Download Esporas y su importacia

Esporas y su importancia
Esther Vega, Ph.D.
Microbiología Aplicada
Organismos formadores de
Esporas
•
•
•
•
•
•
•
Bacillus
Clostridium
Desulfotomaculum
Sporolactobacillus
Alicyclobacillus
Thermoactinomyces
Sporosarcina
Inducción de la esporulación
• Laboratorio- Limitación de nutrientes
– Se termina uno o más nutrientes durante el
crecimiento celular (C o N)
– Cambio de las células de un medio rico a
uno pobre
– Adición de un inhibidor de la síntesis de los
nucléotidos de guanina
• Naturaleza
El proceso de esporulación puede tomar 8 horas.
Inducción de la esporulación
• ¿Cúal es la señal intracelular para la
iniciación de la esporulación?
– No es cAMP o GMP
– ¿Nucléotidos de guanidina?
• La represión por carbono puede regular la
esporulación
• Podría ser modulada de alguna forma por la
densidad celular
• Secreción de moléculas pequeñas al medio
Fenómenos asociados a la
esporulación
• Síntesis de enzimas de degradación
(amilasas, proteasas)
• Síntesis de antibíoticos
• Síntesis de toxinas protéicas contra
insectos, animales o humanos
• Desarrollo de motilidad
• Desarrollo de competencia genética
Cambios morfológicos,
bioquímicos y fisiológicos
durante esporulación
Vea figura diagrama entregado
Regulación de la expresión
genética durante esporulación
• Mutantes spo
• Asporogenia puede ser causada por
mutaciones en uno o más de 75 locus
Estructura
Estructura- Exosporio
• No tiene similitud de
estructura en celula
vegetativa
• Varia en tamano
entre las especies
• Varios de sus
componentes no
estan bien
caracterizados
Estructura- “Coat” de la
espora
• No tiene similitud de estructura en célula
vegetativa
• Varía en complejidad entre las especies
• Proteínas con enlaces S-S
– Contribuye a la resistencia a radiación
• AA de composición inusual
• Protege a la corteza de enzimas líticas
• Barrera contra químicos como agentes
oxidantes
• No role significativo en la resistencia de la
espora a calor o radiación
Estructura- “outer forespore
membrane”
• Membrana funcional
• Función en la extrema
impermeabilidad de la
espora a moléculas
pequeñas
• Composición protéica
diferente a “inner
forespore membrane”
Estructura- “inner forespore
membrane”
• Barrera de permeabilidad
a moléculas hidrofílicas y
mayoría de moléculas de
> 150 MW
• Contenido de fosfolípidos
similar a la célula
Estructura- corteza
• Capa de peptidoglican
• Similitudes y diferencias con
la pared celular
– Acido diaminopimélico vs. Lisina
– ~65% de los residuos de acido
murámico no tienen residuos
peptídicos
– Muramic acid lactam vs. Dalanine
– Menor grado de “peptide crosslinking”
• Responsable de la
deshidratación del “core” a
mucha de la resistencia de la
espora
Estructura- “germ cell wall”
• Estructura idéntica a
célula vegetativa
Estructura – “Core”
• DNA, ribosomas,
mayoría de las enzimas,
DPA y cationes
divalentes
• SASP (10-20% de la
proteína de la espora)
• Bajo contenido de agua
– 0.4-1 g/g peso seco vs.
4 g/g célula vegetativa
– Role en “spore
dormancy” y resistencia
Macromoléculas
• SASP – “small acid soluble proteins”
– Principal responsable de la resistencia de
las espora
• Provee resistencia a químicos a rompimiento
enzimático del DNA
• Altera la fotoquímica del DNA
– Sintetizada en la “forespore” durante la
fase III
Macromoléculas - SASP
• Bacillus spp. – 3 tipos
de SASP
– Tipo δ
• ~5% de la proteína de la
espora, 75-100 aa
• Se degrada durante la
germinación por GPRprovee aa
• Codificada por un sólo
gene
• No se encuentra en las
esporas de Clostridium
– Tipo αβ
• 3-5% de la proteína de
la espora,60-75 aa
• Codificada por 7 genes
• Se degrada durante la
germinación por GPR
• Proteínas enlazadoras
de DNA (vivo, in-vitro)
• Resistencia del DNA a
varios tratamientos
Moléculas pequeñas
• Los iones en el centro de la espora son
inmóbiles
• El pH del centro es 1-1.5 unidades por
debajo que la célula vegetativa
• Hay pocos compuestos de energía
Tabla 3.3
“Dormancy”
• No hay metabolismo
detectable
– Bajo contenido de
agua
– Pares de enzimasustrato
• E.g. 3PGAPhosphoglycerate
mutase (PGM), y SASPGPR
• Estable por meses o
años pero degrada en
los primeros 15 a 30
min de la germinación
Resistencia de la espora
•
Congelamiento y desecación
•
– SASP contribuye a
estabilidad del DNA
•
Presión
– >resistencia presiones altas
que bajas; presiones bajas
promueven germinación
•
δ-radiación
– SASP no estan envueltas;
baja [] agua?; mecanismo
desconocido
Radiación UV
– 7-50x más resistentes;
SASP
•
Químicos
– “spore coat”
•
Calor
– Saturación de DNA por αβ
SASP
– Mayor resistencia a calor
seco que húmedo
– Baja cantidad de agua en el
centro (core)
Ciclo de esporulación y
germinación
Activación
• Requisitos para activación
– Varia entre esporas de diferentes especies
– pH bajo, químicos, calor subletal
• Reversible en algunas especies
• Activación por calor
– Liberación de pequeñas cantidades de
DPA (mayoría de las especies)
– Liberación de DPA – B. stearothermophilus
Germinación
• Ocurre durante los primeros 20-30 min
luego de mezclar esporas con
germinante
• Dormant spore
Espora
activa metabólicamente
Germinación
• Excreción de minerales
• Excreción de DPA
– Aumento en cantidad
de agua
• Pérdida de
refractibilidad,
resistencia, “dormancy”
• Degradación de la
corteza
– 2-3x en volúmen de
corteza
– Enzímas líticas
• Reacciones
enzimáticas
– Generación de ATP y
NADH de 3PGA
– Degradación de SASP
por GPR y peptidasas
– Catabolismo de aa
– Iniciación de
catabolismo de
compuestos exógenos
• Iniciación de la síntesis
de RNA (mRNA?)
• Iniciación de la síntesis
de proteínas
Germinantes
• Germinante
–
–
–
–
Específico por especie
Metabolismo de germinante no es requerido
Interacción con una proteína específica
Compuestos de interés
•
•
•
•
•
•
Nucléosidos
aa
Azúcares
Sales
DPA
Aliquilaminas de cadenas largas
Crecimiento
• ~25 min luego de la iniciación de la
germinación de la espora hasta la primera
divisíon celular
• Requiere nutrientes exógenos (C,N)
• ~90 min en medio rico
• Se sintetizan aa, nucléotidos y otras
moléculas pequeñas
• Comienza replicación DNA ~60 min luego
comienzo de germinación
• Reparación DNA
Esporas en la industria de
alimentos
• Formadores de esporas patógenos
C. botulinum
C. perfringes
B. cereus
C. butyricum
Alimentos enlatados de baja
acidez
• Definición del FDA y
USDA
– pH>4.6 y aw>0.85
– Excepciones: tomates, pH
4.7, alimentos ácidos
• Procesamiento termal de
alimentos enlatados- U.S.
Code of Federal
Regulations (21 CFR,
parts 108-114)
– Llenado, equipo y
formulaciones
– Reporte de desviaciones del
proceso o incidentes de
contaminación
Alimentos enlatados de baja
acidez
• Esterilidad comercial
– “Aplicación de calor que inactiva
microorganismos de significado para salud
pública, al igual que microorganismos que
no tengan significado para la salud pública
pero capaces de reproducirse en el
alimento bajo condiciones normales de
refrigeración en almacenaje y distribución.”
Alimentos enlatados de baja
acidez
• Meta: esporas de C.
botulinum
• Proceso 12D o
“Botulinum cook”
– “Tiempo requerido en
un proceso termal para
la reducción de 12 log
de esporas de C.
botulinum
– Vegetales de baja
acidez y carnes no
curadas
• Tratamiento térmico
menor
– Alimentos con carga
baja de esporas
– Carnes curadas
– Alimentos de Aw bajo
– Alimentos con factores
antimicrobiales (e.g.
sal)
Alimentos enlatados de baja
acidez
• Valor D: tiempo
(min) necesario
para reducir
una población
por 1 log
• Medida de la
resistencia de
un organismo a
una
Tabla 3.4
temperatura
específica
Alimentos enlatados de baja
acidez
• Valor z: aumento en
la temperatura
necesario para
reducir el valor D
por 1 log
• Representa la
resistencia relativa
de un organismo a
inactivación a
diferentes
temperaturas
Formadores de esporas
importantes para la salud pública
•
•
•
•
•
•
•
•
•
C. botulinum- patógeno alimentario
C. perfringes- patógeno alimentario
B. cereus- patógeno alimentario
B. licheniformis- patógeno alimentario
esporádico
B. subtilis- patógeno alimentario esporádico
B. pumilus- patógeno alimentario esporádico
C. butyricum – toxina botulismo tipo E
C. barati- toxina botulismo tipo F
B. anthracis- ántrax intestinal
Daño alimentario por otros
formadores de esporas
• Tabla 3.6
HACCP yPrevención
• La seguridad en el procesamiento térmico de
los alimentos de baja acidez es mejorada con
la aplicación de HACCP
• HACCP: Control estricto en todos los
aspectos de la seguridad en la producción de
alimentos
–
–
–
–
–
–
Materia prima
Métodos de procesamiento
Ambiente en la planta
Personal
Almacenaje
Distribución
Bacillus thuringensis
Bacillus cereus
Clostridium
Bacillus anthracis
Clostridium butyricum
Bacillus cereus
Clostrium perfringes
Clostridium botulinum