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TÉCNICAS DE CONTROL PARASITOLÓGICO DE LOS ALIMENTOS
Parásitos en Frutas y Vegetales
Dr. Jose E. Piñero Barroso
http://webpages.ull.es/users/jpinero
Brotes causados por Protozoos Transmitidos por Aguas o Alimentos
Waterborne outbreaks
Location
Water Type
Cases
Cryptosporidium
1987
Carrolton, Georgia (USA)
Surface water
13,000 (estimate)
1989
Oxford/Swindon (UK)
Surface water
5,000 cases of which 500 laboratory confirmed cases
1993
Milwaukee, Wisconsin (USA) Surface water
403,000 estimated
1996
Ogose (Japan)
9000 estimated
1997
North London (UK)
Borehole water
345 laboratory confirmed cases
1985
Bristol (UK)
Treated reservoir
108 laboratory confirmed cases
1992
Sweden
Drinking water at ski resort
More than 3000 cases estimated
1985–1986
Massachusetts (USA)
Unfiltered water supply
703 reported cases
1990
Chicago (USA)
Storage tank of drinking water
21
1994
Nepal
Storage tank of drinking water
12
Giardia
Cyclospora
Foodborne outbreaks
Location
Food or beverage
Cases Cryptosporidium
1993
Maine (USA)
Unpasteurised apple juice
154
1996
New York (USA)
Unpasteurised apple juice
31
1997
Washington (USA)
Unwashed salad onions
54
Giardia
1979
1985
Minnesota (USA)
Connecticut (USA)
Prepared salmon
Noodle salad at picnic
29
13
1986
New Jersey (USA)
Fruit salad at party
10
1986
Minnesota (USA)
Sandwiches (nursing home)
88
Cyclospora
1996
United States (many states) Raspberries
725 cases (55 clusters)
1997
United States (various states)
Raspberries
762 cases (41 clusters)
1997
United States
Mixed baby lettuce
Number of cases unknown
1997
United States
Basil
Number of cases unknown
1998
Canada
Raspberries
192 cases (13 clusters)
2000
Germany
Salad
26 approximately
2004
United States
Salad
95 (two outbreaks)
U.S. Food and Drug
Administration
Manual “Online” de Análisis Bacteriológico
• Manual con información básica sobre agentes
productores de enfermedades transmitidas por
alimentos:
http://www.cfsan.fda.gov/~mow/intro.html
• Manual online de análisis bacteriológico: http://www.cfsan.fda.gov/~ebam/bam‐toc.html
• Detección de parásitos en alimentos: http://www.cfsan.fda.gov/~ebam/bam‐19.html
• Detección de Cyclospora y Cryptosporidium en alimentos frescos: http://www.cfsan.fda.gov/~ebam/bam‐19a.html
Criptosporidiosis
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• Importante agente etiológico de diarreas en humanos.
• Agente causal principal: Cryptosporidium parvum.
• Uno de principales protozoos causantes de infecciones
transmitidas por consumo de aguas.
• Su ciclo biológico permite que se transmita mediante
aguas y alimentos.
• El ciclo necesita de un solo hospedador para
completarse y la vía de transmisión principal es la
fecal‐oral.
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• Un hospedador da lugar a múltiples formas
infectivas del parásito (ooquiste).
• El número de ooquistes necesarios para producir
infección es bajo: 9‐1042 ooquistes (en el caso de
Cryptosporidium parvum).
• Los ooquistes son muy resistentes a factores
ambientales.
• Existe la posibilidad de transmisión zoonótica.
• Afecta a un amplio rango de hospedadores:
mamíferos, roedores, aves, reptiles y peces.
Criptosporidiosis
Criptosporidiosis
Criptosporidiosis
Criptosporidiosis
• La transmisión al hombre incluye cualquier mecanismo
que produzca contacto con ooquistes.
• El agua y los alimentos son un vehículo de transmisión
importante.
• Fuentes de contaminación de alimentos:
– Escasa higiene en manipuladores de alimentos.
– Uso de heces como abono o fertilizante.
– Animales contaminados pasten cerca de cultivos.
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• Fuentes de contaminación de alimentos:
– Defecación de animales silvestres contaminados en cultivos.
– Contaminación directa por contacto con heces de
hospedadores de transporte coprófagos (pájaros e insectos).
– Uso de aguas residuales contaminadas para irrigación.
– Uso de aguas contaminadas para preparar aerosoles.
– Lavado de vegetales con aguas contaminadas.
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• Detección de parásitos en medio ambiente y alimentos:
– Métodos estándar:
• Identificación por inmunofluorescencia o microscopía
de contrate de fase tras:
– Captura de ooquistes por filtración.
– Elución y concentración de ooquistes por técnicas
inmunomagnéticas.
Smith HV, Cacciò SM, Cook N, Nichols RA, Tait A. (2007). Cryptosporidium and Giardia as foodborne zoonoses. Vet Parasitol. 149, (1‐2), 29‐40.
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Manufacturer Type of test1 Sensitivity2
/ distributor
Alexon, Inc.
EIA‐plate
97
98
96
94
(97)
IDEIA Dako Corp.
EIA‐plate
100
Cryptosporidium
(93.1)
MeriFluor™ Meridian DFA, IgG
100
Cryptosporidium/Giar Diagnostics, 96
dia
Inc.
(100)
Color Vue Seradyn, Inc. EIA‐plate
93
Cryptosporidium
76
94
(92)
Cryptosporidium
LMD EIA‐plate
66.3
Antigen Detection Laboratories
93
Microwell ELISA
Kit Name
(Clinical specimens)
ProSpecT/ Cryptosporidium
1EIA = enzyme immunoassay; DFA = direct immunofluorescence
Specificity2
Comparison test
98
98
99.5
99
(98)
100
(98.7)
100
100
(100)
93
100
100
(100)
99.8
99
acid‐fast stain, IIF3
acid‐fast stain
M‐DIF4
M‐DIF4, acid‐fast,
Color Vue
auramine stain, N‐DIF5
acid‐fast stain
acid‐fast, ProSpecT, Color Vue
IIF3
M‐DIF4
M‐DIF4, acid‐fast,
ProSpecT
acid‐fast, auramine
IIF3
assay, IIF = indirect immunofluorescence assay, NA = not available
2Percent specificity or specificity compared to conventional methods, numbers in parentheses indicate values reported by the manufacturer
3IIF = indirect immunofluorescence
(MeriFluor Cryptosporidium/Giardia assay)
(MeriFluor Cryptosporidium/Giardia assay)
5N‐DIF = direct immunofluorescence (DetectIF Cryptosporidium, Shield Diagnostics, Ltd.)
4M‐DIF = direct immunofluorescence
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Metodologías recomendadas para la detección de Cryptosporidium en aguas:
Anonymous, 1999 Anonymous, 1999. Water Supply (Water Quality) (Amendment)
Regulations 1999, SI No. 1524.
Anonymous, 2005 Anonymous, 2005. DWI Information letter 2005. The Water Supply
(Water Quality) (Amendment) Regulations 2000, SI No. 3184 England 2001, SI No. 3911
(W.323) Wales: Cryptosporidium in Water Supplies, Laboratory and Analytical Procedures.
Part 2, June 2005. Protocol containing Standard Operating Protocols (SOPs) for the
monitoring of Cryptosporidium oocysts in water supplies. UK Drinking Water Inspectorate
[Online: www.dwi.detr.gov.uk].
U.S.E.P.A., 2001a U.S.E.P.A., 2001a. Method 1622: Cryptosporidium in water by
filtration/IMS/FA. United States Environmental Protection Agency. Office of water,
Washington, DC. EPA 821‐R01‐026.
U.S.E.P.A., 2001b U.S.E.P.A., 2001b. Method 1623: Giardia and Cryptosporidium in water by
filtration/IMS/FA. United States Environmental Protection Agency. Office of water,
Washington, DC. EPA 821‐R01‐025.
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• Metodología estandarizada para la detección de
Cryptosporidium parvum en lechugas y frambuesas.
– Método basado en 4 fases:
• Extracción de ooquistes de los alimentos.
• Concentración del extracto y separación de ooquistes
del alimento.
• Tinción para visualización del ooquiste.
• Identificación por microscopía.
•
TN. Cook, C.A. Paton, N. Wilkinson, R.A.B. Nichols, K. Barker and H.V. Smith. Towards standard methods for the
detection of Cryptosporidium parvum on lettuce and raspberries. Part 1: Development and optimization of methods.
International Journal of Food Microbiology 2006, Volume 109, Issue 3, Pages 215‐221
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• Se obtuvieron ooquistes y se preparó una suspensión con
100 ooquistes/50 µl PBS (85% de viabilidad).
• Se contaminaron:
– Muestras con 30 gr de lechuga y 60 gr de frambuesas Æ se
contaminaron 5 zonas diferentes con 10 µl de suspensión de
ooquistes y se dejó secar 1 y 2 horas, respectivamente.
• Extracción de ooquistes:
– Se añadió una solución para extraer los ooquistes y se
sometió a diferentes tratamientos para obtener los mismos
de los alimentos.
•
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Soluciones de Extracción
Tratamientos para la Extracción
0,1M HEPES, pH 5,5
1M Bicarbonato sódico, pH 6
Homogeneización por Stomacher™
1M Glicina, pH 5,5
Homogeneización por Pulsifier™
1M Bicina, pH 5,6
Movimiento orbital
1% Lauril sulfato
“Rolling”
EBa
0,1M Tricina, pH 5,4
PBS, pH 7,2
aTampón
recomendado por la “US EPA's method 1623 (“Cryptosporidium and Giardia in Water by
Filtration/IMS/FA”)” para la extracción de ooquistes: Su composición es: 0,01 M Tris pH 7,4, 0,1% lauril sulfato, 0,005 M EDTA, 150 ppm antifoam A. •
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•
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• Separación inmunomagnética.
– Se utilizó el kit Crypto‐Scan™ (Immucell Corporation,
Portland, Maine, USA).
• Marcaje por inmunofluorescencia.
– La suspensión (50 µl) se colocó en un porta, se dejó secar y
se fijó con metanol absoluto durante 5’.
– Se tiñó con:
• Un conjugado formado por un anticuerpo monoclonal anti‐
Cryptosporidium‐isotiocianato de fluoresceina (FITC‐C‐mAb)
(Crypt‐a‐glo™, Waterborne™ Inc, USA).
• 4’6‐diamidino‐2‐fenilindol (DAPI).
•
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• Microscopía.
– Microscopio de epifluorescencia y microscopio de
contraste de interferencia diferencial de Nomarski:
• Filtro azul (excitación 490nm; emisión 510nm)
visualizar FITC‐C‐mAb
para
• Excitación UV (excitación 355; emisión 450) para visualizar
núcleos de esporozoitos teñidos con DAPI.
•
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detection of Cryptosporidium parvum on lettuce and raspberries. Part 1: Development and optimization of methods.
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• Resultados: Compatibilidad de las soluciones de extracción con el test
“Crypto‐Scan® IMS test kit”. Eficiencia en la recogida de ooquistes tras
contaminación artificial de las soluciones de extracción.
Soluciones de Extracción
•
Porcentaje de ooquistes recogidos
0,1 M HEPES, pH 5,5
89,4 (± 5,1)
1 M Bicarbonato sódico, pH 6,0
88,2 (± 9,8)
1 M Glicina, pH 5,5
105,3 (± 18,4)
1 M Bicina, pH 5,6
81,1 (± 12,5)
1% Lauril sulfato
90,2 (± 5,5)
Eb
5,9 (± 4,5)
0,1 M Tricina, pH 5,4
9,8 (± 2,5)
PBS, pH 7,2
11,4 (± 5,7)
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detection of Cryptosporidium parvum on lettuce and raspberries. Part 1: Development and optimization of methods.
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• Resultados: Compatibilidad de las soluciones de extracción con el test
“Crypto‐Scan® IMS test kit”. Eficiencia en recogida de ooquistes tras
contaminación artificial de extractos de lechugas.
Soluciones de Extracción
•
Porcentaje de ooquistes recogidos
0,1 M HEPES, pH 5,5
50,0 (± 21,8)
1 M Bicina, pH 5,6
61,1 (± 23,1)
1 M Glicina, pH 5,5
103,1 (± 7,9)
1% Lauril sulfato
Incompatible con pulsificación
1 M Bicarbonato sódico, pH 6,0
Residuos impiden determinación
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• Resultados: Compatibilidad de las soluciones de extracción con el test
“Crypto‐Scan® IMS test kit”. Eficiencia en recogida de ooquistes tras
contaminación artificial de lechugas.
Soluciones de Extracción
•
Porcentaje de ooquistes recogidos
(n=3)
1 M Glicina, pH 5,5
30,5 (± 4,9)
PBS
11,4 (± 5,7)
TN. Cook, C.A. Paton, N. Wilkinson, R.A.B. Nichols, K. Barker and H.V. Smith. Towards standard methods for the
detection of Cryptosporidium parvum on lettuce and raspberries. Part 1: Development and optimization of methods.
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•
Resultados: Extracción con 1M de Glicina. Determinación del pH óptimo para
extraer ooquistes de lechugas.
pH
•
Porcentaje de ooquistes recogidos
3
68,5 (± 8,1)
3,5
50,1 (± 10,6)
4
28,1 (± 10,8)
4,5
35,6 (± 11,2)
5
54,3 (± 8,2)
5,5
85,4 (± 14,0)
6
29,3 (± 10,3)
6,5
22,4 (± 12,4)
7
29,9 (± 8,6)
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detection of Cryptosporidium parvum on lettuce and raspberries. Part 1: Development and optimization of methods.
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•
Resultados: Comparación de métodos de extracción de ooquistes de lechugas.
Solución de extracción: 1M de glicina pH 5,5.
Método
Porcentaje de ooquistes recogidos
Movimiento orbital (n=3)
24,8 (± 5,6)
“Rolling” (n=3)
36,4 (± 4,0)
Homogeneización por Stomacher™ (n=3) 46,6 (± 9,6)
Homogeneización por Stomacher™ (n=9) 51,9 (± 15,9)
•
Homogeneización por Pulsifier™ (n=3)
75,0 (± 17,0)
Homogeneización por Pulsifier™ (n=9)
39,5 (± 9,8)
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• Resultados: Eficiencia de recuperación del método de detección de
ooquistes en lechugas.
Nº de muestras
30
•
Porcentaje de ooquistes recogidos
59,0 (± 12,0)
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• Resultados: Evaluación de eficiencia en recogida de ooquistes de
diferentes soluciones de extracción, tras contaminación artificial de
extractos de frambuesas.
Soluciones de Extracción
•
Porcentaje de ooquistes recogidos
1M Bicarbonato sódico, pH 8,4 (n=3)
42,0 (± 11,4)
1M Bicina, pH 5,6 (n=3)
30,5 (± 3,0)
0,1M HEPES, pH 5,5 (n=3)
38,1 (± 7,1)
1M Tricina, pH 5,4 (n=3)
36,2 (± 22,1)
PBS, 150 mM, pH 7,2 (n=3)
14,8 (± 5,5)
1M Glicina, pH 5,5 (n=3)
44,9 (± 14,4)
1M Glicina, pH 5,5 (n=9)
60,4 (± 10,4)
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•
Resultados: Extracción con 1M de Glicina. Determinación del pH óptimo para
extraer ooquistes de frambuesas.
pH
•
Porcentaje de ooquistes recogidos
3,5
64,7 (± 13,0)
4,5
57,6 (± 26,4)
5,5
36,5 (± 13,0)
6,5
47,2 (± 10,0)
7
44,7 (± 11,2)
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•
Resultados: Eficiencia de recuperación de ooquistes en frambuesas según
método de homogeneización: Movimiento orbital o centrifugado. Se uso
como solución de extracción 1M de Glicina pH 5,5
Método de Homogeneización
•
Porcentaje de ooquistes recogidos
Movimiento orbital (n=3)
40,5 (± 9,2)
“Rolling” (n=3)
45,4 (± 13,3)
TN. Cook, C.A. Paton, N. Wilkinson, R.A.B. Nichols, K. Barker and H.V. Smith. Towards standard methods for the
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• Resultados: Eficiencia de recuperación del método de detección de
ooquistes en frambuesas.
Nº de muestras
30
•
Porcentaje de ooquistes recogidos
41,0 (± 13,0)
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