.01
0.02
0.09
0,2
La1
0
En el grupo placebo hay un pico de infección al día 7 (p=0.05)
Determinación de antígenos específicos de giardia (GSA-65)
en materia fecal
time (days)
ratio of GSA65 + animals
0
10
20
30
0,6
0,5
Placebo
0,4
En el grupo Placebo se encontró un aumento
en la liberación de antígenos (GSA-65)
dependiente del tiempo.
El grupo tratamiento mostró una menor
liberación de antígeno.
0,3
0,2
0,1
0
La1
-0,1
Humen et al, 2005
Posibles Mecanismos Probióticos
 Actividad anti microbiana/Interferencia con
patógenos.
 Regulación de la digestión y eliminación de
sustancias nocivas.
 Efectos inmunológicos.
Actividad anti microbiana/competencia
 Ácidos: acético, láctico, propiónico: > pH e inactivan
crecimiento bacteriano (E coli, Salmonella, etc.)
 H2O2, forma radicales libres atacan membrana
lipídica. (Candida, Gardenella).
 Bacteriocinas: péptidos anti microbianos.
Interaccionan con receptores de la bacteria blancoproduciendo cambios a nivel de membrana que
conducen a la muerte bacteriana. (Nisina)
 Competencia por sustratos.
 Competencia por sitios de unión al epitelio, efectos
estéricos.
Regulación de la digestión y eliminación de
sustancias nocivas
 Mejora la absorción de nutrientes.
 Elimina sustancias tóxicas (derivados fenólicos
de metabolismos de aminoácidos, etc., efectos
anti carcinogénicos y anti tumorales).
 Facilitan la hidrólisis de lípidos y proteínas
liberando aminoácidos y ácidos grasos fácil de
absorber.
 Aporte de enzimas que ayudan degradar
sustancias. Ej. Intolerancia a la latosa (βgalactosidasa).
 Aporte de vitaminas.
Pautas para el
desarrollo de un
Probiótico
Identificación Cepa
Genotípica y Fenotípicamente.
(Hibridación, PCR, PFEG)
Características Funcionales
Tests in vitro
Ensayos en Animales
Ensayos en humanos doble ciego
controlado con placebo (Fase2, grupo con
patología). Diseño apropiado de
experimento. Resultados preliminares
Food and Agriculture Organization
of the United Nations World Health
Organization. FAO/WHO
Aseguramiento de la inocuidad (GRAS)
In vitro y/o animal
Fase 1 estudio en humanos (voluntarios sanos)
Sin actividad hemolítica ni producción de toxinas,
no presentar resistencia a antibióticos, etc.
Recomendado un 2º ensayo
independiente para confirmar
resultados.
Probiótico
Fase 3. Ensayos efectividad al
compararlos con tratamiento
estándar de una condición
específica.
Rotulado:
Contenido: Cepa , especie etc
Mínimo Nº de bacterias viables del contenido
Condiciones apropiadas de almacenaje
Bacterias del ácido láctico
 Gram positivas
 No esporulantes
 Cocos o bacilos no respiradores
 Catalasa negativos
 Productoras de ácido láctico
Estructura
Metabolismo
Aplicaciones biotecnológicas
(Hagen et al., 2005)
El kefir
Alimento obtenido por incubación de leche con gránulos de kefir.
Los gránulos, compuestos por una matriz de proteínas y polisacáridos,
contienen lactobacilos, lactococos, bacterias del ácido acético y
levaduras, responsables de la fermentación.
Composición
Proteína láctea (% w/w)a
Mín 2,7%
Grasa láctea (% w/w)
Menos del 10%
Acidez valorable, expresada como % de ácido
láctico (% w/w)
Mín. 0,6%
Suma de microorganismos que constituyen el
cultivo (ufc/g, en total)
Mín. 107
Levaduras (ufc/g)
Mín. 104
Etanol
No establecido
Lactobacillus
QPS (Qualified Presumption of Safe, UE)
GRAS (Generally Recognised As Safe, USA)
 Homofermentadores:
Glucosa
L. kefiranofaciens, L. acidophilus, L. alimentarius,
L. casei, L. rhamnosus.
ácido láctico
 Heterofermentadores: L. brevis, L. buchneri, L. kefir, L. fermentum, L. fructivorans.
Glucosa
ácido láctico
etanol
ácido acético
S-layer proteins: General aspects
Subunits are held together and attached to the underlying cell surface by noncovalent
interactions.
Monomers have self-assembly ability to form regular layers
Interactions can be disrupted in a reversible way by cation substitution or high concentration
of chaotropic agents
in suspension
at liquid-surface interfaces
on lipid films
on liposomes
on solid supports
S-layer proteins of lactobacilli: General features
Relatively small size 25 kDa to 71 kDa.
Basic proteins with high pI between 9,0 y 10,4.
Low content of cysteine and methionine
High content of hydrophobic and hydroxyl amino acids.
No SLH motifs have been detected but the attachment of the S-layer protein to the cell
wall seems to involve also secondary cell wall polymers (SCWP).
Presence of S-layer proteins are strain dependent
Adhesive properties were demonstrated in several lactobacilli S-layers
S-layer proteins of lactobacilli: Adhesive properties
Proposed or identified adhesive surface proteins of Lactobacillus
Target
S-layer
protein
Species / Strain
Reference
S-layer protein
Avian intestinal epithelial cells
Lactobacillus acidophilus spp.
CbSA
Collagens, laminin
Lactobacilluscrispatus JCM
5810
SlpA
Fibronectin,
cell line
S-layer protein
Red blood cells
Lactobacillus kefir CIDCA 8321
Garrote et al., 2004
Red blood cells
Lactobacillus parakefir CIDCA
8328
Garrote et al., 2004
human
epithelial Lactobacillus brevis ATCC 8287
Schneitz et al., 1993
Toba et al., 1995
Hynönen et al., 2002
SlpA
Murine ileal epithelial cells
Lactobacillus acidophilus M92
S-layer protein
human epithelial cells
Lactobacillus helveticus R0052
S-layer protein
Mammalian epithelial cell
Lactobacillus amylovorus spp.
S-layer protein
Sacharomyces lipolytica
Lactobacillus kefir CIDCA 8315 Golowczyc et al., 2009
Frece et al., 2005
Johnson-Henry et al., 2007
Jakava-Viljanen et al., 2007
Interacción entre L. kefir y S. lipolytica aisladas
de gránulos de kefir
Golowczyc et al, 2009
Actividad tipo lectina de la capa S (inhibición de la coagregación con
levaduras en presencia de periodato o azúcares)
Inhibición de la hemaglutinación por pérdida de capa S
Distribución diferencial de bacterias en el colon
FISH
Adaptado de Swidsinki et al. 2009
Sykora J, Valeckova K, Amlerova J, Siala K, Dedek P, Watkins S, et al. Effects of a specially designed
fermented milk product containing probiotic Lactobacillus casei DN-114 001 and the eradication of
H. pylori in children: a prospective randomized double-blind study. J Clin Gastroenterol 2005;39:692.
Ooi & Liong. Cholesterol-Lowering Effects of Probiotics and Prebiotics: A Review of in Vivo and in
Vitro Findings. Int. J. Mol. Sci. 2010, 11, 2499-2522
Martín A. Humen,Graciela L. De Antoni, Jalil Benyacoub, María E. Costas, Marta I. Cardozo, Leonora
Kozubsky, Kim-Yen Saudan, Angele Boenzli-Bruand, Stephanie Blum , Eduardo J. Schiffrin, and Pablo F.
Pérez1,2*Lactobacillus johnsonii La1 Antagonizes Giardia intestinalis In Vivo. Infect Immun. 2005 73(2):
1265–1269.