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II Workshop GHEPMIX:
Interpretación de mezclas de
perfiles STR autosómicos
XVIII JORNADAS
GENÉTICA
FORENSE
GHEP-ISFG
Sevilla 19-20/09/2013
Sevilla 18, 19, 20 de septiembre de 2013
Recomendaciones y guías internacionales sobre
el análisis e interpretación de perfiles mezcla
María José Farfán Espuny
mariajose.farfan@justicia.es
Instituto Nacional de Toxicología y Ciencias Forenses
Departamento de Madrid. Servicio de Biología
Análisis de STR autosómicos
Perfil único
Perfil mezcla
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Pero no siempre todo es tan bonito…
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… y a veces cuesta decidir si un pico es
realmente un alelo.
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Para ello hay que tener en cuenta algunos parámetros:
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“If you show 10 colleagues a mixture, you will
probably end up with 10 different answers”
Peter Gill, Human Identification E-Symposium, 14/04/2005
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Interpretación de mezclas
6-7-8
6-7-8
15-16-17-19
Stutter
7-8
15-16-17-19
Pull-up
Stutter
Pull-up
15-16-19
7-8
15-16-19
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Estandarización en Genética Forense
Nombre y logo
Organización
Web
DAB
DNA Advisory Board
SWGDAM
Scientific Working Group
on DNA Analysis Methods
http://www.swgdam.org/
European Network of
Forensic Science Institutes
http://www.enfsi.org/
European DNA Profiling
group
http://www.isfg.org/EDNAP
International Society for
Forensic Genetics
http://www.isfg.org/
ENFSI
EDNAP
ISFG
GHEP-ISFG
Grupo de Habla Española y
Portuguesa de la ISFG
http://www.gep-isfg.org/
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2008
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Recomendaciones y guías internacionales sobre
el análisis e interpretación de perfiles mezcla
Recomendaciones referentes a:
- Garantía de calidad y acreditación
- Formación de los analistas en Genética Forense
- Validación de métodos
- Análisis e interpretación de perfiles mezcla
- Valoración estadística
- Registro en la base de datos de ADN
- Prevención de la contaminación
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Recomendaciones y guías internacionales sobre
el análisis e interpretación de perfiles mezcla
Recomendaciones referentes a:
- Garantía de calidad y acreditación
- Formación de los analistas en Genética Forense
- Validación de métodos
- Análisis e interpretación de perfiles mezcla
- Valoración estadística
- Registro en la base de datos de ADN
- Prevención de la contaminación
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Acreditación de laboratorios forenses
ISO/IEC 17025: “Requisitos generales para la
competencia de los laboratorios de ensayo y calibración”
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Decisión Marco 2009/905/JAI del Consejo de Europa
(…) los Estados miembros tomarán las medidas necesarias para
garantizar la integridad de los perfiles de ADN que se envíen o se
pongan a disposición de los demás Estados miembros a efectos de
comparación y velarán por que dichas medidas se atengan a
normas internacionales, tales como la norma EN ISO/IEC 17025
(…)
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Decisión Marco 2009/905/JAI del Consejo de Europa
La acreditación la concede el organismo nacional de
acreditación que goza de la exclusiva competencia de
evaluar si un laboratorio reúne los requisitos
establecidos por las normas armonizadas.
CGCRE
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Decisión Marco 2009/905/JAI del Consejo de Europa
Los Estados miembros tomarán las medidas necesarias
para dar cumplimiento a lo dispuesto en la presente
Decisión marco en relación con los perfiles de ADN a
más tardar el 30 de noviembre de 2013.
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Participación en ensayos de aptitud
Que incluyan mezclas entre las muestras objeto de análisis:
Ejercicio de Intercomparación 'Estudio
de polimorfismos de ADN en manchas
de sangre y otras muestras biológicas'
The GEDNAP (German DNA profiling
group) proficiency testing system
Control de calidad de la Sociedad
Argentina de Genética Forense
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https://www.administraciondejusticia.gob.es/paj/PA_WebApp_SGNTJ_NPAJ/descarga
/Acuerdo_sobre_acreditacion_y_control_de_calidad_de_los_laboratorios.pdf?idFile=a
43610c9-a8ff-422a-bef2-1b95adefe7c6
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http://www.cstl.nist.gov/strbase/interlab/MIX13.htm
We plan to conclude collecting data by December 31, 2013.
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Recomendaciones y guías internacionales sobre
el análisis e interpretación de perfiles mezcla
Recomendaciones referentes a:
- Garantía de calidad y acreditación
- Formación de los analistas en Genética Forense
- Validación de métodos
- Análisis e interpretación de perfiles mezcla
- Valoración estadística
- Registro en la base de datos de ADN
- Prevención de la contaminación
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All staff within the DNA units must be trained according to a specific training programme.
6. SPECIFIC METHODS
6.6. Reporting results
Besides the general items described in chapter 5 the trainee must be able to demonstrate
that he/she :
[…]
− Interpret all of the results (including DNA-mixtures, LCN, Y-STR, mitochondrial DNA,
etc.).
http://www.enfsi.eu/sites/default/files/documents/recommendations_for_the_training_of_dna_staff_-_v2010_0.pdf
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DNA Advisory Board/SWGDAM/FBI
QUALITY ASSURANCE STANDARDS FOR FORENSIC DNA TESTING
LABORATORIES
EFFECTIVE DATE:
These standards shall take effect September 1, 2011.
REFERENCES: Federal Bureau of Investigation, “Quality Assurance Standards for Forensic DNA
Testing Laboratories” and “Quality Assurance Standards for Convicted Offender DNA Databasing
Laboratories,” Forensic Science Communications, July 2000, Volume 2, Number 3.
5. PERSONNEL
STANDARD 5.3 The casework CODIS administrator shall be an employee
of the laboratory and meet the following qualifications:
5.3.2 Minimum experience requirements: A casework CODIS
administrator shall be or have been a current or previously qualified DNA
analyst as defined in Standard 5.4 with documented mixture
interpretation training.
http://swgdam.org/FBI%20Director%20Forensic%20Standards%20%20Revisions%20APPROVE
D%20and%20Final%20effective%209-01-2011.pdf
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Approval on January 17, 2013
6.2 Tasks
6.2.1 The analyst shall receive instruction and training, and demonstrate
competence in both analysis and interpretation for the following areas, as
applicable, as they relate to the laboratory's analytical procedures:
6.2.1.1 Autosomal STR analysis for single-source and mixed DNA profiles.
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http://www.euroforgen.eu/
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http://www.cstl.nist.gov/strbase/mixture.htm
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Recomendaciones y guías internacionales sobre
el análisis e interpretación de perfiles mezcla
Recomendaciones referentes a:
- Garantía de calidad y acreditación
- Formación de los analistas en Genética Forense
- Validación de métodos
- Análisis e interpretación de perfiles mezcla
- Valoración estadística
- Registro en la base de datos de ADN
- Prevención de la contaminación
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VALIDACIÓN
 Identifica aspectos de un procedimiento que son críticos
y deben ser cuidadosamente monitorizados y controlados.
ISO/IEC 17025: “Requisitos generales para la
competencia de los laboratorios de ensayo y calibración”
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http://swgdam.org/Interpretation_Guidelines_January_2010.pdf
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Establecer umbrales de referencia:
Umbral
Significado
Por debajo de este valor, los picos observados no
pueden distinguirse claramente del ruido de fondo
(línea base).
Analítico
(ej. 50 RFU)
Por encima de este valor, es razonable asumir que no
hay pérdidas alélicas en los heterocigotos.
Estocástico
(ej. 250 RFU)
Por debajo de este valor, un pico en posición stutter
puede asignarse como tal artefacto.
Porcentaje stutter
(ej. 10%)
Por encima de este valor, dos alelos pueden agruparse
como un posible genotipo heterocigoto.
Proporción alturas
(ej. 60%)
Límite de linealidad
(ej. 5000 RFU)
Proporción
componentes
Off-scale
Por encima de este valor, la cámara CCD puede
saturarse y los picos pueden no reflejar fielmente las
intensidades relativas y generar artefactos pull-up.
En mezclas, para una proporción entre componentes
más equilibrada que este valor, resulta muy difícil
asignar correctamente las combinaciones genotípicas.
(ej. 4:1)
Modificado de John Butler, 201133
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QUALITY ASSURANCE STANDARDS FOR FORENSIC DNA TESTING
LABORATORIES
8. VALIDATION
8.2.1 Developmental validation studies shall include, where applicable,
characterization of the genetic marker, species specificity, sensitivity studies,
stability studies, reproducibility, case-type samples, population studies,
mixture studies, precision and accuracy studies, and PCR-based studies.
8.3.1 Internal validation studies conducted after the date of this revision shall
include as applicable: known and non-probative evidence samples or mock
evidence samples, reproducibility and precision, sensitivity and stochastic
studies, mixture studies, and contamination assessment. Internal validation
studies shall be documented and summarized. The technical leader shall
approve the internal validation studies.
8.3.2 Internal validation shall define quality assurance parameters and
interpretation guidelines, including as applicable, guidelines for mixture
interpretation.
http://swgdam.org/FBI%20Director%20Forensic%20Standards%20%20Revisions%20APPROVE
D%20and%20Final%20effective%209-01-2011.pdf
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Approval on November, 2012
3. Developmental Validation
3.8 Mixture studies: The ability to obtain reliable results from mixedsource samples should be determined.
4. Internal Validation
4.4 Mixture studies: Mixed DNA samples that are representative of those
typically encountered by the testing laboratory should be evaluated.
These studies will assist the laboratory to establish guidelines for
mixture interpretation […]
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Minimum parameters to be validated :
New Multiplex Kit
- Mixture analysis (not necessary if only reference samples are processed
with this kit): a series of different laboratory defined mixture ratios should
be tested in three replicates.
Electrophoresis Equipment
- Mixture analysis: a series of lab defined mixture ratios should be tested
in three replicates.
http://www.enfsi.eu/sites/default/files/documents/minimum_validation_guidelines_in_dna_profiling__v2010_0.pdf
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Recomendaciones y guías internacionales sobre
el análisis e interpretación de perfiles mezcla
Recomendaciones referentes a:
- Garantía de calidad y acreditación
- Formación de los analistas en Genética Forense
- Validación de métodos
- Análisis e interpretación de perfiles mezcla
- Valoración estadística
- Registro en la base de datos de ADN
- Prevención de la contaminación
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...the laboratory should utilize written procedures for
interpretation of analytical results with the
understanding that specificity in the standard
operating protocols will enable greater consistency
and accuracy among analysts within a laboratory.
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QUALITY ASSURANCE STANDARDS FOR FORENSIC DNA TESTING
LABORATORIES
9. ANALYTICAL PROCEDURES
STANDARD 9.6 The laboratory shall have and follow written guidelines for
the interpretation of data.
9.6.4 Laboratories analyzing forensic samples shall have and follow a
documented procedure for mixture interpretation that addresses major
and minor contributors, inclusions and exclusions, and policies for the
reporting of results and statistics.
http://swgdam.org/FBI%20Director%20Forensic%20Standards%20%20Revisions%20APPROVE
D%20and%20Final%20effective%209-01-2011.pdf
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Pasos en la interpretación de mezclas
Paso 1: Identificar la presencia de una mezcla
• Presencia de >2 alelos en más de un locus
• Desequilibrio en las alturas de picos:
- PHR <60%
- Stutter >15%
Paso 2: Asignación de alelos en la mezcla
Paso 3: Identificar el número potencial de contribuyentes
Paso 4: Estimar la proporción en la que participan los distintos
contribuyentes
Paso 5: Considerar todas las combinaciones de genotipos posibles
Paso 6: Comparar con las muestras de referencia
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Factores que afectan a la asignación alélica
e interpretación de perfiles STR
 Artefactos:
n-A
stutter
pull-up
dye blob
spike
Patrón trialélico
Mutaciones
Problemas con amelogenina
Otros factores:
Degradación ADN
Drop-out
Modificación ADN
Drop-in
Inhibición
Alelo fuera de patrón
Contaminación
y microvariantes
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Recomendaciones y guías internacionales sobre
el análisis e interpretación de perfiles mezcla
Recomendaciones referentes a:
- Garantía de calidad y acreditación
- Formación de los analistas en Genética Forense
- Validación de métodos
- Análisis e interpretación de perfiles mezcla
- Valoración estadística
- Registro en la base de datos de ADN
- Prevención de la contaminación
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4.1. The laboratory must perform statistical analysis in
support of any inclusion that is determined to be
relevant in the context of a case, irrespective of the
number of alleles detected and the quantitative value of
the statistical analysis.
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QUALITY ASSURANCE STANDARDS FOR FORENSIC DNA TESTING
LABORATORIES
8. VALIDATION
STANDARD 8.7 Modifications to software, such as an upgrade, shall
require a performance check prior to implementation. New software or
significant software changes that may impact interpretation or the
analytical process shall require a validation prior to implementation.
http://swgdam.org/FBI%20Director%20Forensic%20Standards%20%20Revisions%20APPROVE
D%20and%20Final%20effective%209-01-2011.pdf
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7. Software
7.1 New software or significant software changes that may impact
interpretation, the analytical process, or sizing algorithms shall require a
validation prior to implementation. Depending on the function and
application of the software, the laboratory should determine the
appropriate validation studies to identify its reliability and limitations.
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New Software
Software eg. interpretation software sold by a company (or commercially
available), should undergo a concordance study with the previously used
method. Validation data of the software should be available from the
manufacturer.
Every change in the system should be validated by a manual/visual
inspection of the tested functionality and must be documented.
Home made software (like macros or calculation sheets) should be
validated.
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- Garantía de calidad y acreditación
- Formación de los analistas en Genética Forense
- Validación de métodos
- Análisis e interpretación de perfiles mezcla
- Valoración estadística
- Registro en la base de datos de ADN
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3.9 Mixed profiles
Mixed profiles can occur when two or more
persons have left cell-material on the same
object (e.g. smoking from the same cigarette or
drinking from the same bottle) or when e.g. cells
of a perpetrator are mixed with cells of a victim
(which often occurs in rape cases). If possible,
mixed DNA-profiles should be interpreted and
designated into their contributing DNA-profiles.
[…]
ENFSI-recommendation 12
The guidelines in the document of the
ISFG-working group on the analysis of
mixed profiles should be used for the
analysis of mixed profiles.
http://www.enfsi.eu/sites/default/files/documents/enfsi_d
ocument_on_dna-database_management_2012_0.pdf
ENFSI-recommendation 14
Mixed profiles of more than 2 persons
should not systematically be included
in a DNA-database because they
generally will produce too many
adventitious matches.
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Recomendación sobre registro de mezclas
con notación con alelo requerido:
Se recomienda la notación de alelos requeridos (+)
para prevenir que se informen falsas coincidencias
que tengan:
- Un alelo no relacionado
- Un alelo requerido ausente
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Recomendaciones referentes a:
- Garantía de calidad y acreditación
- Formación de los analistas en Genética Forense
- Validación de métodos
- Análisis e interpretación de perfiles mezcla
- Valoración estadística
- Registro en la base de datos de ADN
- Prevención de la contaminación
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QUALITY ASSURANCE STANDARDS FOR FORENSIC DNA TESTING
LABORATORIES
6. FACILITIES
STANDARD 6.1 The laboratory shall have a facility that is designed to
ensure the integrity of the analyses and the evidence.
6.1.5 The laboratory shall have and follow written procedures for
cleaning and decontaminating facilities and equipment.
9. ANALYTICAL PROCEDURES
STANDARD 9.7 The laboratory shall have and follow a documented
policy for the detection and control of contamination.
http://swgdam.org/FBI%20Director%20Forensic%20Standards%20%20Revisions%20APPROVE
D%20and%20Final%20effective%209-01-2011.pdf
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Laboratory automation
- Cross contamination tests (i.e. droplet formation or spilling during
liquid transfer).
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http://www.enfsi.eu/sites/default/files/documents/dna_contamination_prevention
_guidelines_for_the_file_contamantion_prevention_final_-_v2010_0.pdf
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Comisión Nacional para el uso forense del ADN
(CNUFADN)
Se constituyó el
27/03/2009
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INTCF
Sevilla
Muchas gracias a todos,
y en especial a mis
compañeros, por contribuir
a que esta profesión me
resulte apasionante y
hasta divertida.
INTCF
Madrid
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