Download EXPRESION DE PROTEINAS EN LEVADURAS FCEN 2014

Expresión de proteínas recombinantes
en levaduras
Mercedes Goin
Laboratorio Denver Farma
Área Biotecnología
Elección del sistema de expresión
Complejidad de la molécula: estructura terciaria y
cuaternaria, modificaciones postraduccionales
Uso: investigación, diagnóstico, farmacéutico
Cantidad de producto
Economía
Aspectos regulatorios
BACTERIAS
Convenientes para crecimiento en grandes
fermentadores.
Se obtienen altos rendimientos (0,1-5 g/L).
En general las proteínas tendrán metionina
N-terminal.
Es frecuente la producción en forma de
cuerpos de inclusión.
No produce eventos postraduccionales.
Endotoxinas
LEVADURAS
Conveniente para el crecimiento en
grandes fermentadores.
Buenos rendimientos (0.01-1 g/L).
Introduce modificaciones
postraduccionales.
La glicosilación es distinta de la de
mamíferos: “high manosas”
La proteólisis suele ser un problema.
CÉLULAS DE MAMÍFEROS
Los cultivos en grandes escalas son difíciles de
realizar y muy costosos.
Los rendimientos son generalmente bajos (0,001-0,1
g/L).
Se producen modificaciones postraduccionales.
Para ciertas proteínas puede ser el único sistema de
expresión posible.
PLANTAS
Se producen modificaciones postraduccionales
Expresión localizada en diferentes órganos
Expresión en estadíos específicos del crecimiento
Crecimiento en campo
barato
La glicosilación es distinta que la de mamíferos
Eficiencias bajas de transformación y expresión
Seguridad controvertida
EXPRESIÓN DE
PROTEÍNAS EN
LEVADURAS
Producción de proteínas biofarmaceúticas
Levaduras
E. coli
Cel. Eucariotas superiores
Ferrer-Miralles et al. 2009, Microb. Cell Fact. 8,17.
Saccharomyces cerevisiae
Vectores de Saccharomyces cerevisiae
Vector
Secuencias de Nº de copias
levadura
/célula
Frec. transformación (a)
Inestabilidad
mitótica (b)
Integrativos
YIp
ADN
homólogo ≥ 1
102
0,1 %
Reemplazo
ADN
homólogo 1
10
Estable
ADNr
ADNr
100-200
nd
Estable
ARS
1-20
104
20 %
1-2
104
1%
104
2,8-0,2 %
Episomales
Replicadores (YRp)
Centroméricos (YCp) ARS/CEN
Basados en 2µ (YEp) ORI/STB/REP 25-200
/FLP
(a)
(b)
Transformantes por µg de ADN con esferoplastos
Células sin plásmido por generación en medio no selectivo.
Integración cromosómica de ADN por
recombinación homóloga
Vectores de Saccharomyces cerevisiae
Vector
Secuencias de Nº de copias
levadura
/célula
Frec. transformación (a)
Inestabilidad
mitótica (b)
Integrativos
YIp
ADN
homólogo ≥ 1
102
0,1 %
Reemplazo
ADN
homólogo 1
10
Estable
ADNr
ADNr
100-200
nd
Estable
ARS
1-20
104
20 %
1-2
104
1%
104
2,8-0,2 %
Episomales
Replicadores (YRp)
Centroméricos (YCp) ARS/CEN
Basados en 2µ (YEp) ORI/STB/REP 25-200
/FLP
(a)
(b)
Transformantes por µg de ADN con esferoplastos
Células sin plásmido por generación en medio no selectivo.
Marcadores de selección
1-Auxotróficos. Alelos que complementan mutaciones en
cepas auxotróficas.
Ej.: LEU2, TRP1, URA3, HIS3, usados en cepas auxotróficas
para leucina, triptofano, uracilo e histidina
2-Dominantes. Se pueden usar en una mayor variedad de
cepas.
Ej: Tn903kanr: selección con G418
DHFR: selección con metotrexate /sulfanilamida
Cmr: selección con cloranfenicol en medio con glicerol
Promotores y terminadores transcripcionales
Promotores de enzimas glicolíticas: son los más poderosos pero poco
regulables
Ej: PGK: fosfoglicerato quinasa
GAP: gliceraldehído 3 fosfato deshidrogenasa
ADH: alcohol deshidrogenasa
Son inducidos varias veces por glucosa
Promotores del metabolismo de galactosa: Son los promotores
regulables más usados.
Ej: GAL1, GAL7 y GAL10: Se inducen hasta 1000 veces por
galactosa y se reprimen por glucosa
Promotores híbridos: Ej: PGK/GAL, tiene la fuerza del promotor PGK
y la regulación de GAL
Terminadores: sólo de levaduras. En general se usa el terminador de 2µ
Secreción de proteínas en Saccharomyces
cerevisiae
¿Para qué?
Plegamiento correcto
Evitar efectos tóxicos
Facilita la purificación
Péptido señal
MFα1: feromona
SUC2: invertasa
PHO5: fosfatasa ácida
péptido N-terminal hidrofóbico
propio de levaduras
Construcción del gen para expresar en levaduras
•
1- Eliminar todas las secuencias no codificantes en la región 5’no
codificante (5’UTR) ya que secuencias ricas en G y estructuras 2as son
inhibitorias de la iniciación de la traducción
•
2- El ATG debe estar precedido por ADN rico en AT, preferentemente
AAAAAATG ya que esto favorece la iniciación de la traducción
•
3- Uso de codones propios del sistema
•
4- Usar ADNc
•
5- Analizar secuencia del gen por posibles sitios de poliadenilación,
estructuras 2as cerca del ATG, sitios de glicosilación, etc.
•
6- Incluir sitios de restricción para el clonado
Problemas asociados a la producción en S. c.
•La mayoría son promotores constitutivos.
•Falta de promotores fuertes. El producto representa
1-5% del total de las proteínas producidas.
•Inestabilidad plasmídica.
•Hiperglicosilación de glicoproteínas secretadas.
Casi todos los productos derivados de levaduras
que están en el mercado son producidos en
Saccharomyces cereviciae
2009: la FDA apueba la 1era proteína
biofarmaceútica producida en una levadura
distinta de S.c. : Inhibidor de kallicreína
producida en Pichia pastoris por Dynax Inc.
LEVADURAS METILOTRÓFICAS
• Son capaces de utilizar metanol como única fuente de C
• Poseen capacidad de crecer a altas densidades, proceso fácilmente
escalable a grandes volúmenes de producción
• La producción de proteínas heterólogas en cepas transformadas
con promotores fuertemente inducibles pueden alcanzar
rendimientos de hasta el 30 - 40% de las proteínas solubles
celulares.
• Sistema actualmente muy difundido
Hansenula polymorpha (Pichia angusta)
Candida boidinii
Pichia methanolica
Pichia pastoris
Pichia pastoris
ALCOHOL OXIDASA
•Son las primeras enzimas del camino metabólico de
metanol y están codificadas por dos genes AOX1 y AOX2.
•A nivel proteico AOX1 y AOX2 presentan un 97% de
homología
•AOX esta constituída por un octámero de subunidades
idénticas a las que se le unen moléculas de FAD.
PEROXISOMA
CITOSOL
CH3OH
CH3OH
AOX
O2
H2O2
HCHO
HCHO
GS-CH2OH
HCOOH
CO2
FLDH
NAD
NAD
NADH2
NADH2
CATALASA
DHAS
1/2O2 + H2O
FDH
GSH
Xu5P
GAP
DHA
1/3 GAP
DHA
ATP
DHAP
ADP
GAP
FBP
F6P
P2
constituyentes
celulares
•AOX tiene baja afinidad por el oxígeno. La células
compensan esta baja actividad catalítica sintetizando
grandes cantidades de la enzima. Cuando las levaduras
metilotróficas crecen en glucosa, AOX no es detectable,
mientras que en metanol llega a representar el 30-35% de
las proteínas celulares solubles.
•La síntesis de AOX está regulada a nivel transcripcional.
Promotor AOX1: fuerte, AOX2: débil
Inductor: Metanol
Represor: glucosa, glicerol, etanol
Peroxisomas
Vectores de expresión para Pichia pastoris
Inducción con
metanol
Cepa a
transformar
His-: GS115
Inducción
con glucosa o
glicerol
Reemplazo génico
Integración del ADN en genoma
Inserción génica
Recombinación homóloga
Inserción génica en AOX
Reemplazo génico
Vectores de expresión para Pichia pastoris
Inducción con
metanol
Cepa a
transformar
His-: GS115
Selección de cepas recombinantes
His+Mut+ e His+Muts
Mut +
Muts
Muts
Medio MD
Medio MM
Confirmación por PCR y Southern blot
Selección de cepas recombinantes
His+Mut+ e His+Muts
MD
MM
Caracterización del producto de expresión
SDS PAGE +/- DTT
Western blot
Caracterización de la cepa productora
PCR: presencia y estabilidad del gen
Southern blot: Mut+/Muts
Dot Blot: Nº de copias del gen
PCR cuantitativa: Nº de copias del gen
GLICOSILACIÓN DE PROTEINAS
EN LEVADURAS
El patrón de glicosilación en levaduras
es distinto del de mamíferos
GLICOSILACIÓN DE PROTEÍNAS
1- N- GLICOSILACIÓN
2- O- GLICOSILACIÓN
Glicosilación de proteínas
• Las proteínas son transportadas en vesículas al Golgi
donde los hidratos de carbono sufren modificacines
• N- glicosilación: la señal para la adición de azúcares es la
misma que para mamíferos (Asn-X-Ser/Thr). También
ocurre O-Glicosilación.
• Adicionan muchas manosas: S. Cerevisiae, 50-150
manosas. Además los oligosacáridos poseen uniones
terminales α 1-3 glicano
N- GLICOSILACIÓN
“Sequon”: Asn-X-Thr/Ser X: cualquier
aa menos Prolina
Asn
O-GLICOSILACIÓN EN LEVADURAS
α - manosa
α – 1,2 manosa
Ser/Treo
Sequon?
Abundancia inusual de ser/treo
Prolinas cerca de ser/thr
aa cargados cerca de ser/treo
GLICOSILACIÓN DE PROTEINAS EN
LEVADURAS
El patrón de glicosilación en levaduras es distinto del
de mamíferos
Las proteínas humanas, glicosiladas en levaduras,
pueden tener efectos inmunogénicos en humanos
Alternativas para prevenir la glicosilación en levaduras
Tunicamicina
Cepas mutantes
Enzimas para desglicosilar
No usar la vía de secreción
Mutagénesis dirigida
Pichia: 3-13 manosas. S.c. > 50 manosas
La productividad de un sistema recombinante está
determinada por muchos factores genéticos y fisiológicos.
Posibles cuellos de botella:
♣ Uso de codones
♣ Número de copias del gen
♣ Transcripción eficiente usando promotores fuertes
♣ Señales de traducción
♣ Translocación determinada por el péptido señal
♣ Procesamiento y plegamiento en RE y Golgi
♣ Secreción
♣ Proteólisis
Cambio de
escala
50 ml
Shake-flask
cultures
2.5 l Fermenters,
with 1.5 l working
volume
20 l Fermenters,
with 15 l working
volume
400 l Fermenters,
with 300 l working
volume
COSECHA
CENTRIFUGACIÓN
¿Qué construcción?
¿Qué precursor?
¿Qué promotor?
¿Qué péptido señal?
Fenotipo Mut
Selección del clon
Nivel de expresión proteica
Nº de copias del gen