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L. Enrique García
Director de Calidad y S. Alimentaria
luisegarcia@pulevabiotech.es
Granada, 17 Febrero 2010
1
¿Qué son?
¿Cómo se producen?
¿Qué papel juegan los laboratorios?
2
Alimentos
Alimentos funcionales
Cualquier sustancia (sólida o líquida)
normalmente ingerida por los seres vivos con
fines:
Son alimentos que tienen (y se puede
demostrar) un efecto beneficioso sobre
una o más funciones en el organismo, por
encima y más allá de los efectos habituales
de dicho alimento, tales como mejorar el
estado de salud y bienestar o reducir el
riesgo de enfermedad.
• nutricionales: regulación del metabolismo y
mantenimiento de las funciones fisiológicas.
• psicológicos: satisfacción y obtención de
sensaciones gratificantes.
Estos dos fines no han de cumplirse
simultáneamente para que una sustancia sea
considerada alimento
Composición
Contaminantes
Composición
Contaminantes
Descubrimiento
Funcionalidad
3
Son cinco las posibilidades para que un alimento sea transformado en
funcional o se incremente su funcionalidad
1.
Adición o suplementación de un alimento con sustancias o ingredientes con efectos benéficos: ej.
Antioxidantes no vitamínicos, prebióticos (FOS), …
2.
Sustitución de las sustancias con efectos negativos por otras con efectos benéficos; por ejemplo grasa
animal por grasa vegetal.
3.
Eliminación de componentes que pueden tener efectos negativos en la salud de los consumidores, por
ejemplo proteínas alergénicas.
4.
Incrementar la concentración de un componente naturalmente presente y que tiene efectos benéficos en
la salud, por ejemplo fortificación con un micronutriente, aumentar la concentración de fibra alimentaria
benéfica.
5.
Aumentar la biodisponibilidad o estabilidad de un componente para producir efectos funcionalesbenéficos.
Son alimentos -No son píldoras
La perspectiva europea difiere de la
norteamericana
(“nutraceuticals”-“pharmafoods”)
4
Algunos componentes funcionales de los alimentos
 Minerales y vitaminas: Suplir carencias asociadas a hábitos alimentarios
 Carotenoides: Neutralizan radicales libres
 Fibra dietética: Reduce el riesgo de cáncer de colon y enfermedades CV
 Flavonoides: Neutraliza radicales libres y reduce riesgos de cáncer
 Fenoles: Antioxidante, reduce el riesgo de enfermedades degenerativas
 Esteroles vegetales: Disminuye el colesterol en la sangre e inhibe la
absorción del mismo
 Probióticos/Prebióticos: Mejora la calidad de la flora intestinal
 LC-PUFA’s (Omega3): Reduce el riesgo de enfermedades CV y mejora las
funciones mentales
5
¿Son nuevos?
6
Ingredientes funcionales en Puleva Biotech
Lípidos

Producción de aceites de pescado refinados ricos en LC-PUFAs

Estabilización de aceites de pescado concentrados para uso farmacéutico

Producción de aceites micro-encapsulados (emulsiones y polvo)
Probióticos

Producción de cultivos probióticos congelados o liofilizados para aplicaciones
alimentarias y farmacéuticas
Extractos Vegetales

Producción y estandarización de extractos nebulizados en polvo

Producción y estandarización de extractos líquidos y formulaciones farmacéuticas

Estandarización de principios activos de plantas medicinales
7
Etapas en la industria de ingredientes funcionales: Puleva Biotech
Ensayos
preclínicos
“in vivo”
Ensayos
“in vitro”
Identificación y
verificación
Aislamiento y
purificación
Cribado
Ensayos
Clínicos
Regulatory
Health Claims
Transferencia
Ensayos de
bioluminiscencia,
citometría, etc..
Genómica exp.
Proteómica exp.
Metabolómica
Cromatografía
preparativa,
espectrometría de masas
y RMN
Ensayos a terceros
High throughput
screening
Desarrollo
tecnológico
Composición,
estabilidad y
contaminantes
Planta piloto
Escalado
Producción y C.
Calidad
8
Etapas en las que participa el laboratorio de análisis
Funcionalidad
(Toxicidad y Eficacia)
Composición
Contaminantes
9
Análisis
Desarrollo de nuevos métodos
10
Análisis: Ensayos de interés
Minerales (Ca, K, Mg, Na, P, Zn, Fe, Cu)
Composición de ácidos grasos
(incluidos los trans)
Ácidos grasos Omega-3
Vitaminas liposolubles (A, D y E)
Vitaminas hidrosolubles (b1, b2, b3, b5, b6, b9 y C)
Hidratos de carbono
Triglicéridos
Tocoferoles
Isoflavonas
Esteroles
Aminoácidos
Composición nutricional
(Grasa total, proteínas, cenizas, fibra …)
11
Análisis Composición: Caracterización de ingredientes
223 métodos para 100 compuestos
Falta de métodos analíticos que cubran los
compuestos (y matrices) usados en el campo
de alimentos funcionales
• Fenoles: 18 métodos
• Terpenos: 36 métodos
• Carbohidratos: 9 métodos
• Lípidos: 41 métodos
• Péptidos: 11 métodos
• Fibras: 36 métodos
• Extractos vegetales:13 métodos
• Cultivos bacterianos: 4 métodos
• Miscelánea: 55 métodos
(Edulcorantes, polioles, alcaloides,…)
• Vitaminas
• Minerales
12
Desarrollo de métodos: Detección de esteroles
• Permite detectar la adición de grasas vegetales no lacteas (B-sitosterol, stigmasterol o campesterol)
• Permite evaluar la calidad nutricional, a partir del contenido en colesterol.
• Control de ingrediente funcional: fitoesteroles
Extracción de la
grasa láctea
Adición de patrón interno
y saponificación con
KOH (MeOH)
Extracción del
insaponificable
y concentración
13
Desarrollo de métodos: Vitaminas hidrosolubles
J Agric Food Chem. 2006 Jun 28;54(13):4531-6.
Simultaneous determination of eight water-soluble vitamins in supplemented
foods by liquid chromatography.
Zafra-Gómez A, Garballo A, Morales JC, García-Ayuso LE.
Quality Department, Analytical Division, Puleva Biotech S.A., Camino de Purchil 66, E-18004 Granada, Spain.
14
.0
44
-
C2
2:
5n
3
7
DP
A
.8
83
-
C1
8:
4n
3
8
28
10
15
20
25
40
30
-
-
C2
2:
6n
C2
3:
0
.4
07
.8
77
DH
A
9
3
20
11
6
37
10
pA
.3
53
-
C2
0:
5n
3
EP
A
9
C1
8:
2n
6
9.
cis
97
6
Lin
10 - C
ole
.6 1
ico
32 8:
3
- n3
C1 L
8: ino
2 le
co n
nj ico
CL
A
8.
37
Desarrollo de métodos: Omega-3 y 6 en grasa láctea
ISO 23065:2009-IDF 211
FID1 A, (AG300106\008F0701.D)
10
Sample: M0823
5
35
40
min
15
Análisis Composición: Extractos vegetales-APIs
+ 50 métodos
en extractos
y plantas
Catequinas en te verde
Isoflavonas en leche
Polifenoles en Equinacea
16
Desarrollo de métodos: Análisis en producción
17
Contaminantes regulados
Autenticidad y trazabilidad
Situaciones de alerta
18
Análisis de seguridad alimentaria: Contaminantes regulados
Residuos de Pesticidas
Residuos de Antibióticos
(sulfonamidas,
B-lactamas,
tetraciclinas,
quinolonas y cloranfenicol)
Micotoxinas
(aflatoxinas B+G , aflatoxina M1 y ocratoxina A)
Metales pesados
(plomo, cadmio, mercurio y arsénico)
Hidrocarburos aromáticos policíclicos
Disolventes residuales
(MeOH, EtOH, hexano, acetona, acetato de etilo)
Identificación de alérgenos
(gluten, lactosa, …)
Patógenos
(Salmonella, Listeria, E. Coli, B. Cereus, S. Aureus,
C. Sakazakii)
19
Análisis de seguridad alimentaria: Contaminantes regulados
20
S. Alimentaria: Micotoxinas
21
AUTENTICIDAD: Identificación de especies botánicas
EUROPEAN PHARMACOPOEIA
COMMISSION
Black cohosh
Cimicifugae rhizoma
Monograph N°: 2069
HPTLC – Dr. Reich
Ensayo colaborativo
Detección de 5% adulteración con
Cimicifuga foetida, C. dahurica, C.
heracleifolia, o C. americana en
muestras de Cimicifuga racemosa
(Black Cohosh)
22
AUTENTICIDAD: Identificación de especies botánicas
Identificación de especies botánicas para suplementos de la dieta
K. He et al. Journal of Chromatography A, 1112 (2006) 241–254
23
AUTENTICIDAD: Aceites concentrados
Perfil normal
Perfil alterado
IRD
24
TRAZABILIDAD: Perfil proteico en leche
25
Tratamientos térmicos
Determinación de B-lactoglobulina
(proteína de lactosuero)
• HCl hasta pH 4,6
• Reposo 30 min
• Centrifugación y dilución de sobrenadante
Determinación de Furosina
(producto reacción Maillard)
• Hidrólisis ácida a 110ºC
• Filtrar y SPE (c18)
• HPLC - pares iónicos (AcH y KCl)
Determinación de Lactulosa
(isómero de lactosa)
Lactosa - 11.762
100.00
90.00
80.00
70.00
60.00
50.00
40.00
30.00
Lactulosa - 14.843
MV
•Eliminación de grasas y proteínas
•HPLC en columna iónica
•Detección y cuantificación IR
20.00
10.00
0.00
2.00
4.00
6.00
8.00
10.00
12.00
Minutes
14.00
16.00
18.00
20.00
22.00
24.00
26
Detección de leche en polvo en leche UHT
Lactulosa/furosina
≥2,5
(en leche UHT)
Leche en polvo
Leche UHT
90% leche UHT +
10% leche en polvo
Lactulosa
50
Furosina
400
Lactulosa
420
Furosina
140
Lactulosa
383
Furosina
166
Ratio l/f= 0,125
Ratio l/f= 3,000
Ratio l/f= 2,307
27
Análisis de seguridad alimentaria: Situaciones de alerta
• Melamina en productos lácteos
• ITX en envases de alimentos infantiles
• Hidrocarburos en aceite de girasol
• Benzo (a) pireno en aceites
Respuesta del
laboratorio en
48 horas
28
Participación del laboratorio
de análisis
29
Áreas de interés
 Obesidad y diabetes
 Nutrición infantil
 Metabolismo óseo
 Enfermedad cardiovascular
 Estrés oxidativo
 Hipertensión
 Salud intestinal (inflamación)
 Salud oral
Cribado
HTS de actividad
biológica
Aislamiento y
purificación
Identificación y
validación
Cromatografía
preparativa
Espectrometría de
masas y RMN
30
HT-SCREENING DE ACTIVIDAD BIOLÓGICA
Librerías productos
naturales (extractos,
péptidos, …)
Marcador
seleccionado en
función del objetivo
1000 extractos vegetales en un ensayo colorimétrico de
screening en placas de 96. Varios extractos cuyo contenido en
flavonoides es conocido dieron resultado positivo. Mediante el
uso de patrones y LC-MS confirmamos la identidad del
compuesto causante del efecto positivo.
31
AISLAMIENTO, PURIFICACIÓN e IDENTIFICACIÓN: Cromatografía preparativa
Análisis de péptidos bioactivos y
oligosacáridos en leche
Fracción de oligosacáridos aislada
por:
• deslipidación
• precipitación de proteínas
• GPC en Sephadex G-25
• colector de fracciones
Separación y cuantificación:
•Cromatografía
de
intercambio
aniónico con detección amperométrica
pulsada (HPAEC-PAD)
32
Validación pre-clínica de compuestos funcionales
Estudios “In Vitro” e “In Vivo”
Reacciones químicas (ensayos de antioxidantes ORAC,
ABTS, etc..)
Ensayos enzimáticos (lipasas, amilasas, etc..)
Líneas celulares: (enterocitos, macrófagos, fibroblastos,
etc…)
Ensayos microbiológicos: actividad antibacteriana,
resistencia a antibióticos, actividad prebiótica, etc..
Modelos animales: tolerancia y toxicidad, modelos de
obesidad, modelos de hipertensión, modelos de IBD,
alergias, etc…
In vitro
Reacciones (bio)químicas
Líneas celulares
In vivo
Tecnologías basadas en
“Ómicas”
33
APLICACIÓN DE ÓMICAS: Genómica de expresión


Los compuestos con actividad biológica
inducen cambios característicos en la
expresión de los genes.
Las muestras de cada tratamiento (dieta)
se compararán individualmente con las
muestras de la dieta control.
34
APLICACIÓN DE ÓMICAS: Genómica de expresión
Titulo experimento
Órgano-tejido
Número experimento
Número de muestras
Efecto aceites w-3 en ratones balb/c hembras (20 g)
Hígado
GEN00104
5 replicas grupos 3 y 4. 3 replicas grupos 1 y 2
Grupos
(10 animales
por grupo)
GRUPO 1 (Mantequilla)
GRUPO 2 (Mantequilla +10% w-3 alto EPA)
GRUPO 3 (Girasol)
GRUPO 4 (Girasol +10% w-3 alto EPA)
Objetivos
estudio
Analizar los efectos de la dietas ricas en
grasas saturadas y el posible efecto
beneficioso de los aceites w-3 en ratones.
Se extraerá hígado, hipocampo, sangre,
bazo, corazón y mucosa intestinal (Intestino
delgado).
35
APLICACIÓN DE ÓMICAS: Proteómica de expresión
La proteómica trata del estudio del conjunto de proteínas expresadas por un genoma en un momento determinado y
bajo determinadas condiciones ambientales.
PAPEL CENTRAL DE LAS PROTEINAS EN LA NUTRICIÓN
Transportadores (absorción intestinal, distribución y transporte en sangre); Enzimas
(metabolismo en tejidos); Proteínas de intercambio (excreción en el túbulo renal)
MUESTRAS: biopsias de tejidos, líneas celulares, fluidos biológicos
ESI-APCI
CH IP/MS
Spectrum Mill for MH
MassHunter Bioconfirmation
MassHunter Profiling
(Q)TOF-MS
PMF
Identificación y confirmación de proteínas usando la huella peptídica (PMF)
36
APLICACIÓN DE “ÓMICAS”: Metabolómica y nutrición
La metabolómica es el análisis comparativo de los metabolitos encontrados en conjuntos de muestras biológicas
similares. Los metabolitos son los intermediarios y los productos del metabolismo y actúan como
biomarcadores (enfermedad, toxicología, nutrición…)
Fluidos Biológicos
37
APLICACIÓN DE ÓMICAS: Metabolómica
Determinación de ácidos grasos de cadena corta en
heces (butírico, propiónico, fórmico y acético)
butyrate (mg/L)
800
#
600
400
*
200
0
week 0
week 2
week 4
Determinación de Glutatión y γ-GluCis celular
(estrés oxidativo)
Determinación de Homocisteína en plasma
(indicador de riesgo cardiovascular)
38
APLICACIÓN DE ÓMICAS: Bioinformática
•Dos estrategias generales para explorar
datos:
• Ensayos de hipótesis
Inducción o perturbación de un proceso
biológico lleva a resultados previstos
con anterioridad (aunque a menudo
puede revelar nuevos fenómenos)
• Descubrimiento
Análisis exploratorio de los datos. Los
datos ‘hablan por sí mismos’ después de
un procedimiento estadístico o de
visualización
Análisis de
imágenes
Data
mining
Bases de
datos
Estadística
39
Muchas gracias por vuestra atención
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Published in Spain, January 26, 2010