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Lafaurie - Eficacia Desinfectante del Ácido Hipocloroso 3
Artículos Originales Original Articles
Revista Colombiana de Investigación
en Odontología 2009;1(1):3-11
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Gloria Inés Lafaurie
Aya María del Rosario
Silie Arboleda
Andrea Escalante
Diana Marcela Castillo
Lina Viviana Millán
Justo Calderón
Blanca Nieves Ruiz
EFICACIA DESINFECTANTE DEL ÁCIDO
HIPOCLOROSO SOBRE CEPAS CON PODER
PATOGÉNICO DE CAVIDAD ORAL
DISINFECTANT EFFICACY ON
HYPOCHLOROUS ACID PATHOGENIC STRAINS
OF ORAL CAVITY
RESUMEN
1 OD Periodoncista, Facultad de
Odontología, Universidad El
Bosque
2 Blc Esp Msc, Facultad de
Odontología, Universidad El
Bosque
3 OD Especialista en Periodoncia
y Medicina Oral,Facultad de
Odontología, Universidad El
Bosque
4 OD Especialista en Periodoncia
y Medicina Oral, Facultad de
Odontología, Universidad El
Bosque
5 Blc Esp Msc, Facultad de
Odontología, Universidad El
Bosque
6 Blc, Facultad de Odontología,
Universidad El Bosque
7 Blc cMsc, Facultad de
Odontología, Universidad El
Bosque
8 Blc, Facultad de Odontología,
Universidad El Bosque
Correspondencia
Universidad El Bosque. Facultad
de Odontología. Cra 7 b bis No
132-11. Bogotá, Colombia.
investigaodonto@unbosque.edu.co.
Objetivo Evaluar la eficacia antimicrobiana del ácido
hipocloroso sobre microorganismos con potencial patogénico
en cavidad oral.
Métodos Se evaluó la efectividad antimicrobiana y anti fúngica
del ácido hipocloroso en concentraciones de 125, 250, 500,
1000 y 1500 ppm a diferentes tiempos de acción: 1, 5, 10 y 15
minutos, sobre diferentes cepas bacterianas ATCC y sobre
Candida albicans ATCC 90028. Se empleó la técnica de Kelsey
Maurer, verificando la presencia o ausencia de unidades
formadoras de colonias (UFC). Cada ensayo se realizó por
triplicado con sus respectivos controles de viabilidad.
Resultados Se logró inhibición bacteriana a una
concentración de 500 ppm durante 1 minuto para S. sanguis, S. mutans, E. faecalis, E. corrodens, C. rectus, F.
nucleatum, E. cloacae, K. oxytoca y K. pneumoniae. Los
resultados indican que el ácido hipocloroso se constituye
como una alternativa antimicrobiana para bacterias con
capacidad patogénica en la cavidad oral.
Conclusiones La C. albicans se inhibió a una concentración
de 500 ppm por 10 minutos, lo que indica bajo poder anti
fúngico. Se requieren estudios clínicos para evaluar la
efectividad del ácido hipocloroso in vivo.
Palabras clave: ácido hipocloroso, placa dental, cavidad oral,
antimicrobianos.
ABSTRACT
Objetive proposed as an alternative for the inhibition of dental
plaque deposition and as a non-antibiotic antimicrobial substance for use in odontogenic infections. The aim of this
study was to evaluate the antimicrobial efficacy of hypochlorous acid on potentially pathogenic oral microorganisms.
Methods The antimicrobial and antifungal efficacy of this
acid was evaluated in concentrations (125, 250, 500,1000 and
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Revista Colombiana de Investigación en Odontología 2009;1(1)
1500 ppm) at different times (1,5,10 and 15 minutes) over diverse ATCC oral species and C. albicans.
The Kelsey Maurer technique was used to assess the presence or absence of colony forming
units (CFU) and each assay was performed in triplicate with viability controls.
Results Bacterial inhibition was achieved after 1 minute at 500 ppm concentration for S. sanguis,
S. mutans, E. corrodens, C. rectus, F. nucleatum, E. faecalis, E. cloacae, K. oxytoca, K. pneumonia.
The results indicate that hypochlorous acid is an antimicrobial alternative for oral bacteria with
pathogenic potential.
Conclusions The C. albicans was inhibited at 500 ppm concentration after 10 minutes, which
indicates a lower antifungal power. Clinical studies are required to evaluate in vivo effectiveness
of hypochlorous acid.
Key words: Hypochlorous acid, dental plaque, oral cavity, antimicrobials.
INTRODUCCIÓN
La cavidad oral provee un microambiente ideal
para el crecimiento de múltiples especies
bacterianas. Dentro de la flora oral se pueden
encontrar especies residentes que componen
la flora normal así como bacterias transeúntes
y otras asociadas a enfermedad. La placa dental es uno de los tipos de biofilm o biopelícula
más estudiados y es la forma de crecimiento
más frecuente de las bacterias de la cavidad
oral (1). La caries dental y la enfermedad periodontal constituyen las enfermedades orales
de mayor impacto poblacional en muchos
países industrializados y en la mayoría de los
países en desarrollo y son consideradas
enfermedades prevenibles mediante un
correcto control de la placa dental (2).
Múltiples estudios han comprobado que la
eliminación mecánica de placa dental de
manera controlada, reduce significativamente
la cantidad de la misma y procesos de gingivitis (3). Buscando una reducción más efectiva
del biofilm dental, se han desarrollado múltiples
sustancias antimicrobianas para inhibir la
formación de placa sobre las superficies
dentales. Sin embargo, los antisépticos a
diferencia de los antibióticos, son
potencialmente tóxicos para agentes
infecciosos y células del huésped, por lo tanto,
su aplicación en los seres humanos se limita a
heridas infectadas, la piel y mucosas (2, 4). La
formación de biopelícula dental ha sido
ampliamente estudiada y caracterizada y
actualmente se conocen las interacciones
necesarias para que se inicie el proceso de
formación así como la secuencia de llegada y
ubicación de las especies asociadas a dicha
comunidad. La flora normal mantiene en
equilibrio el ecosistema oral y reduce la
posibilidad de infecciones por patógenos
exógenos. Desde este punto de vista, se puede
decir que los tratamientos pueden apuntar a
controlar más no a erradicar la placa dental
(1).
En algunas circunstancias clínicas en
odontología, se hace necesaria la utilización de
sustancias antimicrobianas de alta potencia.
Los pacientes con enfermedades periodontales
severas y pacientes con alto riesgo de caries
dental pueden requerir protocolos de
desinfección de cavidad oral. La clorhexidina
ha sido la sustancia más efectiva en la
inhibición de la placa dental y es altamente
utilizada para protocolos de desinfección
completa de la boca (5, 6, 7). Sin embargo,
algunos efectos secundarios sobre las mucosas, alteración en la sensación del gusto y
pigmentaciones extrínsecas limitan su uso
clínico (8).
Lafaurie - Eficacia Desinfectante del Ácido Hipocloroso 5
Buscando una alternativa para uso clínico en
odontología, se propone evaluar el acido
hipocloroso (HOCl). El HOCl, hace parte de
un grupo de moléculas conocidas como
Aganócidos (9), es decir, sustancias
antimicrobianas no antibióticas, biológicamente
sintetizadas por Neutrófilos y macrófagos durante un proceso inmunológico conocido como
estallido respiratorio, que ocurre como
resultado del proceso de fagocitosis. El HOCl
es un ión no disociado del cloro, dependiente
del oxigeno, altamente inestable y altamente
reactivo. Por ser uno de los ácidos
hipohalogenados más fuertes, es también uno
de los más poderosos oxidantes entre los
oxácidos clorados y es el responsable directo
de la acción bactericida de los compuestos
derivados del cloro (10). Químicamente el
HOCl puede ser obtenido por diferentes
métodos. Infortunadamente, la mayoría de los
procedimientos obtienen soluciones de baja
estabilidad, moderada actividad microbicida,
con bajo porcentaje de ácido hipocloroso libre
y mal toleradas por los tejidos en usos
prolongados.
En Colombia en 1992, se obtuvo la molécula
de HOCl con una estabilidad superior a un año,
permitiendo el desarrollo e investigación profunda del compuesto, hasta lograr la primera
formulación farmacéutica en el mundo a base
de HOCl, certificada con el registro INVIMA
número 2004M-0003037. Esta formulación
está indicada como solución antiséptica para
el tratamiento y cuidado de heridas en
patologías de miembros inferiores como:
ulceras venosas, arteriales, traumas venosos,
pie diabético (11), como solución para el lavado
y cuidado de heridas abiertas y quemaduras
de segundo y tercer grado (12).
Adicionalmente, los estudios de toxicidad aguda
a nivel oral, inhalatorio, dérmico, cutáneo, ocular, intravenoso e intraperitoneal del HOCl en
animales de laboratorio (ratas Wistar y conejos
Nueva Zelanda) establecieron como dosis
letal50 las concentraciones mayores a 5000mg/
Kg de peso (DL 50 >5000mg/Kg), sin
evidenciar signos de toxicidad sistémica en los
animales en estudio, durante los tiempos y
concentraciones evaluadas.
Así mismo, se ha evaluado la actividad
bactericida del HCIO utilizando la técnica de
Kelsey Maurer en condiciones controladas de
temperatura, concentración y tiempo de
acción, encontrándose que el HCIO es
efectivo al 99.9% a concentraciones iguales o
mayores a 900 ppm, luego de 10 minutos de
acción para todas las cepas estudiadas (13).
Otros estudios muestran que el HOCl es un
antimicrobiano de amplio espectro en
concentraciones que van desde 0.1 a 2.8 ìg/
mL en un periodo de exposición de 2 min.
(Excepto Streptococcus pyogenes que
requiere aproximadamente de 10 minutos de
acción). Esta actividad microbicida, a pesar
de ser más efectiva para formas bacterianas
que para esporas y hongos, muestra efectividad
antimicrobiana para microorganismos de alto
impacto clínico como S. aureus, S. aureus
meticilino resistente, E. faecium vancomicinaresistente y esporas de Bacillus anthracis (9).
Evaluando las propiedades del ácido hipocloroso,
este agente podría ser utilizado como sustancia
antimicrobiana en cavidad oral. Sin embargo,
debido a la complejidad de la flora oral, se hace
necesario evaluar la eficacia del ácido
hipocloroso como agente antimicrobiano en
microorganismos con poder patogénico en
cavidad oral. El propósito de este estudio fue
evaluar el efecto antimicrobiano del HOCL
sobre bacterias Gram positivas, anaerobias y
sobreinfectantes como E. cloacae, K. oxytoca
y K. pneumoniae y su efecto anti fúngico sobre
Candida albicans.
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MATERIALES Y MÉTODOS
Para la evaluación del efecto antimicrobiano
del ácido hipocloroso in vitro, se utilizó la
técnica de Kelsey Maurer que se basa en la
comprobación, en condiciones reales, de la
eficacia de un desinfectante, para ello, se
observa el crecimiento o no de colonias en los
diferentes medios de cultivo después de
sembrar la dilución de la suspensión bacteriana
y el desinfectante, una vez que han transcurrido
los tiempos a evaluar (14, 15).
Cepas evaluadas: Se estudiaron bacterias con
potencial patogénico en cavidad oral, a saber:
bacterias Gram positivas: Streptococcus sanguis ATCC 10556, Streptococcus mutans ATCC
25175 y Enterococcus faecalis ATCC 29212.
Microorganismos anaerobios: Porphyromonas
gingivalis ATCC 33277,Aggregatibacter
actinomycetemcomitans ATCC 29523,
Eikenella corrodens ATCC 23834,
Campylobacter rectus ATCC 33238 y Fusobacterium nucleatum ATCC 25586.
Microorganismos sobre infectantes:
Enterobacter cloacae ATCC 13047, Klebsiella
oxytoca ATCC 43086, Klebsiella pneumoniae
ATCC 700603 y Candida albicans ATCC
90028.
Suspensión bacteriana: Se preparó una
suspensión del microorganismo a evaluar (bacteria o levadura), en 5ml de caldo BHI hasta
obtener una turbidez equivalente a la escala 1
de Mc Farland (absorbancia entre 0.16 - 0.20
a una longitud de onda de 620 nm) (16).
Medios de cultivo: Se realizaron diversos
ensayos con el fin de determinar el medio de
cultivo apropiado para cada una de las
bacterias evaluadas, considerando las
diferencias metabólicas y los requerimientos
nutricionales de las mismas. Para bacterias
Gram positivas se utilizó el medio BHI (Brain
Hearth infusión), para bacterias entéricas se
usó el medio Müeller Hinton y para bacterias
anaerobias se empleó el medio BHI
suplementado con hemina (5µg/ml), menadiona
(0,5mg/ml), extracto de levadura (2 µg/ml) y
L-cisteína (1%). Candida albicans se sembró
en agar Saboureaud.
Determinación de la viabilidad: Este
procedimiento se llevó a cabo para verificar la
viabilidad de las cepas en estudio y además
para estimar el número de UFC que se
pusieron a prueba frente al desinfectante. Se
prepararon 6 diluciones seriadas en base 10
de la suspensión bacteriana, utilizando como
diluyente caldo de dilución (VMGA I).
Posteriormente, se sembró 1 ml de la dilución
10 -6 , por profundidad y se dispensaron
aproximadamente 15 ml del agar
correspondiente a una temperatura de 45°C,
según el microorganismo. Las cajas se
mezclaron con movimientos de rotación y una
vez solidificado el agar se incubaron de acuerdo
a las necesidades de la bacteria. Finalmente,
se realizó el recuento de colonias y el resultado
se multiplico por el factor de dilución 106, lo
que corresponde al inoculo bacteriano real.
Desinfectante: Se evaluó el ácido hipocloroso
en concentraciones de: 125 ppm, 250 ppm, 500
ppm, 1000 ppm y 1500 ppm.
Prueba con el desinfectante. En un tubo
falcón estéril se colocaron 4,5 ml del
desinfectante
en
sus
diferentes
concentraciones; se agregaron 500 µl de la
suspensión bacteriana y se homogenizó en
vortex por 10 segundos. Se dejó actuar durante 1, 5, 10 y 15 minutos y se realizó la
siembra de la suspensión correspondiente a
cada uno de los tiempos, de la misma manera
que se hizó para el control de viabilidad y bajo
las mismas condiciones de incubación de
acuerdo con el microorganismo estudiado. Se
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vertió 1 ml de dicha suspensión en una caja de
petri estéril. Se sirvieron 15 ml de agar a 45 ºC
y se homogenizó con movimientos rotatorios,
una vez solidificados, se llevaron a incubación,
las bacterias anaerobias se incubaron en
condiciones de anaerobiosis (Anaerogen,
Oxoid, Hampshire, England) a 37º C durante
siete días, las bacterias aerobias y C. albicans
se incubaron durante 24-48 horas en
condiciones de aerobiosis a 37ºC. Este
procedimiento se realizó por triplicado para
cada uno de los tiempos y concentraciones.
Lectura de las pruebas: Se verificó la
presencia o ausencia de unidades formadoras
de colonias (UFC) a las diferentes
concentraciones: 125, 250, 500, 1000, 1500
ppm y en los diferentes tiempos: 1, 5, 10 y 15
minutos. En los medios de cultivo que
presentaron crecimiento, se realizaron
resiembras para confirmar la pureza de los
microorganismos.
Porcentaje de efectividad: Del control de
viabilidad se realizó el recuento de las colonias
de la dilución 10-6 y se multiplicó por el factor
de dilución, lo que equivale al 100 % de inóculo
bacteriano.
Ensayo de eficacia: Se contó el número de
colonias a los diferentes tiempos para cada
una de las concentraciones y temperaturas
probadas. Se aplicó una regla de tres para
determinar el porcentaje (%) de crecimiento
bacteriano resistente al efecto del HOCl.
Análisis estadístico: Se utilizó estadística
descriptiva y como medida de resumen se
usaron porcentajes (%) que son presentados
en las tablas de resultados.
RESULTADOS
Control de viabilidad. Se encontró que el
inóculo bacteriano de cada una de las cepas
ATCC fue viable y se comportaron dentro
de los recuentos de UFC establecidos en la
escala nefelométrica de Mc Farland; éste
inóculo en millones de UFC fue el que entró
en contacto con el desinfectante.
Para evaluar los resultados se clasificaron en:
Negativo, cuando hubo inhibición total del
crecimiento bacteriano ó positivo cuando hubo
presencia de bacterias medidas en UFC de
microorganismos en las diferentes
concentraciones y tiempos.
Bacterias Gram positivas. El HOCl tuvo
una efectividad del 100% sobre S. sanguis y
S. mutans a concentraciones iguales o
superiores de 500 ppm al minuto de acción.
A concentraciones de 125 y 250 ppm se
requirieron 5 minutos para lograr inhibición
total. Enterococcus faecalis mostró también
una inhibición total a concentraciones e” a
500 ppm a un minuto de acción del HOCL
(Tabla 1).
Bacterias anaerobias. De acuerdo a los
resultados observados para bacterias Gram
positivas se probaron concentraciones e” a
500 ppm. Para P. gingivalis, A.
actinomycetemcomitans, E. corrodens, C.
rectus y F. nucleatum, el HOCl tuvo una
efectividad del 100% a concentraciones
iguales o superiores de 500 ppm al minuto de
acción. (Tabla 2).
Microorganismos sobreinfectantes. El
HOCl también mostró una efectividad del
100% a concentraciones iguales o superiores
de 500 ppm al minuto de acción sobre E.
cloacae, K. oxytoca y K. pneumoniae,
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bacterias sobreinfectantes de cavidad oral.
A concentraciones más bajas se requieren
tiempos más prolongados de acción.
Contrariamente, el HOCl tuvo una efectividad
del 100% a concentraciones iguales o
superiores de 500 ppm a los 10 minutos de
acción, 1000 y 1500 ppm a los 5 minutos sobre
Cándida albicans. (Tabla 3)
Tabla 1. Actividad Bactericida de HOCL (%) sobre Streptococcus sanguis,
Streptococcus mutans y Enterococcus faecalis
Control viabilidad: S. sanguis; 218x106 DE ± 28, S.mutans; 218 x106 DE ±28, Enterococcus faecalis 153 x106
DE ± 59.4 Ss: Streptococcus sanguis, Sm: Streptococcus mutans, Ef: Enterococcus faecalis
Tabla 2. Actividad Actividad Bactericida de HOCL (%) sobre
Eikenella corrodens, Campylobacter rectus y Fusobacterium nucleatum
Control viabilidad: A. actinomycetemcomitans 1050 x 106 DE: ± 21,2, P. gingivalis: 96 x104 DE: ± 12.8, E.
corrodens; 90 x106 DE ± 23.26, C. rectus; 127.33 x106 DE ± 48.42, F. nucleatum; 141.67 x106 DE ± 34.08
Pg: Porphyromonas gingivalis, Aa:Aggregatibacter actinomycetemcomitans, Ec: Eikenella corrodens, Cr:
Campylobacter rectus, Fn: Fusobacterium nucleatum
Tabla 3. Actividad Bactericida de HOCL (%) sobre Klebsiella pneumoniae, Klebsiella oxytoca y
Candida albicans
Control viabilidad: K. pneumoniae 114.7 x106 DE+70.79, K. oxytoca; 126.3 x106 DE +14 Candida albicans;
8 x106 DE + 3.61 Kp: Klebsiella pneumoniae, Ko: Klebsiella oxytoca, Ca: Candida albicans
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DISCUSIÓN
El agente más ampliamente utilizado para la
desinfección de la cavidad oral es la
clorhexidina y su efecto sobre la inhibición de
placa dental, reducción de caries y gingivitis
ha sido bien documentado (17). Sin embargo,
algunos efectos colaterales han desestimulado
su uso clínico. Los efectos adversos incluyen:
pigmentación dental, ya que se mezcla
fácilmente con los cromógenos de la dieta;
escasa actividad microbicida a bajas
concentraciones y en altas concentraciones
puede producir dermatitis; lesión de mucosas
y resequedad de los tejidos, situación que altera
y retrasa el proceso de cicatrización (8).
El hipoclorito de sodio ha sido utilizado en
algunos estudios de inhibición de
microorganismos subgingivales en bolsas
periodontales. Slots en 2002, recomendó una
solución de hipoclorito de sodio como irrigante
subgingival en el mantenimiento periodontal, en
una concentración de 0.1% o 1000 ppm de cloro
disponible. Perova et al., en 1990 reportaron
un efecto clínico importante con el uso de
hipoclorito de sodio en irrigación subgingival en
pacientes durante el mantenimiento periodontal
y Lobene et al., en 1972 ya habían reportado
que la irrigación subgingival con 0.5% de
hipoclorito de sodio, (solución Dakin) causó
mayor reducción de placa y gingivitis que la
irrigación con agua. Sin embargo, el hipoclorito
de sodio presenta algunos efectos colaterales
que incluyen irritación de las membranas mucosas cuando se usa a altas concentraciones,
efectos decolorantes y efectos corrosivos de
algunos metales (4, 18, 19).
El ácido hipocloroso es el componente activo
del hipoclorito de sodio sin sus efectos adversos,
de esta manera, se podría considerar como un
potente antimicrobiano para uso en cavidad
oral ya que se ha demostrado su bajo poder
de toxicidad, su efecto antimicrobiano y
además, puede ser usado como un agente
antibacteriano tópico para heridas, úlceras en
piel y mucosas, sin inhibición de la actividad
fibroblástica (2, 20).
En el presente estudio, se evaluó el efecto
antimicrobiano del ácido hipocloroso sobre
cepas con capacidad patogénica en la cavidad
oral. Los resultados de esta evaluación,
permitieron demostrar que a concentraciones
de 500 ppm con un tiempo de acción de 1
minuto, se logró inhibir bacterias Gram
positivas, anaerobias y sobre infectantes. Sin
embargo, la efectividad del ácido hipocloroso
sobre Candida albicans, logró un efecto
inhibitorio a una concentración de 500 ppm
después de 10 minutos y a una concentración
de 1000 y 1500 ppm después de 5 minutos,
mostrando bajo poder fungicida.
Los resultados reportados, muestran un efecto
antimicrobiano potente y de amplio espectro
para microorganismos asociados con caries
dental,endocarditis infecciosa, sobreinfectantes
y microorganismos del complejo naranja, que
favorecen el crecimiento de microorganismos
periodontopáticos del complejo rojo como P.
gingivalis, T. denticola, T. forshytia y E.
nodatum, asociados a la enfermedad periodontal (21), lo que hace del ácido hipocloroso, un
antimicrobiano no antibiótico de alto interés en
odontología. El efecto sobre microorganismos
periodontopáticos del complejo rojo como P.
gingivalis mostró una inhibición a
concentraciones similares que otros
microorganismos evaluados en el presente
estudio.
10 Revista Colombiana de Investigación en Odontología 2009;1(1)
Una ventaja importante del ácido hipocloroso es su
acción contra microorganismos sobre infectantes
como las enterobacterias, que parecen reducir la
respuesta al tratamiento periodontal, a
concentraciones similares que las requeridas para
inhibición de otros microorganismos de la cavidad
oral. Un bajo efecto de la clorhexidina sobre
enterobacterias ha sido reportado previamente (22).
El efecto anti fúngico del ácido hipocloroso
requiere un mayor tiempo de acción o un aumento
en su concentración lo que no lo hace un agente
anti fúngico efectivo a dosificación de 500 ppm.
Se concluye que el ácido hipocloroso es un
buen bactericida ya que inhibió todas las cepas
bacterianas empleadas en este estudio, siendo
efectivo en un 100%, a concentraciones de
500 ppm y a un 1 minuto de acción sobre S.
sanguis, S. mutans, P. gingivalis, A.
actinomycetemcomitans, E. corrodens, C.
rectus, F. nucleatum, K. oxytoca, K.
pneumoniae y E. cloacae. Además, el ácido
hipocloroso posee una efectividad anti fúngica
sobre Candida albicans a concentraciones
> a 500 ppm.
Agradecimientos. Al laboratorio Aquilabs Ltda.
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