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Lourdes Mónica Bravo Anaya
Universidad de Guadalajara/ Université de Grenoble
Doctorado en Ciencias en Ingeniería Química/ Doctorat IMEP2 Mécanique des Fluides, Procédés,
Énergétique.
monik_ayanami@hotmail.com
Evaluación del comportamiento estructural de moléculas de ADN en solución
mediante técnicas electroquímicas, ópticas y reología.
L.M. Bravo-Anaya1,3, E. R. Macías Balleza1, J. H. Pérez-López1, N. Casillas2, Y. Rharbi3, J.L. Hernández-López4, E.R.
Larios-Durán1, J.F.A. Soltero1.
1
Universidad de Guadalajara. Departamento de Ingeniería Química y 2Química, Blvd. M. García Barragán #1451, C. P. 44430,
Guadalajara, Jalisco, MÉXICO.
3 Laboratoire de Rhéologie et procédés, UJF/INPG/CNRS, UMR 5520, B.P.53, F-38041 Grenoble, FRANCE.
4 Centro de Investigación y Desarrollo Tecnológico en Electroquímica, S.C., Pedro Escobedo, Querétaro, C.P. 76703, MÉXICO.
Resumen
Actualmente, la innovación en el desarrollo de sensores de ADN, la búsqueda para lograr una
mayor eficiencia en los procesos de compactación de dicha biomolécula y el estudio de los cambios
generados en las propiedades interfaciales entre las superficies metálicas de trabajo y las moléculas
de ADN se ha convertido en un área de gran interés en la bioingeniería en México y en el mundo.
Este trabajo propone el acoplamiento de técnicas electroquímicas, reológicas y ópticas para el estudio
detallado del comportamiento de moléculas de ADN en solución en función de distintos parámetros
tales como temperatura, concentración de ADN, concentración de sales y potencial. Dichas técnicas
son empleadas para identificar los cambios estructurales en las interfases Au/ADN, Pt/ADN y para
describir el comportamiento de las cadenas de ADN en solución. La respuesta medida a través de las
técnicas electroquímicas y ópticas refleja un proceso de adsorción de moléculas de ADN en las
superficies metálicas de trabajo. Los resultados obtenidos permiten identificar las concentraciones
críticas del sistema (C* y Ce), las constantes de tiempo características (c) y los parámetros eléctricos
que describen y simulan el proceso de adsorción en el electrodo. Las propiedades de flujo son
evaluadas mediante reología lineal y reología no lineal. La respuesta lineal a bajas frecuencias es
descrita por el módulo plateau Go y el tiempo de relajación de un fluido de Maxwell, R. El
comportamiento no lineal, considerado como una consecuencia natural de los efectos de orientación
de las moléculas de ADN en solución, es reproducido utilizando el modelo de Giesekus, basado en
el concepto de movilidad tensorial dependiente de la deformación.
Introducción
El ADN es un polímero lineal de gran longitud llamado ácido nucleico, el cual contiene la
información genética hereditaria de los organismos vivos y es capaz de transmitirla de generación en
generación [1]. La información genética se encuentra almacenada en la secuencia de bases a lo largo
de la cadena del ácido nucleico. La unión de dichos pares bases resultan en la formación de una doble
hélice, una estructura helicoidal conformada por dos hebras, originada debido a su gran tamaño y su
carga eléctrica [2]. Diversas técnicas han sido utilizadas en estudios de ADN en solución para
contribuir al entendimiento macroscópico y microscópico de las transiciones estructurales y
conformacionales del ADN. La técnica de Espectroscopía de Impedancia Electroquímica (EIS) es
considerada como una técnica sensible y favorable que puede ser utilizada como herramienta de
detección de distintos procesos electroquímicos observados en las soluciones de ADN. La
información generada es de gran importancia en el desarrollo de sensores de ADN, los cuales
transducen cambios en las propiedades interfaciales entre el electrodo y el electrolito, inducidos por
la hibridación del ADN, cambios conformacionales y daños al ADN por una señal eléctrica, han sido
investigados mediante algunas de las técnicas mencionadas anteriormente para mejorar su
sensibilidad [3].
Por otro lado, la molécula de ADN ha sido considerada también como modelo para el estudio de
fluidos poliméricos en el área de investigación de la reología. En este trabajo se consideran las
distinciones marcadas entre las soluciones diluidas de ADN, las semidiluidas sin enredamientos y las
semidiluidas con enredamientos, cuyas transiciones son identificadas en dos concentraciones críticas
conocidas como la concentración de traslape (C*) y la concentración de enredamientos (Ce) [4].
Dichas concentraciones son los umbrales de los cambios estructurales de las cadenas de ADN en el
seno de la solución. Mason et al. reportaron que para soluciones acuosas de ADN de timo de ternera
la concentración crítica de enredamiento, Ce, a 25 ºC es igual 2.0 mg mL-1 [5].
Actualmente, el estudio de los cambios generados en las propiedades interfaciales entre las
superficies de trabajo y las moléculas de ADN [3] ha despertado el interés por comprender de manera
más precisa y detallada el comportamiento de las biomoléculas en solución en función de diversos
parámetros tales como temperatura, concentración de ADN, concentración de sales, pH y potencial.
La técnica de EIS fue seleccionada por su alta sensibilidad a los procesos de adsorción en superficies
metálicas y a las reacciones que se presentan en el sistema. Las técnicas reológicas fueron utilizadas
para obtener un mayor acercamiento al entendimiento de los tiempos de relajación y a las propiedades
de flujo de las moléculas de ADN en solución. Por último, se utilizó la técnica de Resonancia de
Plasmones Superficiales (SPR) [6] para analizar los cambios estructurales y conformacionales que se
presentan en la interfase metal/solución.
Metodología
Reactivos:
Se utilizaron muestras de ADN de timo de ternera con 13,000 pares base (bp) para preparar las
soluciones de ADN/Buffer. El pH de las soluciones fue ajustado y conservado en 7.3 mediante una
solución buffer elaborada con Trisma (Tris-HCl), ácido etilendiaminotetraacético (EDTA), ambos
con una pureza del 99.0 %, e hidróxido de sodio (NaOH) 3 M. Todas las soluciones y las diluciones
se prepararon con agua grado HPLC. Los reactivos fueron suministrados por la compañía Aldrich.
Preparación de soluciones:
Las soluciones de ADN se prepararon en frascos de vidrio de 20 mL, pesando cantidades
adecuadas de ADN y usando una relación 9:1 de agua HPLC y del buffer EDTA/Tris-HCl para
producir la concentración deseada. Los frascos se cerraron y se sellaron con Parafilm para evitar la
evaporación agua, y consecuentemente, el cambio en la concentración. Para evitar la degradación de
las soluciones, se almacenaron en un refrigerador a una temperatura de 4 °C.
Mediciones de Espectroscopía de Impedancia Electroquímica (EIS)
Las mediciones de EIS se llevaron a cabo en un analizador de frecuencia modelo 1260 acoplado a
un potenciostato 1287 de la compañía Solartron. Para cada medición, se utilizó el modo
potenciostático a potencial de circuito abierto, aplicando una perturbación de 10 mV de amplitud, en
un rango de frecuencias de 7x102 Hz a 1x10-3 Hz. El estudio de la interfase ADN/Pt se llevó a cabo
en una celda de dos electrodos de platino paralelos de la marca Fisher Scientific con una superficie
de 0.25 cm2 cada electrodo. La limpieza electroquímica de la celda se llevó a cabo mediante
voltamperomatería cíclica en una solución de H2SO4 0.5 M durante 10 ciclos. Las mediciones se
llevaron a cabo para concentraciones de ADN entre 0.01 y 2.5 mg mL-1 a cada una de las siguientes
temperaturas: 20, 30 y 40 ºC. El estudio de la interfase ADN/Au se realizó en una celda convencional
de tres electrodos con un electrodo de cilindro de oro como el electrodo de trabajo, un electrodo de
disco de oro como el contra-electrodo y un electrodo saturado de calomel (SCE) como electrodo de
referencia. La limpieza electroquímica de la celda se llevó a cabo mediante voltamperomatería cíclica
en una solución de HClO4 0.1 M. Se estudiaron las concentraciones de ADN de 0.01 a 3.0 mg mL-1
a cada una de las siguientes temperaturas: 25, 30 y 35 ºC. La temperatura de las muestras se controló
empleando un baño de recirculación forzada con un control de temperatura digital. Se permitió un
tiempo de descanso de 5 min a las muestras para garantizar una medición en estado estacionario.
Reometría
Se utilizó un reómetro AR-G2 de la compañía TA Instruments. Las mediciones se realizaron a las
temperaturas de 10, 20, 30 y 40º C. Se empleó la geometría de cono de acero con un diámetro de 60
mm y un ángulo de 1º. Para analizar el comportamiento lineal del sistema se realizaron barridos de
deformación y frecuencia. Los barridos de deformación se efectuaron a una frecuencia angular de 10
rad s-1, dentro del intervalo de deformación de 0.01% a 100%, utilizando 10 puntos por década. Los
barridos de frecuencia se efectuaron dentro del intervalo de frecuencia angular de 100 a 0.01 rad s-1,
utilizando 5 puntos por década. Para la reología no lineal se llevaron a cabo barridos de corte dentro
del intervalo de velocidad de corte de 1x10-3 a 1x103 s-1, utilizando 5 puntos por década.
Resonancia de Plasmones Superficiales (SPR)
Los chips sensores fueron suministrados por NanoSPR (USA), y cuentan con una superficie de 20
x 20 x 1 mm. Cada chip está recubierto con una capa de Au (≈45 nm) adherida a una delgada película
de Cr (≈ 5 nm). Antes de ser modificados, los sustratos fueron lavados exhaustivamente con agua
Milli-Q, enseguida activados con etanol y finalmente secados. Las mediciones fueron llevadas a cabo
en un equipo Nano-SPR 6/321 (USA). Su fuente de luz proviene de un láser semiconductor (Ga-As,
λ = 670 nm). Debido al modo Kretschmann de operación del equipo, la luz polarizada proveniente
del láser es dividida en dos haces. La reflectividad del haz de luz fue monitoreada en función del
ángulo de incidencia (q) a través de un prisma óptico (TF1-65). El equipo cuenta con una celda de
flujo y tubing acoplados a una bomba peristáltica (Masterflex C/L, Modelo 77120-52, USA) capaz
de bombear el flujo a una velocidad máxima de 6 rpm. Se utilizó un flujo laminar bombeado mediante
una velocidad angular de 2 rpm para llevar a cabo el estudio de adsorción de las soluciones de ADN.
Para cada concentración de ADN, el chip sensor fue calibrado inicialmente con buffer EDTA/TrisHCl durante 10 min., siendo posible la obtención de una línea base. Se inyectó enseguida un volumen
de 1.5 mL de la solución de ADN dentro de la celda de flujo, permitiendo la adsorción de las
moléculas en el chip sensor durante 90 min. La formación de una película de ADN adsorbida se
identificó después de un lavado con solución buffer durante 10 min. Todos los experimentos se
llevaron a cabo a temperatura ambiente (24 ±1 ºC).
Resultados
Mediciones de Espectroscopía de Impedancia Electroquímica (EIS)
Mediante el análisis de la respuesta de capacitancia diferencial en función del potencial fue posible
determinar que a potencial de circuito abierto (OCP) controla un proceso de adsorción no específica
por difusión en la interfase ADN/platino. Los datos de impedancia para las dos interfases de estudio,
i.e. ADN/platino y ADN/Au, fueron transformados a valores de capacitancia compleja y fueron
interpretados mediante la teoría de impedancia de adsorción propuesta por Pajkossy et al. [7] y otros
autores (Figura 1). La tendencia observada en todos los espectros es consistente con la tendencia
reportada para un proceso de adsorción [7].
a)
b)
10
-Z'' / k  cm
2
0.01
5
0.1
0
100
0
5
10
15
2
Z' / k  cm
c)
d)
Figura 1.- a) Impedancia y b) Capacitancia compleja obtenidas para la concentración de ADN de 3.0 mg mL -1 a la
temperatura de 30ºC (Interfase ADN/Pt). c) Impedancia y d) Capacitancia compleja para la concentración de ADN de
3.0 mg mL-1ª la temperatura de 30ºC (Interfase ADN/Au). Frecuencia en Hz. Insertos: circuitos equivalentes que
representan tanto la impedancia como la capacitancia compleja de ambas interfases.
A altas frecuencias, el espectro puede ser modelado adecuadamente por un circuito equivalente
similar al propuesto por Frumkin-Melik-Gaikazyan-Randles (FMGR) (Insertos figura 1b y 1d) [8],
por lo tanto, la dispersión de la capacitancia compleja es descrita por el arreglo en serie de tres
parámetros eléctricos: una resistencia de adsorción (Rad) relacionada con el proceso lento de
electrosorción, un elemento de fase constante (CPE), asociado con la heterogeneidad de la superficie
y/o la distribución de la constante de tiempo, representa una capacitancia de adsorción no ideal (Cad)
y una impedancia de difusión de Warburg (ZW,ad) asociada con la difusión de las moléculas de ADN
adsorbiéndose en la interfase. Se considera la capacitancia de la doble capa (Cdl) con el acoplamiento
de un capacitor en paralelo al arreglo en serie de los tres parámetros asociados directamente con el
procesos de adsorción. Cdl está asociada con el valor de la parte real de la capacitancia compleja
obtenido en el límite de altas frecuencias, mientras que Cad está relacionada con la diferencia entre la
parte real de la capacitancia compleja en el límite de bajas frecuencias y la del límite a altas
frecuencias. La curva observada a frecuencias menores de 0.1 Hz está asociada con un proceso de
transferencia de carga incipiente, el cual fue tomado en cuenta en el circuito equivalente mediante el
acoplamiento de una resistencia, Rct, en paralelo con los demás elementos del circuito.
Mediante un análisis detallado de cada uno de los parámetros eléctricos del circuito equivalente
que simulan el proceso de adsorción fue posible identificar dos transiciones interfaciales muy bien
definidas en las concentraciones de ADN de 0.36 ± 0.07 y 1.5 mg mL-1 para la interfase ADN/Pt
(Figura 2) y 0.4 y 1.5 mg mL-1 para la interfase ADN/Au. Estos valores coinciden aceptablemente
con las concentraciones de traslape y enredamiento reportadas recientemente mediante métodos
reológicos. Los cambios en la estructura interfacial reflejados en los parámetros Cdl, Cad y Rad
dependen en gran medida de la naturaleza de las moléculas de ADN presentes en la solución. Todos
los resultados permiten proponer la teoría de adsorción como un método adecuado de interpretación
de las mediciones de EIS para caracterizar el proceso de adsorción de ADN, mediante el cual es
posible identificar las concentraciones de traslape y enredamiento, C* y Ce, y describir el
compartimiento de las cadenas de ADN solución en cada región características.
a)
b)
c)
Figura 2.- Dependencia de la a) resistencia de adsorción (Rad), b) capacitancia de adsorción (Cad) y c) capacitancia de
doble capa (Cdl) en función de la concentración de ADN a 30 ºC para la interfase ADN/Pt.
Reometría
En estudios de reología lineal del sistema ADN/Buffer, la respuesta lineal en el dominio de la
frecuencia está descrita por el módulo plateau G0 y por el tiempo de relajación de un fluido de
Maxwell (τR). Debido a que las soluciones de ADN son consideradas polidispersas en la distribución
de su peso molecular, la relación 1/c=R ha sido utilizada como una aproximación para caracterizar
la dinámica general de relajación. De esta manera, se utilizó la frecuencia de cruce del módulo elástico
(G’) y el módulo viscoso (G’’) obtenida mediante barridos de frecuencia para determinar τR. La
Figura 3a muestra los resultados de los barridos de frecuencia para diferentes concentraciones de
ADN a la temperatura de 30 ºC y la Figura 3b presenta la curva maestra de la respuesta lineal en
unidades reescaladas, es decir, G’/G0 y G’’/G0 en función de R [9].
a)
b)
1
G''/ G0
0.1
G' / G0
G', G'' (Pa )
10
0.01
0.5
0.05
C dna ( mg/ mL )
G'
G''
2.0
2.0
0.01
4.0
4.0
5.0
5.0
0.1
7.0
7.0
1
8.0
8.0
10
10.0
10.0
G'/G0
2.0
3.0
4.0
5.0
7.0
10.0
G''/G0
2.0
3.0
4.0
5.0
7.0
10.0
0.005
0.1
100
1
10
100
1000
 R
 (rad / s)
Figura 3.- a) Barridos de frecuencia para las concentraciones de ADN de 2.0, 4.0, 5.0, 7.0, 8.0 y 10 mg mL -1 a 30 ºC. b)
curva maestra de la respuesta reólogica lineal a 30 ºC.
La respuesta reólogica no lineal, i.e. esfuerzo de corte en función de la velocidad de corte (Figura
4a) fue evaluada en términos de las cantidades normalizadas *=/G0 y
muestra la curva maestra para * en función de
2.0 a 10.0 mg mL-1 a 30 ºC. Por debajo de
= 0.20, todos los puntos se encuentran superpuestos,
).
b)
5
1
C DNA (mg mL
0.1
-1
)
2.0
3.0
4.0
7.0
10
0.01
1E-3
1E-4
0.01
1
100
10000
Shear rate (1/s)
Normalized shear stress
/ G0
10
Shear stress (Pa)
[9]. La Figura 4b
para el intervalo de concentraciones de ADN de
como se esperaba para el régimen Newtoniano lineal (* =
a)
=
0.5
C DNA (mg mL
0.05
0.005
1E-4
-1
)
2.0
3.0
4.0
5.0
7.0
10.0
0.01
1
.
100
10000
Normalized shear rate
R
Figura 4.- a) Esfuerzo de corte en función de la velocidad de corte para las concentraciones de ADN de 2.0, 4.0, 5.0, 7.0,
8.0 y 10 mg mL-1 a 30 ºC. b) curva maestra de la respuesta reólogica no lineal a 30 ºC (Las líneas continuas representan
el ajuste mediante el modelo de Giesekus).
A concentraciones entre 2.0 y 6.0 mg mL-1 y
≥ 0.20, la pendiente de la curva disminuye,
mostrando la presencia del fenómeno de adelgazamiento al corte. La aparición de un plateau se
observa alrededor de
=20.0 a concentraciones de ADN mayores a 6.0 mg mL-1, lo cual se relaciona
con la presencia del fenómeno de flujo bandeado. El comportamiento reólogico no lineal fue
reproducido utilizando el modelo de Giesekus.
Resonancia de Plasmones Superficiales (SPR)
Distintos fenómenos, tales como interacciones químicas y procesos dinámicos de adsorción o
degradación en tiempo real pueden ser monitoreados mediante cambios en los ángulos de resonancia,
ocasionados a su vez por las modificaciones en los índices de refracción producidos en la superficie
metálica. Los desplazamientos observados en los ángulos de resonancia pueden ser traducidos en
incrementos de las películas adsorbidas en el chip sensor y permiten obtener, mediante la ecuación
de Feitjer [10], utilizada en simulaciones por el Software Winspall, los espesores de película ópticos
(Figura 5a).
a)
b)
2.4
Au/Buffer /H2O
Au/Buffer/c ADN 2.0 /H 2O
0.6
0.4
Película
0.2
2.0
dopt / nm
Reflectividad / a.u.
0.8
Prisma
Cr
Au
ADN
Buf f er
Espesor de
n
película óptic
o
3.89
42.77
1.9
0
1.6
Ce
1.2
kappa
1.616
2.285
0.135
1.461
1.334
0
1.639
3.606
0
0
0.8
C*
0.0
0.0
56
58
60
SPR
62
64
66
0.5
1.0
1.5
2.0
C ADN / mg mL
2.5
3.0
-1
Figura 5.- a) Simulación de la curva de reflectividad en función del ángulo de incidencia para la concentración de ADN
de 2.0 mg mL-1 mediante el software Winspall. En el inserto se resumen los espesores y propiedades ópticas de cada una
de las películas del sistema. b) Espesor de película (nm) en función de la concentración de ADN (mg mL-1).
Se estimaron los valores para los espesores de película ópticos (dopt) observados en la superficie
del chip sensor a cada una de las concentraciones de ADN, mediante los cuales se determinaron las
concentraciones de traslape (C*) y de enredamiento (Ce) (Figura 5b). Las variaciones de dopt en
función de la concentración de ADN se relacionaron con el reacomodo estructural de la doble capa
electroquímica. Δdopt/ ΔCADN y Δ/ ΔCADN fueron ajustados mediante la ley de potencia de acuerdo
a: régimen diluido (CADN<C*): dopt∼CADN0.20, régimen semi-diluido sin enredamientos
(C*<CADN<Ce): dopt∼CADN0.79 y régimen semi-diluido con enredamientos (Ce<CADN): dopt∼CADN0.57.
Conclusiones
Los resultados permiten proponer a la técnicas EIS como un método apropiado para caracterizar
el proceso de adsorción del ADN en superficies metálicas, permitiendo identificar los cambios
estructurales que se llevan a cabo en la interfase, las concentraciones C* y Ce, y los tiempos
característicos promedio del proceso, considerados parámetros de importancia para aplicaciones
biomédicas y modificación de superficies. Se identificaron condiciones a las cuales se presentan
interacciones y enredamientos entre moléculas de ADN en solución mediante el análisis del cambio
en los ángulos de incidencia y de los espesores de película ópticos (dopt) en función de CADN por SPR.
La respuesta reológica lineal a bajas frecuencias fue descrita por el módulo plateau Go y el tiempo de
relajación de un fluido de Maxwell, R. El comportamiento no lineal fue reproducido utilizando el
modelo de Giesekus. La dependencia del esfuerzo de corte con la concentración de ADN permitió
identificar la presencia de los fenómenos de adelgazamiento al corte y de flujo bandeado en
condiciones específicas.
Referencias
[1] J.M-Berg, J.L. Tymoczko, L. Stry, Biochemestry 5th Edition, New York: W H Freeman, (2002).
[2] M. Sun, S. Pejanovic, J. Mijovic, Macromolecules, 38, 9854, (2005).
[3] J.-Y. Park and S.-M. Park, Sensors, 9, 9513-9532 (2009).
[4] Y. Heo, R.G. Larson, J. Rheol., 49, 1117, (2005).
[5] T.G. Mason, A. Dhople and D. Wirtz, Macromolecules, 31, 3600 (1998).
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[7] T. Pajkossy, J. Electroanal. Chem., 364, 111, (1994).
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[9] J.-F. Berret, G. Porte and J.-P. Decruppe, Physical Review E, 55, 1668-1676 (1997).
[10] L. Duque, B. Menges, S. Borros and R. Förch, Biomacromolecules, 11, 2819 (2010).
Agradecimientos
La Dra. E. R. Larios-Durán y el Dr. J.F.A. Soltero agradecen al CONACYT por su apoyo a
través del proyecto no. CB-169379. L.M. Bravo-Anaya agradece la beca de doctorado y la beca mixta
de la convocatoria 290842 otorgadas por el CONACYT. Los autores agradecen al Laboratoire de
Rhéologie et Procédés por el apoyo recibido.