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PREVALENCIA Y FACTORES DE RIESGO ASOCIADOS A LA PRESENCIA DE
SALMONELLA SPP., EN CANALES AVICOLAS COMERCIALIZADAS EN IBAGUÉ,
TOLIMA.
JONATAN MAURICIO RODRIGUEZ SEGURA
Trabajo de grado como requisito parcial para optar al título de
Médico Veterinario Zootecnista
Director
NOEL VERJAN GARCIA
Ph.D.
UNIVERSIDAD DEL TOLIMA
FACULTAD DE MEDICINA VETERINARIA Y ZOOTECNIA
MEDICINA VETERINARIA Y ZOOTECNIA
IBAGUE, TOLIMA
2015
2
AGRADECIMIENTOS
El autor expresa sus agradecimientos:
Al grupo de investigación en Avicultura de la facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia
de la Universidad del Tolima.
A la Oficina Central de Investigaciones de la Universidad del Tolima, por la financiación
del trabajo (proyecto No. 980213).
A la Dra. Clemencia Fandiño por la asistencia técnica en el aislamiento de Salmonella y
a los técnicos de laboratorio por su ayuda durante los análisis.
3
CONTENIDO
Pág.
1. INTRODUCCION GENERAL
10
2. OBJETIVOS
12
2.1.
OBJETIVO GENERAL
12
2.2.
OBJETIVOS ESPECIFICOS
12
3. INTRODUCCION
13
3.1. ANTECEDENTES
13
3.2. DESCRIPCION DEL PATOGENO
14
3.3. ENFERMEDAD EN HUMANOS
15
3.4. SALMONELLA EN LA CADENA AVICOLA
17
4. PREVALENCIA Y FACTORES DE RIESGOS ASOCIADOS A LA PRESENCIA DE
SALMONELLA EN CANALES AVÍCOLAS
20
4.1. INTRODUCCION
21
4.2. METODOLOGIA
21
4.2.1. Diseño del estudio y recolección de las muestras
21
4.2.2. Encuesta epidemiológica
22
4.2.3. Aislamiento microbiológico
23
4.2.4. Análisis estadístico
24
4.3. RESULTADOS
24
4.4. DISCUSION Y CONCLUSONES
26
5. CARACTERIZACION BIOQUIMICA Y MOLECULAR
31
5.1. INTRODUCCION
31
5.2. METODOLOGIA
32
5.2.1. Caracterización bioquímica y serológica
32
5.2.2. Serotipificación
33
4
5.2.3. Detección del gen invA mediante PCR
34
5.3. RESULTADOS
34
5.4. DISCUSION Y CONCLUSIONES
36
6.
CONCLUSIONES
39
RECOMENDACIONES
40
REFERENCIAS
41
5
LISTA DE TABLAS
Pág.
Tabla 1. Reacciones bioquímicas típicas para la diferenciación de especies y
subespecies de Salmonella
14
Tabla 2. Variables y categorías de la encuesta epidemiológica
23
Tabla 3. Distribución de frecuencia y valores de OR para cada variable.
25
Tabla 4. Frecuencia de los serotipos encontrados
35
6
LISTA DE FIGURAS
Pág.
Figura 1. Distribución de muestras positivas a Salmonella por comunas de la ciudad
de Ibagué.
25
Figura 2. Crecimiento de Salmonella en agar Rambach.
32
Figura 3. Aglutinación en placa de colonias de Salmonella (anticuerpos Poli AI + Vi). 33
Figura 4. Amplificación del gen invA en cepas de Salmonella aislada de canales de
pollo de engorde por PCR convencional.
35
7
RESUMEN
Salmonella entérica es un gran grupo de bacterias Gram-negativas, responsable de
toxiinfecciones alimentarias, las cuales están asociadas con el consumo de productos y
subproductos de origen animal, principalmente aviar. El status sanitario de la carne cruda
de pollo comercializada en Ibagué, Tolima, es actualmente desconocido. Para abordar
este problema, se llevó a cabo un estudio de corte transversal
para estimar la
prevalencia de Salmonella spp., en carne cruda de pollo, comercializada en diferentes
tipos de expendios. Salmonella spp., fue aislada mediante métodos microbiológicos
estándar, seguidos por confirmación serológica y molecular, todos los aislamientos
fueron
serotipificados
mediante
el
esquema
tradicional
de
Kauffman-White.
Adicionalmente, se identificaron factores de riesgo asociados a la presencia de la
bacteria. La prevalencia de Salmonella en la carne de pollo fue de 17,41% (47/270), en
donde se encontraron 14 serotipos diferentes, de los cuales S. paratyphi B (36.17%), S.
hvittingfoss (19.15%) y S. muenster
(10.64%),
representaron el 65,95% de los
aislamientos. La amplificación de un fragmento de 284 pb del gen invA, fue exitosa
mediante PCR en un número de muestras seleccionadas aleatoriamente. La venta de
canales avícolas como único tipo de cárnico comercializado (Odds ratio: 2,157, p<0.05)
y la presencia de acero inoxidable como superficie de contacto (Odds ratio: 13,29,
p<0.05), fueron identificados como factores de riesgo asociados a la presencia de
Salmonella. Este trabajo sirve como referencia para el estado de Salmonella en pollo
crudo comercializado en Ibagué, Tolima durante el periodo de febrero a mayo de 2014,
e indica la necesidad de establecer medidas de control y contingencia apropiadas para
minimizar la presencia de la bacteria en el pollo crudo y limitar su transmisión a los seres
humanos.
Palabras clave: Salmonella, canales avícolas, expendios, factores de riesgo.
8
ABSTRACT
Salmonella enterica is a large group of Gram-negative bacteria responsible for a number
of alimentary toxic infections associated with the consumption of contaminated poultry
products. The sanitary status of raw chicken meat marketed at Ibague, Tolima is currently
unknown. To address this issue, a cross-sectional study was conducted to estimate the
prevalence of Salmonella spp., in raw chicken marketed at different outlets in this city.
Salmonella spp., was isolated by standard microbiological methods, followed by
biochemical, serological and molecular confirmation and all isolates were serotyped by
conventional Kauffman-White scheme. Additionally, risk factors associated with the
presence of the bacteria were identified. The prevalence of Salmonella in raw chicken
meat was 17.41% (47/270), 14 different serotypes were found, of which S. paratyphi B
(36.17%), S. hvittingfoss (19.15%) and S. muenster (10.64%) represented 65,95% of all
serotypes in this study. Amplification of 284 bp of the invA gene was achieved by PCR in
a number of randomly selected isolates. Raw chicken as the only type of meat sold at
stores (Odds ratio: 2,157, p<0.05), and stainless steel as the contact surface of chicken
meat (Odds ratio: 13,29 , p<0.05), were found to be potential risk factors for the presence
of Salmonella in chicken meat. This work serves as a reference about the current status
of Salmonella in chicken meat marketed in Ibague, Tolima during the period FebruaryMay 2014, and indicates the need to establish appropriate control and contingency
measures to minimize the presence of the bacteria in raw chicken and limit its
transmission to humans.
Key words: Salmonella, Raw chicken, meat shops, risk factors.
9
1. INTRODUCCION GENERAL
La Salmonella es una bacteria Gram-negativa responsable de salmonelosis, una
enfermedad zoonótica de distribución mundial caracterizada por gastroenteritis, fiebre,
náusea, dolor abdominal, diarrea, vómito y deshidratación (Uribe & Suárez, 2006). El
género Salmonella comprende dos especies, S. enterica y S. bongori, siendo la primera
especie responsable de la gran mayoría de casos de infección en humanos y animales.
Actualmente se han descrito alrededor de 2600 serovariedades de S. enterica (Grimont
& Weill, 2007), no obstante, las subespecies más frecuentemente asociadas a brotes de
enfermedad en humanos constituyen la S. enteritidis y S. typhimurium (Center of Disease
Control and Prevention, 2014). Los productos de origen animal y en particular los de
origen aviar como la carne de pollo y los huevos de mesa constituyen las principales vías
de contaminación y transmisión de la bacteria al humano (Uribe & Suárez, 2006). Un
estudio reciente estableció una prevalencia de 29,6 % Salmonella en carne de pollo
comercializado en la ciudad de Ibagué (Donado-Godoy et al., 2012), no obstante, el
número de muestras analizadas en dicha investigación fue limitado (n=27) y por lo tanto
podría no reflejar la situación real.
En el departamento del Tolima, investigaciones dirigidas a conocer el estado sanitario de
las especies animales sometidas a explotación intensiva como las aves y los cerdos son
muy limitados. Un número de especies de Salmonella han sido aisladas de canales de
cerdos sacrificados en la región (Arcos-ávila et al., 2013) y recientemente, el grupo de
investigación en Avicultura reportó el aislamiento e identificación de especies de
Salmonella circulantes en granjas de gallinas ponedoras (Rodriguez, Fandiño, Donado,
Guzmán, & Verjan, 2015), y adelanta el aislamiento y caracterización de la bacteria en
granjas de pollo de engorde. No obstante, el estado sanitario de las canales de pollo en
los sitios de comercialización no ha sido abordado rigurosamente. Este estudio, buscó
establecer la prevalencia de Salmonella en canales avícolas comercializados en tiendas
y supermercados de la ciudad de Ibagué, a través de un estudio epidemiológico de corte
10
transversal, aislamiento microbiológico, caracterización bioquímica, serotipificación y
confirmación molecular.
11
2. OBJETIVOS
2.1.

OBJETIVO GENERAL
Establecer la prevalencia de Salmonella spp., serotipos y potenciales factores de
riesgo asociados a su presencia en canales de pollo comercializadas en
establecimientos de Ibagué, Tolima.
2.2.

OBJETIVOS ESPECÍFICOS
Aislar por métodos microbiológicos las especies de Salmonella presentes en
canales avícolas comercializadas en la ciudad de Ibagué, Tolima.

Establecer la prevalencia de Salmonella spp., en la canales avícolas.

Serotipificar las cepas de Salmonella spp. aisladas.

Identificar los potenciales factores de riesgo asociados a la presencia de
Salmonella en canales avícolas.

Contribuir a la formación de un estudiante de Medicina Veterinaria Zootecnia.
12
3. INTRODUCCIÓN
3.1.
ANTECEDENTES
La salmonelosis es una de las enfermedades zoonóticas de gran
importancia en
Medicina Veterinaria y en la salud pública. Las autoridades sanitarias de Colombia y otros
países del mundo han priorizado el control de las especies de Salmonella debido a su
alto impacto económico en las producciones animales como en la salud pública
(Gutiérrez, Paasch, & Calderon, 2008). La apertura económica y el aumento en el
consumo de carne de pollo, huevos y subproductos ha incrementado la frecuencia de la
infección, dado que dichos productos son
comúnmente involucrados en brotes de
enfermedad (Uribe & Suárez, 2006). Adicionalmente el incremento de las infecciones
humanas con la serovariedad enteritidis en los inicios de los años 90’s, fue atribuida en
su mayoría a la presencia de la bacteria en productos de origen avícola alrededor del
mundo (Rodrigue, Tauxe, & Rowe, 1990), así mismo otros autores reportan el aumento
significativo de este serotipo en canales avícolas procesadas en Estados Unidos, desde
el año 2000 al 2005 (Altekruse et al., 2006). Recientemente se ha estimado que cada
año, se generan 93.8 millones de casos a nivel mundial, en donde 80.3 millones están
asociados al consumo de alimentos y 115.000 terminan en la muerte (Majowicz et al.,
2010).
En Colombia la información disponible acerca del estado actual de las especies
circulantes de Salmonella en productos avícolas y aquellos responsables de infecciones
humanas es muy limitado. Recientemente salmonella typhimurium variante 5 fue aislada
de casos de salmonelosis en humanos, en Paz del Rio, Boyacá (Díaz et al., 2014). Sin
embargo, muchos de los casos no son reportados a los centros médicos, en donde la
gastroenteritis bacteriana es predominante. Adicionalmente las personas no siempre
acuden a un centro médico, siendo tratados ambulatoriamente sin un análisis clínico más
profundo. Esta situación es empeorada por los reportes de enterobacterias resistentes a
13
múltiples antibióticos, causando enormes pérdidas económicas al sistema de salud y
comprometiendo la vida de los pacientes (Rivera, Motta, Cerón, & Chimonja, 2012).
3.2.
DESCRIPCION DEL PATOGENO
El género Salmonella es un grupo de bacterias Gram-negativas pertenecientes a la
familia Enterobacteriaceae, y comprende
dos especies denominadas Salmonella
entérica y S. bongori, no obstante, recientemente se ha sugerido a S. subterránea como
la tercera especie del género (Shelobolina, Sullivan, Neill, Nevin y Lovley, 2004). La
especie S. entérica comprende más de 2600 seroviariedades y agrupa los principales
patógenos de mamíferos domésticos y humanos. S. enterica se divide en 6 subespecies:
enterica (subespecie I), salamae (subespecie II), arizonae (subespecie IIIa), diareizonae
(IIIb), houtenae (subespecie IV), e indica (subespecie VI) (Barrow & Methner, 2013), en
la tabla 1 se presenta la diferenciación bioquímica para cada una de estas especies y
subespecies.
Tabla 1. Reacciones bioquímicas típicas para la diferenciación de especies y
subespecies de Salmonella.
Fuente: Bale (2007).
14
La Salmonella también es agrupada de acuerdo a las especificidades antigénicas de
diferentes serotipos, donde el esquema Kauffman–White descrito en 1960 es el
actualmente aceptado, en el cual cada Salmonella se clasifica de acuerdo a la presencia
de un antígeno O (de pared celular), y H (Flagelar) específico, muchos expresan fases
alternas del antígeno flagelar (H1 y H2), mientras pocos producen el antígeno de
virulencia (Vi), de esta manera cada serotipo es reconocido por su única combinación
antigénica (formula antigénica) (Barrow & Methner, 2013). Así, se han identificado 67
antígenos O y 117 antígenos H, presentes en más de 2600 serovariedades (Grimont &
Weill, 2007).
La Salmonella posee un número de factores de virulencia entre los que se destacan las
islas de patogenicidad 1 y 2 (SP-1 y SP-2) las cuales codifican el sistema de secreción
tipo III (T3SS), responsable de su capacidad para invadir células no fagocíticas durante
el curso de la patogénesis (Gong et al., 2010). El desarrollo de modelos murinos ha
facilitado el estudio de la patogénesis producida por Salmonella (Barthel et al., 2003), y
ha permitido revelar
Salmonella
diferentes mecanismos moleculares mediante los cuales
la
evade los sistemas de defensa del hospedero e induce alteraciones
celulares a su conveniencia, para lo cual Salmonella es capaz de explotar los
mecanismos de inmunidad del hospedador, en beneficio propio (Behnsen, Perez-Lopez,
Nuccio, & Raffatellu, 2015). Se ha demostrado también, que la enterocolitis producida
por S. typhimurium es más severa en el íleon caudal, ciego y colon proximal, en donde
el reclutamiento de neutrófilos al epitelio intestinal es el hallazgo histopatológico
característico de salmonelosis (Coburn, Grassl, & Finlay, 2007).
3.3.
ENFERMEDAD EN HUMANOS
El cuadro clínico de Salmonelosis no tífica (gastroenteritis o enterocolitis), está dado por
una diarrea inflamatoria en donde la bacteria emplea su sistema de secreción tipo 3
(T3SS), para generar modificaciones en el citoesqueleto del enterocito, lo que le permite
invadir y residir dentro de la célula en una vesícula (Gong et al., 2010). Durante este
proceso el sistema inmune innato es activado a través del reconocimiento de patrones
15
moleculares asociados al patógeno (PAMPs), ubicados en la superficie de la bacteria,
estos patrones incluyen lipopolisacaridos (LPS) y proteínas flagelares que son
reconocidos por receptores similares a Toll (TLRs), lo que lleva a una respuesta
antibacteriana caracterizada por el incremento en la permeabilidad vascular y la atracción
de neutrófilos al sitio de infección (Tsolis, Young, Solnick & Bäumler, 2008).
Generalmente los signos asociados a esta patología incluyen fiebre, náusea, dolor
abdominal, diarrea, vómito y deshidratación, en donde los grupos etarios más
vulnerables son los niños menores de cinco años y adultos mayores de 60 años (Uribe
& Suárez, 2006). En acuerdo con esto, Huang et al., (2012) reportaron manifestaciones
clínicas más severas de salmonelosis no tifoidea en niños menores de dos años, en los
cuales predomina la fiebre, diarrea, heces con sangre y deshidratación. La salmonelosis
puede presentarse como una infección gastrointestinal autolimitante, como aquellas
generadas por los serotipos typhimurium y enteritidis (Mercado et al., 2012; Santos et al.,
2001), sin embargo, cuando la bacteria ingresa al torrente sanguíneo y se dispersa a
diferentes tejidos, constituye una amenaza para la vida del paciente.
En este caso, S. enterica serovar typhi o paratyphi, agente causal de la fiebre tifoidea,
genera una inflamación intestinal asociada a una infiltración mononuclear, en donde la
presencia de la isla de patogenisidad 7 (SPI-7), y factores codificados en su locus viaB,
incluyendo en antígeno capsular Vi, evitan el reconocimiento de antígenos de superficie
por los TLR4 y TLR5, esta evasión le permite a la bacteria establecer una infección
sistémica asociada con la fiebre entérica (Tsolis, Young, Solnick & Bäumler, 2008).
Jiménez, Valencia, Jaramillo y Correa (2011), reportan un caso de aneurisma bacteriano
con úlcera, en un paciente de sexo masculino de 62 años, quien previamente presento
síntomas asociados a salmonelosis y que además presento hemocultivos positivos a
Salmonella. Así mismo Gómez y Zuñiga (2005), reportan el caso de un paciente de 56
años de edad con abscesos esplénicos causados por Salmonella spp., con signos
gastrointestinales previos. No obstante, los factores de virulencia expresados por la
bacteria y el estado fisiológico del paciente, pueden ser críticos para determinar la forma
clínica de enfermedad (Nielsen, 2013).
16
Las pobres condiciones sanitarias contribuyen a la alta frecuencia de gastroenteritis por
enterobacterias en muchas regiones del mundo (Bayona, 2009), muchos de los casos
permanecen subregistrados dado que los pacientes no acuden a los centros de salud o
son tratados ambulatoriamente por médicos que no reportan los casos (Durango, Arrieta,
& Mattar, 2004). Adicionalmente, la gran preocupación de infección por este
enteropatógeno, se debe a los cada vez más elevados fracasos en los tratamientos con
antimicrobianos convencionales, ocasionados por la alta resistencia bacteriana (Rivera
et al., 2012).
3.4.
SALMONELLA EN LA CADENA AVICOLA
En la naturaleza como en los diferentes entornos involucrados en la producción avícola,
las bacterias existen en uno de dos estados: células planctónicas (libres en una solución),
y células sésiles (adosadas a una superficie), formando biopelículas (Chia, Goulter,
McMeekin, Dykes, & Fegan, 2009). Esta capacidad para adherirse a diferentes
superficies representa una de las principales fuentes de contaminación para que se
manifieste la salmonelosis (Shi & Zhu, 2009), principalmente por su presencia en
diferentes superficies usadas comúnmente en la producción de alimentos (Chia et al.,
2009; Møretrø, Heir, Nesse, Vestby, & Langsrud, 2012; Nguyen, Yang, & Yuk, 2014), así
como su capacidad para resistir a los tratamientos antimicrobianos y de sanitización
usados comúnmente, comparados con su forma planctónica (Wang, Ding, Wang, Xu, &
Zhou, 2013).
Cuatro serotipos particularmente están asociados comúnmente con las aves, S.
enteritidis, S. heidelberg, S. kentucky y S. gallinarum (Foley et al., 2013). En el caso de
S. gallinarum como su nombre lo indica está adaptado a las aves y conformado por dos
biovariedades, gallinarum y pullorum, las cuales eran consideradas anteriormente dos
serotipos separados, este serotipo está asociado con severas perdidas en la industria
avícola (Eswarappa et al., 2008). A nivel de producción en campo, las aves presentan
fiebre, diarrea blanquecina o verdosa, plumas erizadas, deshidratación, disminución en
los parámetros productivos y en algunos casos termina en la muerte. Así mismo cuando
17
se realiza la inspección a la necropsia, es característico encontrar hepatomegalia con
moderada decoloración verdosa y manchas blancas en el parénquima, esplenomegalia,
riñones congestionados, enteritis, tiflitis y puede presentarse regresión folicular con
atrofia ovárica (Freitas et al, 2007; Pulido et al, 2014; Shivaprasad, 2000; Wigley et al
2005).
Salmonella puede infectar a las aves en diferentes eslabones de su cadena de
producción incluyendo la producción primaria (e.g. granjas de reproductoras y granjas de
líneas comerciales), en donde puede inducir signos clínicos o más comúnmente, una
infección asintomática, dando lugar a la presencia de animales portadores que diseminan
la bacteria al resto de su parvada o a su progenie (Barua, Biswas, Olsen, Shil, &
Christensen, 2013; Carrasco, Morales-Rueda, & García-Gimeno, 2012; Ibrahim, Abd ElGhany, Nasef, & Hatem, 2014). El serotipo enteritidis puede colonizar el oviducto, y de
allí incorporarse a la albúmina, membranas o cáscara durante el proceso de formación
del huevo, dando lugar a la transmisión vertical (Gantois et al, 2009). Salmonella también
está presente en plantas de procesamiento y post-producción, en donde la
contaminación cruzada por contacto directo entre canales o el uso compartido de
materiales de procesamiento puede ocurrir (Carrasco et al., 2012). Adicionalmente, la
bacteria ha sido reportada en productos terminados tales como carne y huevos, listos
para el consumidor, así como en los manipuladores de alimentos (Bayona, 2012; El-Aziz,
2013; Finstad et al., 2012; Tammakritsada & Todhanakasem, 2012; Zhu et al., 2014).
El manejo e implementación de estrategias de intervención durante la producción y el
procesamiento reducen el riesgo de contaminación, sin embargo un leve nivel de riesgo
siempre estará presente cuando se trata de alimentos crudos (Finstad et al., 2012). Con
respecto a dichas estrategias se ha evaluado el uso de aditivos en agua y alimento para
reducir la presencia de esta bacteria en pollos broilers (Totton et al., 2012), el control de
roedores, aves e insectos (Henao, Ramírez, & Rondón, 2012), lo cual es apoyado por
los hallazgos de Hazeleger, Bolder, Beumer y Jacobs-Reitsma (2008), con respecto la
participación de escarabajos en la transmisión de Salmonella en granjas avícolas entre
lotes sucesivos. Así mismo, la dispersión de la bacteria por parte de animales portadores,
18
aunado a falencias en los programas de bioseguridad, resulta en una gran diseminación
del patógeno, lo cual perpetúa la presencia de Salmonella en el ambiente (Suresh, Hatha,
Harsha, & Lakshmanaperumalsamy, 2011). De otro lado, Arsenault, Letellier, Quessy,
Normand y Boulianne, (2007), reportan que el cierre permanente de los galpones durante
el periodo productivo, se asocia con una reducción en el riesgo de colonización por
Salmonella spp., en pollo de engorde, lo cual tiene importantes implicaciones sanitarias
asociadas al menor contacto ave-humano durante este periodo productivo, esto apoyado
por los hallazgos de Namata et al., (2009), quienes identifican como principal factor de
riesgo, la presencia de trabajadores temporales que estén en contacto con aves o
personas externas. Desde otro punto de vista, Dórea et al., (2010), demuestran efectos
positivos en la vacunación contra Salmonella en parvadas de gallinas reproductoras,
como parte de programas de prevención integral, dada la identificación del patógeno en
pollos de 1 día como un importante factor de riesgo (Marin, Balasch, Vega, & Lainez,
2011; Namata et al., 2009). Así mismo, es importante implementar estrategias de control,
dirigidas a evaluar la efectividad de los protocolos sanitarios, dado que el estatus
sanitario del galpón luego de la desinfección, al primer día de edad del pollito y en los
comederos, han sido identificados como factores de riesgo (Marin et al., 2011).
La carne de pollo ha sido reconocida como una fuente significativa de salmonelosis
humana (Finstad et al., 2012; Mercado et al., 2012; Yang et al., 2010), dado su potencial
para actuar como vehículo de cepas multiresistentes de Salmonella, las cuales son
responsables de un número de brotes de enfermedad de gran impacto en la salud
pública (Brown et al., 2003). La carne de pollo comercializada en Colombia, en muchos
de los casos no cumple con los estándares de buenas prácticas de manufactura (Flórez,
Rincón, Garzón, Vargas, & Enriquez, 2008), lo cual es empeorado en nuestro país, por
las deficientes condiciones higiénico-sanitarias evidenciadas en lugares donde se
comercializan alimentos (Bayona, 2009, 2012).
19
4. PREVALENCIA Y FACTORES DE RIESGOS ASOCIADOS A LA PRESENCIA DE
SALMONELLA EN CANALES AVÍCOLAS
4.1.
INTRODUCCION
La Salmonella es una bacteria Gram-negativa de distribución mundial responsable de la
salmonelosis, una enfermedad zoonótica que cursa con gastroenteritis, fiebre, náusea,
dolor abdominal, diarrea, vómito y deshidratación en el humano. La bacteria ha sido
aislada de granjas de gallinas ponedoras en el Tolima (Rodríguez et al., 2015) y
actualmente el grupo de investigación en Avicultura adelanta un proyecto de aislamiento
y caracterización de la bacteria a partir de pollo de engorde. No obstante, la presencia
de la bacteria en canales de pollos comercializados en la ciudad de Ibagué, así como los
potenciales factores de riesgo asociados a su presencia y/o permanencia en estos
productos no ha sido abordada rigurosamente.
Los factores de riesgo para la presencia de un patógeno en un producto o especie animal
son entendidos como factores susceptibles de ser modificados, que sin ser causas
propiamente, pueden favorecer que el agente se mantenga como contaminante en el
producto o induzca una infección en un hospedero y eventualmente la enfermedad.
Cuando la correlación entre un factor y la presencia de un microorganismo es alta, la
posibilidad de que tal asociación pueda explicarse enteramente por el efecto de factores
confusores, es mucho menor (Silva, 2005), dichos factores de riesgo, son comúnmente
identificados por diversos estudios epidemiológicos mediante el uso de la razón cruzada
o el Odds Ratio (OR) (Cerda, Vera, & Rada, 2013). Ejemplos de tales asociaciones son
evidenciadas en estudios llevados a cabo por Hue et al., (2011), quienes identifican el
sacrificio exclusivo de la especie Gallus gallus y la presencia de un solo operario durante
el proceso de evisceración en plantas de beneficio, como potenciales factores de riesgo.
Así mismo Donado-Godoy y colaboradores (2012), identificaron la procedencia de
canales avícolas de compañías no integradas y la refrigeración de las mismas como
factores de riesgo para la presencia de Salmonella en canales de pollo de engorde. En
20
cuanto al producto terminado listo para su consumo, se ha identificado por medio de
coprocultivos y frotis de manos, el rol de la higiene en los manipuladores de alimento
como factor de riesgo (Bayona, 2012), lo cual representan una importante ruta de
contaminación que puede estar asociada a la inadecuada formación y concientización
del personal manipulador de alimentos.
La prevalencia de Salmonella spp., en las canales avícolas comercializadas en Colombia
puede ser muy fluctuante, dado que los estudios epidemiológicos para establecer dicho
parámetro no son constantes y se cuenta con datos muy limitados. Donado-Godoy y
colaboradores (2012), llevaron a cabo un estudio de corte transversal entre octubre de
2010 y abril de 2011 abarcando las ciudades capitales de 23 de los 32 departamentos
de Colombia (n= 1003), en donde se encontraron las siguientes prevalencias de
Salmonella en canales de pollo para cada departamento: Sucre 1.2%, Arauca 0.4%,
Norte de Santander 3.1%, Cundinamarca 35.9%,, Santander 2.7%, Atlántico 6%,
Putumayo 0.2%, Tolima 29.6%, Cesar 1.9%, Nariño 2%, Huila 1.9%, Meta 2%, Casanare
0.6%, Córdoba 1.7%, Magdalena 2.2%, Valle del cauca 11.1%, Caldas 2%, Risaralda
2.3%, Bolívar 4.7%, Antioquia 11.6%, Quindío 1.6%, Cauca 1.4%, Boyacá 0.9%. No
obstante, el numero muestras analizadas fue muy reducida (n= 27) y los datos, en el
caso del Tolima, pueden no ser precisos. Así, este estudio buscó establecer la
prevalencia de Salmonella spp., en canales de pollo comercializados en expendios de la
ciudad de Ibagué, para el periodo Febrero-Mayo, 2014 y paralelamente identificar
potenciales factores de riesgo epidemiológico asociados a la presencia y/o permanencia
de la bacteria en dichos productos.
4.2.
METODOLOGIA
4.2.1. Diseño del estudio y recolección de las muestras. Se realizó un estudio de corte
transversal (entre febrero y mayo del 2014), para determinar la prevalencia de
Salmonella spp., en canales de pollo de engorde, comercializadas en Ibagué, Tolima. El
tamaño muestral se calculó a través de la fórmula descrita por Thrusfield (2007) con un
nivel de confianza del 95% y un error del 5%, la prevalencia esperada, estuvo basada en
21
un estudio piloto llevado a cabo por el Grupo de Investigación en Avicultura de la
Universidad del Tolima (datos no publicados), la cual fue de 22,2% (n =72). La fórmula
usada fue:
n = Z2 x p x q
d2
En donde: Z2 es el coeficiente del nivel de confianza prefijado (1.962, nivel de confianza
de 95%), p es la proporción esperada estimada para este estudio en 0.222, q es igual a
1 menos la proporción esperada (1-p), y d es la precisión o error, que para este caso fue
del 0.05. Para efectos de este trabajo se tomaron 270 muestras.
Las muestras se tomaron en forma proporcional al número de establecimientos
comerciales inscritos ante la Cámara de Comercio de Ibagué en cada una de las 13
comunas que conforman la ciudad. Cada muestra correspondió a 1 pernil de pollo,
tomado al azar, de aproximadamente 200 g, el cual fue almacenado en bolsas plásticas
herméticas, por separado y mantenido en refrigeración hasta su procesamiento en el
laboratorio.
4.2.2. Encuesta epidemiológica. Durante el muestreo, se realizó una encuesta de tipo
observacional en cada establecimiento, tomando como referencia los estudios de
Carrasco et al., (2012), Donado-Godoy et al., (2012), Nguyen, Yang, y Yuk, (2014), así
como los estudios piloto llevados a cabo por el Grupo de Investigación en Avicultura de
la Universidad del Tolima, en donde se incluyeron las variables: tipo de almacenamiento,
procedencia, tipo de establecimiento, número de personas a cargo, venta de otro tipo de
carnes, superficie de contacto, tipo de producción y manipulación (tabla 2).
Adicionalmente, se construyó un mapa epidemiológico, para indicar la distribución de las
muestras positivas por comuna usando el software ArcGIS versión 10.1.
22
Tabla 2. Variables y categorías de la encuesta epidemiológica
Variable
Categorías
Tipo de almacenaje
Procedencia
Congelado
Temperatura al momento de la colecta de -5°C
Refrigerado
Temperatura al momento de la colecta de 4 – 10°C
Compañía
Compañía que maneja gran parte o la totalidad de la
integrada
cadena de producción
Compañía
Tipo de
Descripción
no
En donde el ciclo productivo es manipulado por varias
integrada
compañías
Supermercado
Establecimiento en donde se comercializa gran variedad
establecimiento
de productos alimenticios
Expendio
Establecimiento dedicado a comercializar cárnicos y
derivados
N° personas a cargo
<2
Presencia de 1 – 2 personas en el momento del muestreo
>2
Presencia de 3 o más personas en el momento del
muestreo
Venta de otras
Si
Establecimiento en donde se comercializan diferentes
carnes
tipos de carnes
No
Establecimiento en donde únicamente se comercializan
canales avícolas y subproductos
Superficie de
Acero inoxidable
contacto
Canales que al momento del muestreo se encuentran
dispuestas en superficies de acero inoxidable
Plástico
Canales que al momento del muestreo se encuentran
dispuestas en superficies de plástico
Sistema de
Convencional
Aves caracterizadas por un color blanco de piel
De corral
Aves de corral caracterizadas por un color amarillo de
producción
piel
Manipulación
Guante
Las canales son manipuladas con guantes
Piel
Las canales con manipuladas con piel desnuda
4.2.3. Aislamiento microbiológico. Las muestras fueron llevadas al laboratorio de
diagnóstico veterinario (LADIVE) en un tiempo no mayor a 24 horas y procesadas
siguiendo
los
lineamientos
internacionales
estándar
ISO
6579:2002;
ISO
6579:2002/Amd1:2007 (Reid, 2009). Brevemente, las muestras fueron incubadas en
agua peptonada-bufferada para su pre-enriquecimiento, con un tiempo de incubación de
23
24 horas a 37 ºC, posterior al cual fueron dispuestas en caldo tetrationato (MüllerKauffmann) incubadas a 37 ºC y Rappaport Vassiliadis, incubadas a 42 ºC para su
enriquecimiento selectivo. Posteriormente, fueron sembradas en agar McConkey y agar
XLT4 (Xilosa Lisina Tergitol 4), en donde las colonias compatibles fueron confirmadas
serológica y bioquímicamente para su posterior serotipificación, lo cual es abordado en
el capítulo 3.
4.2.4. Análisis estadístico. Todas las variables fueron tabuladas y codificadas a números
en el software IBM SPSS Statistics® versión 20 y GraphPad Prism® software versión
5.03. Se realizó el análisis de los datos mediante tablas de contingencia de 2 x 2, para
establecer el nivel de independencia entre las variables y la presencia de Salmonella, así
como los valores de la razón cruzada (OR) o fuerza de dichas asociaciones. La
prevalencia fue determinada como una proporción de muestras positivas sobre el total
de muestras tomadas, expresada en porcentaje.
4.3.
RESULTADOS
En el presente estudio la prevalencia de Salmonella spp en canales avícolas fue de
17,41% (47/270), las cuales fueron aisladas de muestras de supermercados (42,5%;
20/47) y expendios (57,5%; 27/47). Un 57,5% (27/47) de los aislamientos provinieron de
locales con máximo dos personas a cargo, así como el 57,5% (27/47) se obtuvieron de
expendios donde se comercializan diferentes tipos de carnes, y el 65,96% (31/47) no
pertenecían a una compañía integrada. En cuanto a la carne de pollo comercializada, un
78,7% (37/47) de las muestras positivas provinieron de canales de aves de corral, un
51,1% (24/47) de expendios donde las canales fueron manipuladas sin guantes, y el
91,5% (43/47) de expendios donde las canales se mantenían en refrigeración, mientras
que el 97,9% (46/47) de los aislamientos se obtuvieron a partir de expendios donde el
acero inoxidable se usa como superficie de contacto. La Figura 1 muestra la frecuencia
de aislamientos por comuna, mediante la agrupación por intervalos, en donde las
comunas 12 y 13 no presentaron ningún aislamiento.
24
Figura 1. Distribución de muestras positivas a Salmonella por comunas de la ciudad de
Ibagué.
Fuente: el autor
La venta de canales avícolas, como único tipo de cárnico comercializado (Odds ratio:
2,157, p < 0.05) y la presencia de acero inoxidable como superficie de contacto (Odds
ratio: 13,29, p < 0.05), fueron las variables asociadas como factores de riesgo para la
presencia de Salmonella spp. Así mismo, la manipulación de las canales sin protección
alguna por parte de los operarios, y la presencia de 2 o menos personas a cargo del
establecimiento, se asociaron como posibles factores de protección. La distribución de
los aislamientos discriminados por factor de riesgo, así como el valor de OR para cada
uno, son presentados en la tabla 3.
Tabla 3. Distribución de frecuencia y valores de OR para cada variable.
Variable
No. (%) de muestras
positivas a Salmonella
OR*
IC** 95%
p
1,736
0,5819 - 5,177
0,4728
Almacenaje
Refrigerado
43 (18,3)
Congelado
4(11,43)
25
Procedencia
Compañía no integrada
Compañía integrada
31 (20)
1,547
0,8005 - 2,989
0,2557
1,058
0,5603 - 1,999
1
0,6841
0,3601 - 1,300
0,2452
2,157
1,124 - 4,141
0,0317
13,29
1,788 - 98,88
0,0004
1,069
0,4969 - 2,301
1
0,5838
0,3096 - 1,101
0,1009
16 (13,91)
Tipo de establecimiento
Expendio
27 (17,76)
Supermercado
20 (16,95)
N° personas a cargo
<,= 2
27 (15,43)
>2
20 (21,05)
venta de otras carnes
no
20 (25,97)
si
27 (13,99)
Superficie de contacto
Acero inoxidable
46 (21)
Plástico
1 (1,96)
Sistema de producción
De corral
37 (17,62)
Convencional
10 (16,67)
Manipulación
Mano
24 (14,37)
Guantes
23 (22,33)
*OR: Odds ratio; **IC: Intervalo de confianza
4.4.
DISCUSION Y CONCLUSIONES
Este estudio reporta una prevalencia de 17,41% (47/270) Salmonella spp., en canales
de pollo comercializado en la ciudad de Ibagué y constituye el primer registro de la
presencia de este patógeno en canales de pollo obtenido a través de un muestreo
aleatorio y un número de muestras representativas. La prevalencia obtenida fue mayor
a la reportada por Akbar y Kumar (2013) en Bangkok, Tailandia, donde se registró una
prevalencia de 5.26% (n=209), en pollo crudo comercializado en dicha ciudad, no
obstante, las condiciones de producción y comercialización podrían ser muy diferentes
entre las dos ciudades y dicha comparación deberá considerarse con más cuidado,
Previamente en Colombia, Donado-Godoy y colaboradores (2012), determinaron una
26
prevalencia de Salmonella en canales avícolas comercializadas en diferentes tipos de
expendios
del 27% (n= 1003), sin embargo la prevalencia reportada allí, para el
departamento del Tolima (2.6%), es baja comparada con la reportada por el presente
trabajo. Las diferencias en la prevalencia obtenida en este estudio y aquella reportada
por Donado y colaboradores posiblemente se deba al bajo número de muestras
procesadas por los investigadores (n= 27), mientras que la prevalencia reportada en este
estudio se fundamenta en un tamaño de la muestra muy superior y estadísticamente
significativa. Nuestros resultados son similares a la prevalencia registrada por Molina,
Millán, y Araque (2010), en el estado de Mérida, Venezuela, quienes encontraron una
prevalencia de 20% (n= 45) en pollo crudo. Sin embargo, la prevalencia de Salmonella
en canales de pollo comercializado en Ibagué, es inferior a la reportada por Zhu et al.,
(2014), quienes encontraron
una prevalencia de 41,6% en canales de pollo
comercializadas en 6 provincias de China. Finalmente, la prevalencia de Salmonella en
canales de pollo comercializado en diferentes regiones y países también depende del
método de detección empleado. Yang et al., (2010), reportaron una prevalencia de 54%
(n =515), en carnes crudas de pollo, comercializadas en Shaanxi, China, usando PCR
como método de detección. Similar a lo anterior, El-Aziz, (2013), reportó una prevalencia
de 44% en carne de pollo congelada proveniente de expendios en Asiut, Egipto,
mediante PCR Duplex. Estos estudios demuestran que la prevalencia de Salmonella en
canales de pollo comercializado en la ciudad de Ibagué, obtenida en este estudio
constituye una aproximación muy válida a la situación real del estado sanitario de este
producto avícola y sugiere la necesidad de evaluar la presencia de Salmonella en
productos cárnicos de origen aviar, así como en otros productos de la cadena avícola, e
implementar un sistema de vigilancia epidemiológica activa sobre este patógeno.
La comercialización de canales avícolas como único tipo de cárnico comercializado en
los diferentes establecimientos evaluados, se encontró como factor de riesgo para la
contaminación por Salmonella, (Odds ratio: 2,157, p<0.05), lo cual concuerda con lo
reportado por Hue et al., (2011), quienes identificaron como factor de riesgo el hecho de
que se sacrificara solo la especie animal, Gallus gallus en plantas de beneficio en Francia
(OR: 7.08, p< 0,001), donde se argumentó que el sacrificio de varias especies demanda
27
un aumento de las exigencias sanitarias y una mejor organización de los expendios que
comercializan cárnicos provenientes de diferentes especies. Sin embargo, autores como
Acosta, Pinedo, Hernández, y Villarreal, (2013), reportan una mayor prevalencia de
Salmonella spp., en cárnicos que en otros alimentos, lo cual favorece la contaminación
de las canales por problemas de contaminación cruzada y recontaminación (Carrasco et
al., 2012), en donde se ha demostrado que los manipuladores de alimentos representan
una ruta importante de contaminación (Bayona, 2012; Gomes-Neves et al., 2014). Los
expendios que comercializan diferentes tipos de cárnicos requieren una mayor cantidad
de personal, a pesar de esto, en nuestro estudio el número de operarios presentes en el
expendio al momento del muestreo, no represento un factor de riesgo estadísticamente
significativo.
Los expendios de cárnicos han sido un punto crítico en la contaminación del alimento
con microorganismos potencialmente patógenos, lo cual ha estado asociado a la
contaminación cruzada y recontaminación, generadas por malas prácticas de higiene y
desinfección (Carrasco et al., 2012). Arcos-ávila et al., (2013), aislaron una mayor
cantidad de cepas de Salmonella spp., a partir de expendios que comercializan carne de
cerdo, comparado con plantas de sacrificio, poniendo en evidencia el papel del manejo
de las canales en los mismos expendios como posible fuente de contaminación.
El acero inoxidable como superficie de contacto, fue identificado como factor de riesgo
en este estudio (Odds ratio: 13,29, p<0.05), lo cual concuerda con lo reportado por Chia
et al., (2009), Nguyen et al., (2014), quienes encontraron que diferentes serotipos de
Salmonella, tenían una mayor adhesión al acero inoxidable, que al plástico y el acrílico,
sin embargo, las características particulares de la membrana externa de cada serotipo,
influencian su capacidad de adhesión a las diferentes superficies (Van Houdt & Michiels,
2010). En este aspecto, Tammakritsada y Todhanakasem (2012), demostraron una alta
capacidad de Salmonella para formar biopeliculas (biofilmes) sobre el poliestireno así
como en superficies de vidrio, de forma similar, Wang y colaboradores (2015),
demostraron la facilidad de Salmonella para formar biofilmes en el acero inoxidable y
especialmente la transferencia a productos cárnicos, en donde la hidrofobicidad del
28
serotipo y de la superficie de contacto, influencian de manera positiva el proceso de
adherencia (Chia et al., 2009; Pérez-Rodríguez, Valero, Carrasco, García, & Zurera,
2008). Se debe tener en cuenta también que las biopelículas que se forman en el acero
inoxidable, son más sensibles a los desinfectantes, que las encontradas adheridas al
plástico (Joseph, Otta, Karunasagar, & Karunasagar, 2001), sin embargo el mal uso de
protocolos de desinfección dado por concentraciones por debajo de las recomendadas,
tiempo de exposición inadecuados, entre otras variables pueden influir sobre la
efectividad de los desinfectantes (Møretrø et al., 2012). Arcos-ávila et al., (2013), aislaron
Salmonella a partir de fómites tales como cuchillos, y mesones, en los cuales se usa
generalmente el acero inoxidable, destinados al procesamiento de cárnicos, lo que
resalta la importancia de implementar planes de limpieza y desinfección de equipos y
utensilios, así como de muestreos microbiológicos para verificar que estos planes de
desinfección cumplen con su objetivo, además de la concientización del personal
manipulador de alimentos.
Contrario a lo evidenciado en el presente estudio, Donado-Godoy et al., (2012),
encontraron que la variable procedencia de la canal a partir de compañías no integradas
(OR: 2.0, p< 0,001), se identificó como factor de riesgo para la presencia de Salmonella
spp, y argumentaron un menor control de calidad en cada eslabón de la cadena de
producción, comparado con el control en las compañías integradas. Los autores también
identificaron la refrigeración de las canales (OR: 4.3, p<0,001), como un importante factor
de riesgo para Salmonella, una variable también identificada por Zhu et al., (2014), al
comparar canales refrigeradas frente
a canales congeladas y recién sacrificadas
(p<0,001), en este aspecto es necesario resaltar que Salmonella es capaz de proliferar
en carne de pollo a temperaturas ≤10°C (Smadi, Sargeant, Shannon, & Raina, 2012).
En el presente estudio, el número de personas en el expendio no representó un factor
de riesgo para Salmonella en canales de pollo comercializadas en la ciudad de Ibagué
(p>0.05). Sin embargo se resalta la importancia de implementar medidas de control
sanitario, educación y concientización del personal manipulador de dichos productos,
que permita reducir la presencia de Salmonella en el producto terminado.
29
Este estudio estableció la presencia de Salmonella spp.,en el 84,61% de comunas de la
ciudad de Ibagué, no obstante la bacteria no fue aislada de los productos
comercializados en las comunas 12 y 13, localizadas en zonas marginales de la ciudad,
donde las tiendas de barrio poseen medidas higiénicas aún más pobres. La razón de
estos resultados podría ser un efecto del muestreo al azar, donde no se registró el tiempo
de almacenamiento de las canales y posiblemente las muestreadas en dicho
establecimiento habrían sido las más frescas. Otra posible razón seria que
eventualmente y debido al riesgo inminente de contaminación de dichos productos o la
historia de infecciones, en estas comunas podría existir una mejor manipulación del
producto y/o una mejor prevención de la contaminación. Finalmente, estos hallazgos
pueden ser debidos a razones desconocidas que deberán ser abordadas en estudios
futuros.
30
5. CARACTERIZACION BIOQUÍMICA Y MOLECULAR
5.1.
INTRODUCCION
El género Salmonella es un grupo muy amplio de microorganismos que comprende
alrededor de 2600 serovariedades (Grimont & Weill, 2007). Por lo tanto, ha sido
necesario el desarrollo de un número de herramientas moleculares para ayudar la
identificación de los distintos serogrupos y serovariedades, Las características propias
de cada serotipo, resaltan la importancia y pertinencia de la caracterización molecular de
los aislamientos involucrados con casos de enfermedad. Rahn y colaboradores (1992),
emplearon por primera vez la detección molecular por PCR de Salmonella mediante el
uso del gen invA. O’Regan et al., (2008), propusieron el uso de PCR en tiempo real
como técnica de rutina en los laboratorios de diagnóstico, para identificar los serotipos
involucrados en estudios de vigilancia epidemiológica.
Actualmente, la técnica molecular electroforesis en gel en campo pulsado (PFGE),
constituye la herramienta indicada para la asociación de fuentes de contaminación con
casos de enfermedad, a manera de ejemplo, en estudios llevados a cabo por Brown y
colaboradores (2003) y Chen y colaboradores (2012), se demostró por medio de PFGE,
que los serotipos java y schwarzengrund aislados a partir de carne de pollo, tenían
patrones idénticos a aislamientos provenientes de humanos, lo cual sugirió fuertemente
que la carne de pollo fue la fuente de contaminación.
La serotipificación constituye uno de los estudios básicos en la búsqueda de posibles
fuentes de contaminación, y puede proveer un vínculo entre el paciente y la fuente de
infección (Finstad et al., 2012). Existe una mayor frecuencia de ciertos serotipos de
Salmonella asociados a brotes de enfermedad en humanos, y las normativas sanitarias
tienden a discriminar estas variantes, como en el caso de la Unión Europea, regulación
número 1086/2011, en donde se demanda la ausencia de S. enterica subsp. enterica
serotipos enteritidis y typhimurium, incluyendo su variante 4,[5],12:i:− en 25g de carne
31
cruda, por lo cual, autores como Maurischat, Baumann, Martin y Malorny (2015),
proponen la implementación de técnicas rápidas de diagnóstico en laboratorio para estos
serotipos mediante PCR múltiple en tiempo real.
Los serotipos S. infantis, S. newport, y S. hadar, son comúnmente aislados de la cadena
avícola y representan un riesgo potencial para la salud humana, debido a que han sido
recientemente asociados a brotes de enfermedad por contacto directo con aves vivas
(Center of Disease Control and Prevention, 2014). Además datos del programa FoodNet,
del centro de control y prevención de enfermedades (CDC), indican que alrededor del
50% de casos en humanos con los serotipos typhi, dublin, paratyphi A y choleraesuis,
son invasivas y su infección no se limita a una gastroenteritis autolimitante (Vugia et al.,
2004). Adicionalmente, los serotipos agona, anatum, bareilly, brancaster, brandenburg,
cerro, derby, enteritidis, galiema, gaminara, hadar, heidelberg, indiana, kallo, kottbus,
litchfield, livingston, mbandaka, meleagridis, molade, montevideo, othmarschen, rissen,
schwarzengrund, shannon, shubra, tennessee, thompson, typhimurium y uganda se han
identificado en productos de origen avícola (Chen et al., 2012; Durango et al., 2004; Hue
et al., 2011; Molina et al., 2010; Rodriguez et al., 2015; Suresh et al., 2011; Yang et al.,
2010).
5.2.
METODOLOGIA
5.2.1. Caracterización bioquímica y serológica. Las colonias compatibles fueron
sembradas en agar Rambach y confirmadas como Salmonella spp., mediante
aglutinación con anticuerpos Poli AI + Vi (Difco® 222641). Las colonias positivas, fueron
confirmadas bioquímicamente mediante el uso de la galería API® 20E gallery
(Biomereux, France).
32
Figura 2. Crecimiento de Salmonella en agar Rambach. Se observa la formación de
colonias rojas, típicas de Salmonella, comparado con la formación de colonias verdes,
típicas de microorganismos coliformes.
Fuente: el autor
Figura 3. Aglutinación en placa de colonias de Salmonella (anticuerpos Poli AI + Vi).
Fuente: el autor
33
5.2.2. Serotipificación. Se realizó con base en el esquema kauffmann white (Brenner,
1998), siguiendo la descripción antigénica reportada por Grimont y Weill (2007), así
como la nomenclatura descrita por Tindall, Grimont, Garrity y Euzéby (2005), y la
comisión del comité internacional en la sistemática de procariotas (JCICSP, 2005). El
estudio se llevó a cabo el Institutito Colombiano Agropecuario (ICA).
5.2.3. Detección del gen invA mediante PCR. Los aislamientos de Salmonella fueron
sembrados en caldo triptona soya (TSB), e incubadas por 24h a 37°C. El ADN crudo fue
preparado mediante ebullición de las colonias por 10 minutos, luego fueron incubadas
en hielo por pocos minutos y centrifugadas a 12.500 rpm por 5 minutos para su
sedimentación. El sobrenadante fue colectado como ADN crudo, y 5 μL fueron usados
como plantilla en la mezcla de PCR para amplificar en gen invA usando los cebadores
forward 5’-GTG AAA TTA TCG CCA CGT TCG GGC AA-3’ y reverse 5’-TCA TCG CAC
CGT CAA AGG AAC C-3’ (Invitrogen™, Thermo Fisher Scientific Inc.), con un tamaño
de amplificación esperado de 284 pb.
La PCR fue llevada a cabo en un volumen total de 25 μL conteniendo 4 μl de ADN
plantilla, 1 μL de cebador forward, 1μL de cebador reverse, 0,2 μL de Taq polimerasa,
2,5 μL de buffer 10X, 2,5 μL de MgCl2, y 13,8 μL de agua desionizada. La PCR fue llevada
a cabo en un el termociclador DNA thermal cycler BIO-RAD T100™, en donde posterior
a una desnaturalización inicial de 1 minuto a 94°C, se realizaron 35 ciclos de
amplificación, cada ciclo consistió de los siguientes pasos: 60 segundos a 94°C
(desnaturalización), 30 segundos a 64°C (hibridación del cebador), y 30 segundos a 72°C
(extensión), esto fue seguido de 7 minutos a 72°C para la extensión final. Los productos
de la reacción se mezclaron con buffer de carga 10X, y resuelto por electroforesis en
agarosa al 2% con un marcador de peso molecular de 100pb. El gel fue teñido con
bromuro de etidio y visualizado bajo luz ultravioleta usando un sistema documentador de
geles ENDUROTM GDS (Labnet International, Inc.).
5.3.
RESULTADOS
34
Los principales serotipos encontrados fueron Paratyphi B 36,17% (17/47), Hvittingfoss
19,15% (9/47), y Muenster 10,64% (5/47), además se identificaron los serotipos
Typhimurium, Newport, Heidelberg, Braenderup y Kalina cada uno en un porcentaje de
4,26% (2/47), mientras los serotipos Bovismorbificans, Budapest, Manhattan,
Othmarschen, Schwarzengrund, y Skansen fueron de menor frecuencia (2,13% cada
uno; 1/47).
Tabla 4. Frecuencia de los serotipos encontrados.
SEROTIPOS
FRECUENCIA PORCENTAJE
Paratyphi B
17
36,17
Hvittingfoss
9
19,15
Muenster
5
10,64
Braenderup
2
4,26
Heidelberg
2
4,26
Kalina
2
4,26
Newport
2
4,26
Typhimurium
2
4,26
Bovismorbificans
1
2,13
Budapest
1
2,13
Manhattan
1
2,13
Othmarschen
1
2,13
Schwarzengrund
1
2,13
Skansen
1
2,13
TOTALES
47
100
Un número de aislamientos de Salmonella fueron seleccionados para la detección del
gen invA mediante el uso de PCR. La figura 4, muestra la imagen representativa de los
resultados de dicha técnica, en donde la banda de 284pb, esperada para el gen invA, se
amplifico en un número de aislamientos seleccionados al azar.
35
Figura 4. Amplificación del gen invA en cepas de Salmonella aislada de canales de pollo
de engorde por PCR convencional. La línea M representa el marcador de peso molecular
de 100pb, la línea 1 representa el control negativo, la línea 2 representa el control positivo
(Salmonella typhimurium), las líneas de 3 a 12 representan S. newport, S. skansen, S.
schwarzengrund, S. kalina y S. paratyphi B las restantes, respectivamente.
Fuente: el autor
5.4.
DISCUSION Y CONCLUSIONES
Salmonella enterica serovares enteritidis y typhimurium han sido los serotipos de mayor
frecuencia en aves domésticas (Finstad et al., 2012; Ibrahim et al., 2014; Kim, 2010). En
el presente estudio el serotipo de mayor presentación fue S. paratyphi B, el cual ha
demostrado estar adaptado a las aves comerciales (Toboldt et al., 2013; van de Giessen
et al., 2006; Van immerseel et al., 2004), hallazgo que es similar a lo reportado por
Boscán et al., (2005), quienes aislaron la bacteria a partir de vísceras de pollo en dos
plantas de beneficio en el estado de Zulia, Venezuela. Este serotipo también fue aislado
en dos granjas de reproductoras y una de pollo de engorde en Bangladesh (Barua et al.,
2013). S. Paratyphi B ha sido aislado a partir de productos de origen aviar desde
principios de los años 90´s y aumento en países como Alemania, en donde Miko, Guerra,
Schroeter, Dorn y Helmuth (2002), demostraron el surgimiento de clones multiresistentes
de este serotipo. Recientemente, Egervärn et al., (2014), reportaron la presencia de S.
paratyphi B en canales avícolas importadas a Suiza, provenientes de Alemania, lo que
sugiere la persistencia del serotipo en los productos avícolas provenientes de este país.
36
así mismo van de Giessen et al., (2006), reportaron el surgimiento de S. paratyphi B var.
Java en el año 2002, como uno de los serotipos predominantes en granjas de pollo de
engorde en Holanda. Más recientemente, Godoy, (2010), reporta por primera vez la
presencia de S. paratyphi B var Java en la cadena avícola colombiana, principalmente
en el departamento de Cundinamarca y Santander, representando el 76% de
aislamientos en campo y 51% de aquellos aislados de muestras de carne cruda, siendo
el serotipo más prevalente en este estudio. S. muenster es un serotipo reportado en
alimentos de origen animal incluyendo embutidos de cerdo, (Torres, Ovono, Hugues, &
Amaro, 2013), carne molida (Bosilevac, Guerini, Kalchayanand, & Koohmaraie, 2009),
queso de cabra (Van Cauteren et al., 2009), cerdo y pollo (Meneses, 2010). En nuestro
estudio, S. muenster correspondió al 10.64% (5/47), de los aislamientos, lo cual es similar
al estudio de Khallaf et al., (2014), quienes encontraron 13% (5/38) de S. muenster en
carne de pollo. Los serotipos reportados en nuestro estudio, difieren de aquellos
reportados por (Rodriguez et al., 2015), quienes reportan la presencia de S. enteritidis y
S. shannon en granjas de ponedoras en el departamento del Tolima, lo cual demuestra
la circulación de diversos serotipos asociados a la cadena avícola en esta región. Estos
estudios muestran una diversa distribución geográfica de serovariedades de salmonella
en productos y subproductos de origen avícola, así como en otros tipos de alimentos que
pueden estar asociados con diferentes fuentes de contaminación, resaltando la
importancia de la contaminación en la granja y la contaminación cruzada en plantas de
beneficio y expendios.
Algunos de los serotipos encontrados en nuestro estudio, han sido asociados a brotes
de enfermedad en humanos desde el año 2006 al 2014, según lo reportado por el CDC
(2014), en donde se encuentran los serotipos paratyphi, typhimurium, newport,
heidelberg, braenderup y schwarzengrund, por lo cual el hallazgo de estos serotipos en
nuestro estudio representa un riesgo para a la salud pública de la población de Ibagué.
Kim, (2010), reportó un brote por Salmonella othmarschen por consumo de alimentos
contaminados en Korea, en donde este serotipo fue aislado a partir de los pacientes
afectados, manipuladores de alimentos y alimentos que contenían huevo, calabaza y
mariscos. En el presente estudio, se identifican algunos serotipos que representan
37
riesgos potenciales para la salud pública, debido a su papel en brotes de enfermedad,
sin embargo los serotipos comúnmente aislados en aves de corral, no son los mismos
serotipos que generalmente producen enfermedad en humanos (Finstad et al., 2012).
La amplificación del gen invA mediante PCR convencional es una herramienta muy útil
para la identificación rápida del género Salmonella. Galan & Curtiss, 1991 desarrollaron
la técnica inicial y desde entonces, este procedimiento ha sido usado por diversas
investigaciones y ha permitido el desarrollo de nuevas técnicas moleculares aún más
versátiles (Li et al., 2012; O’Regan et al., 2008; Shanmugasamy, Velayutham, &
Rajeswar, 2011), en nuestro estudio, el gen de invasión invA, fue detectado en un número
de aislamientos seleccionados al azar, sugiriendo que la técnica es bastante confiable y
puede ser usada como una prueba de diagnóstico alternativo y en la vigilancia
epidemiológica de la infección, enfermedad o inocuidad de los productos avícolas. Esto
se encuentra apoyado por otros estudios, los cuales reportan la presencia de este gen
en casi todos los aislamientos (Cardona-castro et al., 2007; Ibrahim et al., 2014; Molina
et al., 2010; Tafida et al., 2013), por lo cual constituye una técnica rápida y de gran
utilidad, que puede acelerar la identificación del patógeno en diferentes muestras.
38
6. CONCLUSIONES

La prevalencia encontrada fue del 17,41%, correspondiente a 47 aislamientos de
las 270 muestras tomadas.

Se identifican 14 diferentes serotipos de Salmonella, de los cuales S. Paratyphi B
var. java fue el más prevalente.

La comercialización exclusiva de canales avícolas y la presencia de acero
inoxidable como superficie de contacto representa potenciales factores de riesgo.
39
RECOMENDACIONES
Los resultados de este proyecto sugieren la necesidad de dar continuidad a procesos
investigativos
donde se aborde la problemática sanitaria de las enfermedades
transmitidas por alimentos. Así, nace la necesidad de evaluar la calidad microbiológica e
inocuidad de todos y cada uno de los componentes de la cadena avícola como de otras
cadenas de producción de alimentos, instaurar sistemas de vigilancia epidemiológica
más rigurosos y versátiles y hacer control de calidad que promueva las buenas prácticas
de manufactura, por lo tanto, se recomienda a los futuros investigadores con interés en
el área, la implementación de nuevas técnicas moleculares y evaluación de técnicas para
la detección rápida y oportuna de los agentes patógenos, así como la identificación de
factores de riesgo que permitan plantear nuevas estrategias de contingencia y control
sanitario enfocadas a fortalecer la seguridad alimentaria.
Otra recomendación es el reporte del surgimiento de nuevos serotipos y brotes de
enfermedad ante las organizaciones de control, esto con el fin de evaluar nuevas rutas
de contaminación por parte de los diferentes patógenos o el surgimiento de fuentes de
contaminación adaptadas a los cambios que tiene el mercado de los alimentos.
El estatus microbiológico encontrado en el presente estudio para Salmonella, es motivo
de preocupación para las entidades sanitarias encargadas de la salud pública para la
población de Ibagué, se recomienda que estas entidades sean las encargadas de la
concientización y educación tanto del comercializador como del consumidor en cuanto a
la presencia del patógeno en el alimento y las diferentes medidas de prevención que este
puede tomar para cortar las vías de contaminación.
40
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