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ESTUDIO DE AGENTES
PRODUCTORES DE DIARREA
Dra. Elena Campos Chacón
Centro Nacional de Referencia en
Bacteriología - INCIENSA
ESTUDIO DE AGENTES PRODUCTORES DE DIARREA
IMPORTANCIA
•
Variedad de agentes que se transmiten por alimentos
•
Variedad de signos y síntomas inespecíficos
–
–
–
•
Entre las ETAS las enfermedades diarreicas son problema de salud pública
–
–
–
–
•
Gastroenteritis (diarrea)
Enfermedades febriles
Otros síntomas de intoxicación (vómitos, neurológicos. ..)
Morbilidad
Secuelas
Mortalidad
Brotes, epidemias o pandemias
Para la prevención y control de estas enfermedades es indispensable
conocer
–
–
–
–
Agentes etiológicos causantes de las enfermedades diarreicas
En cada contexto en particular (local, regional, nacional, internacional etc.)
Identificar de la manera más precisa posible los vehículos de
transmisión (aguas, alimentos, directa)
Causas y fuentes de su contaminación
VIGILANCIA DE LAS ETAS
Artrit
is
Falla múltiple de
órganos
Ulcera
péptica
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Pa
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Hepatitis
Salmonella
Hepat
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Di a r r e a
Cáncer
Shigella
Norovirus
Vibrio cholerae
Campyloacter
AGENTES CAUSANTES DE ETAS / DIARREA
BACTERIAS
Infecciones
Shigella
Toxi-infecciones
Clostridium perfringens
Escherichia coli
Salmonella
Aeromonas
Plesiomonas shigelloides
Vibrio cholerae
Vibrio mimicus
Intoxicaciones
Staphylococcus aureus
Bacillus cereus
Vibrio parahaemolyticus
Otros vibrios
Campylobacter
Yersinia enterocolitica
(Listeria monocitogenes)
VIRUS: Hepatitis, Rota, Noro y Adenovirus……
PARASITOS: Cyclospora, Microsporidium…………..
VARIEDADE DE ALIMENTOS Y LAS
MULTIPLES FORMAS DE CONTAMINARLOS
Demostración de la transmisión fecal realizada
por Taylor, epidemiólogo de Londres
ACTIVIDADES DE LOS LABORATORIOS
CUANDO HAY UN BROTE O EPIDEMIA
Laboratorio
Laboratorio nivel
nivel local
local
Centro
Centro Nacional
Nacional de
de Referencia
Referencia
(CNRB)
(CNRB)
•• Procesamiento
Procesamiento iniciales
iniciales
•• Comunicación
Comunicación con
con las
las autoridades
autoridades de
de salud
salud
del
del nivel
nivel local
local yy el
el CNRB
CNRB
•• Recolección
Recolección de
de muestras
muestras ee información
información para
para
procesar
procesar localmente
localmente yy para
para enviar
enviar al
al CNRB
CNRB
•• Preparación
Preparación yy empaque
empaque de
de las
las muestras
muestras que
que
se
se transportaran
transportaran al
al CNRB
CNRB
•• Coordinación
Coordinación con
con el
el CNRB
CNRB para
para el
el envío
envío de
de
las
las muestras
muestras
•• Coordinación
Coordinación con
con el
el CNRB
CNRB para
para la
la
devolución
devolución de
de resultados
resultados al
al expediente
expediente
clínico
clínico
•• Apoyo
Apoyo diagnóstico
diagnóstico al
al nivel
nivel local
local
•• Investigación
Investigación por
por otros
otros patógenos
patógenos
•• Confirmación
Confirmación yy tipificación
tipificación de
de patógenos
patógenos
•• Vigilancia
Vigilancia de
de la
la resistencia
resistencia aa los
los
antimicrobianos
antimicrobianos
•• Apoyo
Apoyo logístico
logístico
Centro Nacional de Referencia en Bacteriología
Red Nacional de Laboratorios de Bacteriología
CNRB
TOTAL RNLB : 71
Nicaragua
Nicaragua
Públicos ................63
CCSS (humanos) ..........58
AyA (aguas) ..................1
MAG (alimentos) ............1
MAG (animales) ………....1
ITCR (alimentos) .............1
UNA (veterinaria) .……....1
Morgue Judicial OIJ
Privados ..................8
Costa Rica
P
P
aa
nn
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m
m
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IDENTIFICACION DE PATOGENOS
SEGUN TIPO DE MUESTRAS
– Clínicas humanas
– Clínicas animales (ídem. anterior )
– Ambiente (aguas y alimentos, superficies)
• Para el Aislamiento primario se deben seguir los métodos
aprobados USDA, AOAC, ISO, FDA,(Curso Nicaragua)
• Dependen de tipo y estado del alimento (matriz)
• Cantidad y condición del patógeno y flora
contaminante y tipo de alimento dificulta la
recuperación de patógenos como
Salmonella, Shigella y Vibrio
BUSQUEDA DE PATÓGENOS EN ALIMENTOS
Dificultades
• Consume más tiempo
• Más difícil la recuperación del patógeno
• Matrices complejas
• Flora bacteriana normal competitiva
• Procesamiento del alimento (stress)
• Volumen de materiales
• Volumen de trabajo
• Encontrar restos del alimento implicado
• Selección de muestras y patógenos a analizar
Boleta de Diagnóstico
Datos
Demográficos
Signos
Síntomas
Brote
Fechas
Antibióticos
BOLETA DE SOLICITUD DE EXAMEN
• Nombre del paciente
• Edad
• Signos y síntomas
• Fecha y hora de inicio de síntomas
• Antibiótico terapia previa a la toma de muestra
• Alimento sospechoso
• Lugar de consumo de alimentos
• Dirección vivienda
• Casos asociados
• Nombre y teléfono del que solicita el análisis
• Permita el uso racional de los recursos
de laboratorio y emitir un reporte de utilidad
para el epidemiólogo
BOLETA DE DIAGNOSTICO
CONSIDERACIONES GENERALES
•
Gran variedad de agentes que pueden ocasionar enfermedad diarreica
•
Que investigarsa partir de una muestra de heces?
•
Laboratorios CLINICO O DE SALUD PUBLICA
•
Uso de los resultados
•
Establecer protocolo de análisis
– Los signos y síntomas clínicos del paciente
– Características de las heces
– El contexto epidemiológico en que se presenta la enfermedad
– Administración de antibióticos o antidiarreicos previo a
la obtención de la muestra
– Recursos con que cuenta el laboratorio para investigar
patógenos
CONSIDERACIONES GENERALES
•
Basado en el protocolo y acorde a lo investigado el microbiólogo debe establecer las
hojas de
–
“Solicitud de Examen por Enfermedad Diarreica”
–
Formato para rechazo de muestras
–
Registro “Resultados de las pruebas de laboratorio”
–
“Resultados del Diagnóstico de Laboratorio”.
•
Comentarios o sugerencias acordes al mismo, las cuales podrían servir de mecanismo de
actualización y divulgación de la información afín al hallazgo.
•
Se deben reportar resultados negativos y positivos según lo investigado
•
Se deben aclarar imitaciones del resultado ej. calidad de la muestra,…
•
los diagnósticos positivos por enteropatógenos, no sólo son de importancia para el clínico, sino
también para alertar los sistemas de vigilancia epidemiológica
TIPOS DE MUESTRA PARA ESTUDIO DE BROTES
Origen de
muestra
Pacientes con
diarrea
Tipo de muestra
•
•
•
Manipuladores de
alimentos
•
•
•
Heces frescas, hisopado
fecal o rectal en Medio
Cary Blair
Sangre (por solicitud del
laboratorio)
Post-mortem: contenido
intestinal, hisopado rectal,
sangre
Heces, hisopado fecal o
rectal en Medio Cary Blair
Frotis faríngeo, lesiones de
piel, uñas
Sangre (a solicitud del
laboratorio)
Transporte
•
•
Cada muestra identificada
con el nombre y fecha de
recolección y con su
respectiva boleta
Transportar al laboratorio lo
más pronto posible en nevera
con gel refrigerante,
asegurando que no se
congelen
CARACTERISTICAS DE LA MUESTRA CLINICAS
•
La muestra para cultivo debe ser recolectada:
–
A partir del sitio infectado (heces, vómito, sangre)
–
En la etapa aguda de la enfermedad
–
Previo al inicio de antibióticos
–
En cantidad suficiente y evitando la contaminación
•
Con etiquetado apropiado: nombre, tipo de muestra, fecha
de recolección, iniciales de quien recolectó la muestra
•
Debe ser transportada al laboratorio en el menor
tiempo posible, en condiciones de que
garanticen la integridad de la muestra y
del que la manipula
Equipo básico para recolección de
muestras clínicas
•
•
Heces
–
Tubos vacutainer
(tapón rojo)
–Frascos
estériles, boca
ancha, con tapa hermética
–Hisopos
Sangre
estériles
–Medio
de transporte
Cary Blair
•Boletas
–
Agujas para
vacutainer
–
Torniquete
–
Gradilla para tubos
–
Algodón
–
Alcohol 70°C
de solicitud de
análisis
EC CNRB 20 04 2009
MUESTRAS CLINICAS
Paciente con diarrea muestra óptima
(1 semana, sin tratamiento, recién recolectada)
Paciente con diarrea muestra no óptima
Paciente sin diarrea muestra no óptima
(portadores asintomático etc.)
Diagnóstico de laboratorio
MUESTRAS PARA SEROLOGÍA
Enfermos
Suero agudo
Suero convaleciente
Humanos
(pruebas febriles)
Portadores?
Suero día 1
Suero día 15
Interpretación:
•De utilidad en el diagnóstico de fiebre tifoidea y
paratifoidea, no en salmonelosis.
•Basada en la seroconversión y/o puntos de corte de la
población
5/5/2009
PROCESAMIENTO INICIAL
• Normas laboratorio de Bioseguridad Nivel II.
– Incluyendo bata de laboratorio, guantes y lentes
– Atención al destapar por primera vez una muestra clínica
• Antes de iniciar el procesamiento de la muestra
– Leer la información clínico-epidemiológica que la acompaña
(especialmente edad, días de evolución, la presencia o no de
signos como la fiebre y/o vómito, el volumen y consistencia de
las heces, otros enfermos asociados, viajes, etc.)
– Determinar la calidad y tipo de muestra
ANALISIS MACRO Y MICROSCOPICO
•
Observar y anotar las características macroscópicas de la muestra (por ej.
consistencia, color, olor así como la presencia de sangre, moco o de formas
adultas de helmintos)
•
Preparaciones para observar directamente “al fresco” la presencia de quistes y
huevecillos de parásitos (obj. 10x y 40X) y empleando el 100X buscar la presencia
de leucocitos, eritrocitos y la cantidad, morfología y tipo de motilidad de la flora
bacteriana presente.
•
Gram (100 x)
•
–
morfología y características tintoriales de las bacterias
–
proporción entre la flora Gram positiva y Gram negativa
–
Búsqueda de morfotipos característicos de Campylobacter, Serpulina,
esporulados, etc.
Ziehl Nielsen (100 x)
–
estructuras semejantes a Cryptosporidium y Cyclospora
•
Con base a los resultados e información antes mencionada, el microbiólogo debe
valorar los resultados obtenidos y determinar si la diarrea puede ser o no de origen
parasitaria (mixtos).
•
Valorar emitir reporte preliminar o definitivo
Centro Nacional de Referencia en Bacteriología
Tóxico-infección por C. perfringens
(tipo A)
•
Segunda causa de enfermedad asociada a alimentos en USA
Sólo precedida por Salmonella
•
Aparición repentina de cólicos, diarrea y náusea
(generalmente sin vómitos ni fiebre)
•
PI: 7 a 15 hr.
•
Corta duración (menos de 24 hr)
•
Productos cárnicos
•
Aislamiento de al menos 105 cél/g alimento o 106/g en heces
•
Enterotoxina en heces o en cepas aisladas
•
Toxinas: 13 toxinas diferentes* (tox A)
•
Enterotoxina se libera cuando las bacterias se lisan durante la
esporulación en el intestino
Diagnóstico de laboratorio
MUESTRAS PARA CULTIVO
Heces, hisopados rectales*
Enfermos
Humanos
Sangre (durante pico febril),
Tejidos, orina, LCR, bilis,
pus de abscesos
(previo al inicio de la
antibioticoterapia)
Portadores
Heces
Enjuagues de manos
Agua
Alimentos, ambiente
(cantidad suficiente)
Utensilios
Materias primas
Alimentos preparados
5/5/2009
* Transporte en medio Cary Blair
Coprocultivo
•
Diferencias en cuanto al número y tipo de patógenos que se investigan
•
“Coprocultivo Básico” aquel en el que al menos se investigó la presencia de Salmonella, Shigella
y Vibrio cholerae
•
Incorporación progresiva de nuevos patógenos en los laboratorios, dependiendo de su nivel de
complejidad, disponibilidad de recursos y características epidemiológicas propias del nivel y área
respectiva de atención
•
De acuerdo a las consideraciones anteriores en esta primera versión de los procedimientos de
laboratorio, estaremos dando el énfasis al aislamiento y caracterización para Salmonella, Shigella
y Vibrio cholerae. (Literatura adicional
Coprocultivo básico
Aislamiento primario
• Primera fase del coprocultivo
Recuperar los componentes que conforman la flora
bacteriana de la muestra de heces, especialmente
aquellos que presenten características semejantes a
los enteropatógenos más reconocidos
Coprocultivo básico
Aislamiento primario
•
Obtener cultivos puros de cada uno de los organismos sospechosos
– enriquecimiento selectivo tiempos y temperaturas estrictas
– dilución por rayado
– recuperación de Salmonella, Shigella y Vibrio cholerae.
– medios adicionales para la recuperación de otros patógenos dependiendo de
información
• Escherichia. coli enterohemorrágica (McConkey Sorbitol)
• Campylobacter (Skirrow) (Manual incluido en el CD)
• Salmonella Typhi (Agar Ssulfito Bismuto)
• Asigne a cada colonia aislada , además del código de muestra, un código de cepa en
forma consecutiva (cepa 1,cepa 2,cepa 3,etc) que le permita reconocerla
F R O T IS Y C O P R O C U L T IV O B A S IC O
R E D N A C IO N A L D E L A B O R A T O R IO S P A R A E L D I A G N O S T IC O D E L A S E D A S / C O L E R A .
H IS O P A D O R E C T A L
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M A C -L A C T O S A
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1
R e s u lta d o p r e lim in a r
IN C U B A R
3 5 - 3 7 ° C /1 8 - 2 4 H
E X A M IN A R C R E C IM IE N T O E N P L A C A S
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T E R G IT O L - 7
M A C -S O R B IT O L *
P U R IF IC A R C O L O N IA S E N B H I ó A T S
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C N R E C -In c ie n s a , C .R . 0 1 /0 5 /0 0
A IS L A M IE N T O Y P R U E B A S B IO Q U IM IC A S B A S IC A S P A R A L A ID E N T IF IC A C IO N D E
S A L M O N E L L A , S H IG E L L A , E S C H E R IC H I A C O L I Y Y E R S IN I A
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O X ID A S A
E s c h e ric h ia c o li
C itro b a c te r s p .
E n te ro b a c te r s p .
K le b s ie lla s p .
S a lm o n e lla a r iz o n a
T a b la s 4 y 5
T S I / K IA
M O T IL ID A D
IN D O L
R .M .
V .P .
C IT R A T O
V ib r io v u ln ific u s
V . m e ts c h n ik o v ii
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T a b la s 1 y 2
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A e ro m o n a s c a v ia e
A . h y d r o p h ila
T a b la 3
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PRUEBAS
A D IC IO N A L E S
A R G IN IN A
S h ig e lla s p .
E s c h e ric h ia s p .
S a lm o n e lla s p .
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K le b s ie lla s p .
Y e r s in ia s p .
E d w a r d s ie lla s p .
P ro te u s s p .
M o rg a n e lla m o rg a n ii
O t r o s , T a b la s 4 y 5
V ib r io c h o le r a e
V m im ic u s
V . m e ts c h n ik o v ii
V . c in c in a tie n s is
V . h o llis a e
V . d a m s e la
V . f l u v i a li s
V . fu rn is s ii
V . a l g in o l y t i c u s
V . p a r a h a e m o ly tic u s
V . c a r c h a r ia e
T a b la s 1 y 2
L IS IN A
O R N IT IN A
P le s io m o n a s
s h ig e llo id e s
T a b la 3
CORDON
T N -0 % N a C l
T N -1 % N a C l
C N R E C - I n c ie n s a , C . R 2 0 0 0 - 0 5 - 0 1
T N -8 % N a C l
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T a b la 3
•
Bacilos Gram negativos
•
Oxidasa positivos
•
Géneros:
Sacarosa
Sacarosa (+)
(+)
V.
V. cholerae
cholerae
Sacarosa
Sacarosa(-)
(-)
V.
V.mimicus
mimicus
V.
V.parahaemolyticus
parahaemolyticus
– Vibrio
– Aeromonas
– Plesiomonas
Agar
Agar TCBS
TCBS
A IS L AM IE N T O E ID E N T IF IC A C IO N B IO Q U IM IC A B A S IC A P A R A
S AL M O N E L L A , S H IG E L L A Y E S C H E R IC H IA C O L I
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- B IOT IPIF IC A C ION
- F A C T OR E S D E V IR U L EN C IA
- R E S IST E N C IA A N T IB IO T IC O S
C N R E C - Inc ie nsa, C .R 20 00-0 5-01
Diagnóstico de laboratorio
Pruebas bioquímicas básicas para la
identificación del Género
Convencional
5/5/2009
Laboratorios
Nivel 1
Diagnóstico de laboratorio
Identificación del Género
API
Confirmación serológica
VITEK
Convencionales
• Salmonella O antisera
poly A-I y Vi
• Otros serogrupos “O”
(no comprendidos en el
polivalente anterior)
5/5/2009
SEROTIPIFICACI
ÓN
SEROTIPIFICACIÓN
CAMPYLOBACTER
Fecas
Medio de Skirrow
A1
directo
Medio de Butzler
Campy- bap
Medio de Skirrow
modificado
48 h, 42-43 ºC
Examen
directo
A2
indirecto
Medio selectivo
Campy thio u otro
(4 ºC, 18 h) – (42ºC)
48 h, 42-43 ºC
Método de filtración en sangre
CAMPYLOBACTER: FILTRACIÓN
Campylobacter
Colonias en Agar Sangre
Escherichia coli enteropatógena asociada
a cuadros diarreicos, Costa Rica, 2004
Diarreas por Escherichia coli enteropatógena*,
confirmadas en el CNRB, 2004
Virotipos de Escherichia coli
Positivas / total
%
118 / 205
58
Enteroinvasiva (EIEC)
4 / 108
37
Enteropatógena (EPEC)
2 / 32
6
Enterohemorrágica (EHEC)
0 / 49
-
Enteroagregativa (EAggEC)
0 / 13
-
Enterotoxigénica (ETEC-ST, ETEC-LT)
Fuente: Centro Nacional de Referencia en Bacteriologí
Bacteriología-INCIENSA y
Red Nacional
de Laboratorios de Bacteriologí
Bacteriología
CONSIDERACIONES GENERALES
•
Gran variedad de agentes que pueden ocasionar enfermedad diarreica
•
Que investigar a partir de una muestra de heces
•
Laboratorios CLINICO O DE SALUD PUBLICA
•
Uso de los resultados
•
Establecer protocolo de análisis
– Los signos y síntomas clínicos del paciente
– Características de las heces
–
El contexto epidemiológico en que se presenta la enfermedad
– Administración de antibióticos o antidiarreicos previo a la obtención de la
muestra
– Recursos con que cuenta el laboratorio para investigar patógenos.
Comunicación de resultados
• Notificación obligatoria de la “enfermedad diarreica”
diarreica
• Reportes colectivos por semana epidemiológica de los episodios de
diarrea
• Responsable de notificación: médico
• Notificación de casos de diarrea por agentes de notificación
obligatoria (ej. cólera, salmonelosis, shigelosis)
• Reporte individual inmediato
• Responsable de notificación: microbiólogo, médico
EC CNRB 20 04 2009
Participación del CNRB en Evaluaciones Externas
Internacionales
¾EQAS
¾MALBRAN
¾RIILA
La contaminación del alimento puede ocurrir en
cualquier punto de la cadena
Servicios de
alimentación al
público
Acuacultura
Entrega
Ganadería
Transporte
Proceso
Transporte y
distribución
Hogar
CONSUMIDOR
Detallistas
Agricultura
Malas prácticas
agrícolas. Emisiones
de vehículos y
fábricas, aguas negras
Fallas en Buenas Prácticas de Manufactura (BPM),
Fallas en el control de puntos críticos (HACCP)
BROTES DE FUENTE COMUN
TIPOS DE ALIMENTOS A RECOLECTAR
EN BROTES ETA
Origen de
muestra
Alimentos
Tipo de muestra
•
•
Sobras de los alimentos
servidos (mínimo 100g)
Transporte
•
Sobras del alimento en su
envase original
Alimentos líquidos
•
Mezcle para homogenizar
Transfiera una porción a un
envase estéril
Alimentos sólidas
Transfiera porciones de
diferentes sitios para asegurar
una muestra representativa
Alimentos congelados
No los descongele
•
Muestra rotulada, sellada y
empacada individualmente
de manera que el envase no
se abra e introduzca
contaminación externa
Transportar en frío (4 °C, gel
refrigerante), lo más pronto
posible al laboratorio
Cada muestra requiere de
una boleta
MEDIDAS DE BIOSEGURIDAD
Lavado de manos con
agua, jabón y alcohol 70°
•
Usar guantes, gabacha u otros
implementos necesarios,
dependiendo del agente sospechoso
y del cuadro clínico
•
Usar tubos o frascos con tapas
herméticas irrompibles
•
No enviar elementos punzantes o
cortantes
•
No envolver los frascos de las
muestras en las boletas de solicitud
de análisis
Guantes
Gabacha
bozal
Bolsas para
material
contaminado