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Artículo de reflexión
doi: http://dx.doi.org/10.16925/cf.v3i1.1199
Evaluación de los métodos fenolcloroformo y columnas de sílice para
extracción de adn a partir de tejido óseo
Alveiro Antonio Alvis-Arango*, Bacter.1, Luz Eliana Giraldo-Vásquez, MsC.2
1
Instituto Nacional de Medicina Legal y Ciencias Forenses, Regional Noroccidente, Medellín, Antioquia, Colombia
Institución Universitaria Tecnológico de Antioquia, Facultad de Ciencias Forenses y de la Salud, Medellín,
2
Antioquia, Colombia
Recibido: 8 de julio del 2015 Aprobado: 28 de septiembre del 2015
*Autor de correspondencia: Alveiro Antonio Alvis-Arango. Instituto Nacional de Medicina Legal y Ciencias Forenses, Medellín,
Antioquia, Colombia. Calle 64B n.° 104-47, Torre 5, Int. 205. Teléfonos: 441 2262-454 8230. Correo electrónico: alanalvis@
medicinalegal.gov.co
Cómo citar este artículo: Alvis-Arango AA, Giraldo-Vásquez LE. Evaluación de los métodos fenol-cloroformo y columnas
de sílice para extracción de adn a partir de tejido óseo. Colomb. Forense 2015; 2(1):69-74. doi: http://dx.doi.org/10.16925/
cf.v3i1.1199
Resumen. Propósito: encontrar factores para seleccionar métodos de extracción de
material genético como el fenol-cloroformo y las columnas de sílice, a fin de utilizarlos en el análisis genético, en el marco de las políticas del Gobierno de Colombia
de la Ley de Justicia y Paz. Descripción: se hizo un estudio descriptivo aplicando los
dos principales métodos de extracción de adn óseo; se analizaron muestras problema que inicialmente no arrojaron resultados reproducibles y verificables. Punto
de vista: según los resultados obtenidos, se halló que el tiempo de digestión para las
muestras óseas sometidas a extracción de adn por el método de columnas de sílice
mejora cuando se hace a las dos horas. Conclusiones: el adn extraído por el método
de columnas de sílice es mejor en la recuperación, pero debe ser analizado lo más
pronto posible; de lo contrario, el material se degrada si se conserva refrigerado.
Este fenómeno no ocurre en extracciones con fenol-cloroformo.
Palabras clave: adn, genética forense, identificación de métodos, tejido óseo.
BY
NC
ND
p-ISSN 2145-0684 | e-ISSN 2145-9649
Artículo de reflexión
doi: http://dx.doi.org/10.16925/cf.v3i1.1199
Evaluation of phenol-chloroform and silica columns
methods for dna extraction from bone tissue
Abstract. Purpose: To find factors for selecting genetic material extraction methods such
as phenol-chloroform and silica columns in order to use them in genetic analysis, in the
framework of the policies of the Justice and Peace Act issued by the Government of Colombia. Description: A descriptive study was conducted using two main methods for dna
extraction from bone tissue; test samples that initially did not yield reproducible and verifiable results were analyzed. Point of view: According to the results, it was found that the
digestion time for bone samples subjected to dna extraction by the silica columns method
improves when performed within two hours. Conclusions: dna extracted by the silica columns method is better for recovery, but must be analyzed as soon as possible; otherwise,
the material deteriorates when stored refrigerated. This phenomenon does not occur in
extractions with phenol-chloroform.
Keywords: dna, forensic genetics, method identification, bone tissue.
Avaliação dos métodos fenol- clorofórmio e colunas de
sílica para extração de dna a partir de tecido ósseo
Resumo. Propósito: encontrar fatores para selecionar métodos de extração de material genético como o fenol-clorofórmio e as colunas de sílica a fim de utilizá-los na análise genética, no âmbito das políticas do Governo da Colômbia da Lei de Justiça e Paz. Descrição: fezse um estudo descritivo que aplicou os dois principais métodos de extração de dna ósseo;
analisaram-se amostras-problema que inicialmente não deram resultados reproduzíveis e
verificáveis. Ponto de vista: segundo os resultados obtidos, constatou-se que o tempo de
digestão para as amostras ósseas submetidas à extração de dna pelo método de colunas
de sílica melhora quando se faz às duas horas. Conclusões: o dna extraído pelo método de
colunas de sílica é melhor na recuperação, mas deve ser analisado o mais breve possível; do
contrário, o material se degrada se for conservado refrigerado. Esse fenômeno não ocorre
em extrações com fenol-clorofórmio.
Palavras-chave: dna, genética forense, identificação de métodos, tecido ósseo.
BY
NC
ND
Evaluación de los métodos fenol-cloroformo y columnas de sílice para extracción de adn a partir de tejido óseo
Introducción
El conflicto armado en Colombia ha tenido como
consecuencia la desaparición de muchísimas personas. La Fiscalía General de la Nación reportó 10 084
casos de cadáveres en condición de no identificados
en cementerios municipales, según un censo nacional informado por una cuarta parte de las seccionales del país [1].
La identificación de un cadáver en condición
de no identificado (cni) se convierte en una misión
humanitaria y social [2, 3]; es así como se considera importante saber dónde se encuentran los restos, recibir la confirmación de la muerte y hacer el
duelo en las condiciones que se crean necesarias,
atendiendo a los principios de dignidad y de respeto por las creencias culturales y religiosas.
Desde el punto de vista jurídico, el fallecimiento de una persona tiene implicaciones legales, especialmente en Colombia donde es un hecho
el proceso de reparación a las víctimas como una
estrategia del Estado para compensar a las familias
y a las comunidades.
Los procesos de identificación de una persona
en condición de no identificado tienen varios grados
de complejidad. Cuando se trata de cadáveres bien
conservados o frescos, se cuenta con herramientas
que permiten hacer identificaciones con óptimos
criterios de oportunidad. Estos recursos van desde
la información fisonómica (peso, talla, edad, características físicas, cicatrices, tatuajes), pasando por
la documentación personal encontrada en el cadáver, hasta la identificación necrodactilar, principal
método empleado en identificaciones fehacientes
[4, 5, 6].
Los fenómenos que se presentan cuando un
organismo fallece generan procesos de degradación
y destrucción de todas sus biomoléculas (incluido el
adn), los cuales serán iniciados por las propias enzimas del organismo (autolisis), luego por la invasión
de bacterias, hongos, insectos o animales de rapiña,
y finalmente, por procesos químicos, principalmente hidrólisis (fragmentación del adn) y oxidación (modificación del adn), que completarán la
degradación del material genético [7].
En cuerpos en avanzado estado de descomposición o esqueletados, se debe recurrir al análisis
del perfil genético del cadáver y a su comparación
con los perfiles de presuntos familiares. Esto hace
necesario disponer de métodos científicos, viables
y rápidos, que apoyen el proceso de identificación.
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Sin embargo, la obtención de perfiles genéticos a
partir de estructuras óseas está limitado por el tipo
de muestra, las condiciones del enterramiento y las
características del medio ambiente en el que están
depositadas [8], aspectos que pueden lentificar o
acelerar la degradación (temperatura, humedad,
pH o la presencia de ciertos compuestos en el suelo
que interfieren con la reacción en cadena de la polimerasa) [9].
Debido a la variabilidad en la preservación de
las muestras ingresadas a los laboratorios de genética forense, suele optarse por diversas estrategias
para la extracción del material genético, como el
fenol-cloroformo y la extracción con columnas de
sílice.
El interés del presente trabajo es revisar los
pasos en la extracción que puedan afectar los resultados y optimizar la calidad del adn recuperado de
las muestras a partir del uso de fenol-cloroformo y
columnas de sílice, actualmente utilizados de rutina.
Así mismo, se pretende hacer ajustes que aumenten
los estándares de calidad y maximización de recursos que se traduzcan en disminución de tiempos de
respuesta de los informes periciales para este tipo
de casos.
Materiales y métodos
Tipo de estudio: descriptivo
Selección de muestras: se tomaron 34 muestras a conveniencia de restos óseos que previamente
habían sido analizados y habían sido limpiados de
tejidos e impurezas. Se aplicó el método de extracción de fenol-cloroformo a 8 muestras ya procesadas por el método de columnas de sílice, con
resultados óptimos para adn. Para el método de
columnas de sílice, se utilizaron 12 muestras con
resultado positivo de adn y 14 muestras con resultado inicial negativo de adn. Todas estas muestras
permanecieron bajo reserva por un año.
Cantidad de la muestra para extracción: se
utilizaron cantidades de 1 y 2 g de pulverizado de
hueso para ambas extracciones.
Extracción orgánica de adn a partir de tejido
óseo (método de fenol-cloroformo): la digestión es
un proceso común en los métodos de extracción de
adn que serán analizados: consiste en decalcificar
la muestra utilizando un agente quelante (edta),
puesto que las sales minerales pueden interferir en
procesos posteriores. Para este proceso, se utiliza
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Artículo de reflexión
proteinasa k (enzima proteolítica que lisa las proteínas de la membrana celular), con lo que se libera
el adn al medio acuoso [10, 11, 12].
A las muestras pulverizadas se les hicieron
tres lavados con edta 0,5 m; se cubre el pulverizado, se agita manualmente y luego se lleva a centrífuga refrigerada (4 °C) por cinco minutos a 3000
rpm. Luego de cada lavado, se descartó el sobrenadante. Al pellet final se le adicionaron 8 mL de edta
0,5 m; 500 μl de proteinasa k y 80 μl de Tween 20.
Se incubaron las muestras a 56 °C con agitación, y
se hicieron revisiones de la digestión a las dos y a
las doce horas.
Después de la digestión [10, 13, 14], el adn se
purificó con solventes orgánicos para que los ácidos
nucleicos insolubles en fenol y solubles en cloroformo se separaran en dos fases: la superior acuosa,
donde están presentes los ácidos nucleicos, y la fase
del fondo con fenol y cloroformo y las demás moléculas, como proteínas y grasas, que inhiben la
amplificación de los ácidos nucleicos [15]. Luego
de este proceso, el adn extraído se concentró en
columnas de purificación [9].
Extracción de adn a partir de hueso utilizando columnas de sílice: para la decalcificación y
digestión del pulverizado de hueso, se adicionaron
15 mL de buffer de desmineralización (edta 0,5 m/
n-laurilsarcosinato de sodio 1%) y 1 mL de proteinasa k; se homogenizó e incubó a 56 °C en horno de
agitación (evaluando la digestión de las muestras a
las dos y a las doce horas).
El método se fundamenta en la utilización de
columnas de sílice. El adn se asocia con el hidrocloruro de guanidina presente en el buffer de unión
(pb), lo que facilitó la unión altamente específica
entre las partículas de sílice presentes en la membrana de la columna y el material genético, mientras que los contaminantes pasan por medio de esta.
Para la ultrafiltración, la purificación, el lavado y
la elución, se siguieron los procedimientos sugeridos en los kits comerciales [9] y los procedimientos
estandarizados de trabajo [16]. Se ajustó el pH de la
solución reguladora pb como lo indica el fabricante.
La recuperación de adn se hizo con buffer de elución (eb) como lo indica el procedimiento, y adicional a esto se modificó utilizando agua Milli-q como
lo indican los protocolos internacionales.
Colombia Forence / Volumen 2, Número 1 / enero-diciembre 2015
Amplificación, cuantificación
y secuenciación
Amplificación vía pcr (Reacción en Cadena
de la Polimerasa): el procedimiento de pcr [17,
18] permitió la amplificación in vitro de regiones
específicas de adn por medio de pcr, que consta
de tres etapas fundamentales: denaturación del
adn, anillaje de los Fluoroprimers y la extensión
por medio de la Taq (Thermus aquaticus) adn polimerasa. Cada etapa se llevó a cabo a temperaturas
específicas establecidas en los programas de termociclaje. La amplificación simultánea de los loci str
fue posible mediante el uso de primers específicos
para estos sistemas con pcr múltiplex, empleando
Identifiler®, Yfiler® y Power Plex hs® y esx® [19, 20].
Cuantificación: se llevó a cabo mediante la
reacción en cadena de polimerasa [pcr], en tiempo
real, empleando el kit Plexor®, que es específico de
adn humano [21].
Secuenciación: se llevó a cabo utilizando el
analizador genético Genetic Analyzer abi 3130
[22]. El análisis de los electroferogramas se hizo por
medio del software GeneMapper, siguiendo las instrucciones de la guía de operación para el analizador [22].
Verificación de la calidad e integridad del
adn en el tiempo: se hizo cuantificación de adn
mediante el Kit Plexor® al momento de la extracción
a cada uno de los extractos obtenidos en los ensayos
anteriores. Para esto, se almacenaron las submuestras a -20 oC y a 4 oC por un periodo de 8, 15 y 30
días, y posteriormente fueron cuantificadas.
Resultados y discusión
La extracción en las muestras óseas sigue siendo un
proceso trascendental en la obtención de material
genético de buena calidad. El alto porcentaje de fracasos se debe a inhibidores que podrían eliminarse
en este paso; si bien se pueden hacer intentos intermedios en otras fases del proceso, no deja de ser una
gran preocupación de los Laboratorios de Genética
que se desempeñan con este tipo de muestras.
En el caso de las muestras analizadas, la cantidad de adn recuperado en las que tenían buenas
Evaluación de los métodos fenol-cloroformo y columnas de sílice para extracción de adn a partir de tejido óseo
condiciones de conservación y preservación no
implicó pérdida sustancial de material genético, y
su recuperación se logró con un gramo de muestra
ósea pulverizada para los dos métodos de extracción evaluados.
La cantidad de muestra influyó en los resultados y en la obtención de adn. Todas aquellas que no
arrojaron resultados iniciales con un gramo de pulverizado de resto óseo y que se reprocesaron nuevamente con dos gramos mostraron resultados de
adn en el 90% de los casos.
La digestión mostró mejores resultados acortando el tiempo. En el método de extracción por
columnas de sílice, se pudo evidenciar que la muestra pierde cantidad y calidad de material genético después de las dos horas de digestión, lo cual
impide obtener un perfil genético, o que presenta
picos inespecíficos que dificultan la interpretación
debido a la deficiencia en la calidad del adn. Esto
puede asociarse a rupturas por acción del calor prolongado y a la exposición a agentes quelantes.
Ajustar el pH en el proceso de adición del
buffer pe por el método de extracción con columnas
de sílice evidencia un cambio en las muestras con
el indicador de pH, sin adición del acetato de sodio
necesario para ajustar el pH. Esto permite concluir
que lo más adecuado es utilizar buffer preparado
recientemente o garantizar que el pH sea adecuado,
aspecto que está contemplado en las instrucciones
del fabricante.
Se pudo evaluar la trazabilidad de una muestra guardada en condiciones de refrigeración, y
se encontró que a los 15 días la pérdida del adn
autosómico fue de un 99% y la del cromosoma y
fue de un 90%; al día 30 no se logra detectar por
la cuantificación adn suficiente para análisis.
Revisando los procedimientos, se confirmó que el
extracto de adn se debe guardar en congelacion a
-20 ºC [9] (figura 1).
Es importante considerar los problemas de
degradación posterior a la extracción, situación
que no contribuye a la obtención de resultados
completos y reproducibles, lo cual causa un incremento en los reprocesos y aumenta el tiempo de
respuesta de los casos dentro de los laboratorios.
La recuperación final del adn utilizando buffer eb arroja buenos resultados, aunque el adn
obtenido se pierde en el proceso de conservación
y puede hacer perder su estabilidad. Se hizo un
ensayo utilizando agua Milli-q y se obtuvieron
mejores efectos. Someter a más agentes al proceso
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de la muestra dentro de la extracción y complementado con el tiempo de almacenamiento puede afectar. Optimizar un poco empleando agentes más
neutros como el agua, se puede llegar a traducir en
análisis positivos a futuro.
5,52
Autosomico
0,801
0,546
0,0814
Dia 1
Cromosoma Y
Dia 15
0,0292
0,0853
Dia 30
Figura. Cuantificación de adn autosómico y cromosoma “y”
días 1, 15 y 30
Fuente: elaboración propia
Aunque el número de muestras no fue representativo durante el presente estudio por los costos
que se generan dado el tipo de análisis, los resultados muestran una tendencia que se puede considerar para futuras investigaciones que permitirán
llegar a mayores conclusiones frente a los procesos
de extracción.
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