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LOS PRIMEROS PROYECTOS GENOMICOS EN MEXICO PARA LA IDENTIFICACION DE GENES
DE IMPORTANCIA AGRONOMICA.
Víctor González
Desde la antigüedad el hombre ha aprendido a usar la diversidad biológica en su propio beneficio. La práctica
milenaria de la agricultura ha seleccionado muchas especies de plantas y las características más útiles de estas,
como el tamaño, el rendimiento, la resistencia a enfermedades, el sabor y el color. Hoy, en los inicios del Siglo
XXI, podemos continuar seleccionando características útiles, pero a una escala inimaginable hace unos años.
Mediante la Genómica, podemos
evaluar el contenido genético de las plantas de interés agronómico
minuciosamente. Esto quiere decir que con la Genómica podrán caracterizarse genes y rutas metabólicas en estas
plantas, que permitirán por ejemplo, reducir o eliminar el uso de pesticidas y herbicidas, prevenir la infección de
hongos, virus y bacterias e incrementar la productividad y la calidad de las cosechas (Tabla 1).También se espera
con ello, encontrar los genotipos o ecotipos de plantas, más adecuados a las diferentes regiones del país o del
mundo, y aprovecharlos íntegramente. Así mismo, mediante el conocimiento de la secuencia genómica de los
microorganismos asociados a los cultivos, se podrían beneficiar los rendimientos agrícolas o bien eliminar los
riesgos que estos representan. Sin embargo, para que esto no parezca solo una promesa, describiré a continuación
los primeros pasos de la Genómica en nuestro país, a través de algunos proyectos de interés agronómico.
Un Modelo de Genómica: La Simbiosis Rhizobium-Leguminosa. Las leguminosas son la familia más grande de
plantas, con más de 18 000 especies, muchas de ellas de gran importancia agronómica como el frijol, el chícharo, el
cacahuate, la soya y la alfalfa. En las raíces de estas plantas se desarrollan nódulos, en cuyo interior hay bacterias
fijadoras de nitrógeno del género Rhizobium. El nitrógeno es un constituyente de las proteínas y por lo tanto un
elemento esencial para todos los organismos. Sin embargo, solamente es accesible a través de las plantas, quienes lo
toman del suelo en forma de diversos compuestos nitrogenados, como el amonio. La conversión del nitrógeno
atmosférico en amonio, llamada fijación de nitrógeno, la realizan muchos microorganismos, entre
ellos los
simbiontes de las leguminosas. La simbiosis es resultado de un intercambio de señales moleculares entre el
Rhizobium, ordinariamente un habitante del suelo, y las raíces de la planta. Una molécula del exudado de las raíces
enciende un conjunto de genes de Rhizobium, con lo que se produce un factor esencial que dispara la formación de
los nódulos. Al lograr la madurez (22-28 días en el frijol), lo nódulos tienen embebidas a las bacterias, las cuales
convierten el nitrógeno atmosférico en amonio. Esta clase de simbiosis contribuye enormemente al ciclo del
nitrógeno y probablemente sea un factor determinante del éxito evolutivo de las leguminosas. Para entender
detalladamente las bases moleculares de esta interacción, diversas instituciones públicas y privadas llevan a cabo
proyectos de secuenciación genómica de bacterias simbióticas fijadoras de nitrógeno y de algunas leguminosas
(Tablas 1 y 2). Sin duda, este conocimiento arrojará nuevos datos sobre la simbiosis y podría contribuir a sustituir el
uso de los fertilizantes nitrogenados por materiales biológicos, eliminando de paso la contaminación de los suelos y
mantos acuíferos, un problema en los campos de agricultura intensiva. Por otro lado, identificar los genes de la
planta que controlan la formación del nódulo y aquellos de la bacteria necesarios para la invasión de la raíz,
permitiría la optimización de la fijación de nitrógeno en leguminosas, y tal vez utilizar estos genes en otras plantas
como el maíz y el trigo.
Dada la complejidad de los genomas de plantas por su tamaño y organización genómica, los proyectos de
secuenciación de estas se han enfocado a encontrar genes de interés funcional (ver abajo). Por otro lado, los
genomas bacterianos son más manejables experimentalmente y pueden secuenciarse completamente en un tiempo
razonable (Recuadro). Por esta razón representan un buen modelo de inicio de estudios genómicos.
El Genoma de Rhizobium etli. El frijol (Phaseolus) es nodulado por distintas especies de Rhizobium, entre las que
se encuentra R. etli. Esta bacteria tiene un genoma compuesto de un cromosoma circular de más de 4 millones de
pares de bases (4 Mb), y plásmidos de gran tamaño (> 0.2 Mb-0.7 Mb). En Rhizobium, la mayor parte de los genes
necesarios para nodular y fijar nitrógeno se encuentran en grandes plásmidos, aunque también pueden estar
localizados en los cromosomas en las especies cercanas como Bradyrhizobium y Mesorhizobium (Tabla 2). En el
Centro de Investigación Sobre Fijación de Nitrógeno (CIFN) de la UNAM en Cuernavaca, Morelos, se ha
establecido el primer grupo Mexicano en producir secuencia nucleotídica a gran escala. Uno de los objetivos del
Programa de Evolución Molecular del CIFN, es obtener la secuencia y la anotación de todo el genoma de R.etli en
los próximos 3 años, siguiendo una estrategia similar a la descrita en el recuadro. Por lo pronto, este grupo ha
completado la secuencia correspondiente al plásmido simbiótico de R. etli CFN42 (pSim CFN42), quizá la de mayor
interés inmediato. Esta es una molécula de 372 257 pares de bases, con 356 genes, de las cuales 48 están claramente
involucrados en la simbiosis. Entre estos, se cuentan los genes para la síntesis del factor de nodulación, y los genes
para la síntesis de las enzimas encargadas de la fijación de nitrógeno. Los primeros análisis del contenido genómico
de este plásmido muestran una estructura en mosaico, es decir, está formado por segmentos genéticos
probablemente de diferente historia evolutiva. El pSim CFN42 no tiene genes comprometidos con el metabolismo ni
con la división celular, por lo cual no es indispensable para la sobrevivencia de la bacteria. Sin embargo, tiene
genes para varios citocromos, quimiotaxis y un conjunto de genes de virulencia (vir), lejanamente emparentados con
los de bacterias patogénicas de plantas y animales como Agrobacterium y Brucella. Por otro lado, tiene muchas
secuencias de inserción, transposones y pseudogenes, distribuidos en toda la estructura, además de genes hipotéticos
cuyo papel en la célula se desconoce. Con estos elementos en las manos, es posible hacer diseños experimentales,
que nos permitan indagar que otros genes de este plásmido tienen influencia en la simbiosis, ya sea alterándolos con
mutaciones dirigidas o examinando la actividad de los genes bajo distintas condiciones.
Proyectos Genómicos en Plantas. A finales del año pasado, fue publicada la secuencia completa de una planta
insignificante en la agronomía, pero de gran trascendencia como modelo científico. Esta es la planta dicotiledónea
Arabidopsis thaliana, cuyo genoma tiene 5 cromosomas que en su conjunto reúnen 125 millones de pares de bases
(125 Mb), organizados en 26 000 genes. Es por lo tanto un genoma relativamente pequeño comparado con los de
las plantas cultivables y sin la redundancia genómica de estos, que tienen varias copias de un mismo cromosoma.
¿Porqué tanto entusiasmo por el genoma de esta planta?. En contraste con los animales, las plantas son autotróficas,
es decir, a partir de oxígeno, luz solar, agua y minerales del suelo pueden sintetizar todos los productos que
necesitan para vivir. Entre estos productos se encuentran aquellos que les brindan resistencia a plagas y
enfermedades, adaptación a los cambios de temperatura ambiental y también aquellos necesarios para desarrollar
flores y frutos. Tener un genoma simple como referencia, y sobretodo de una planta experimentalmente manejable,
como es Arabidopsis, nos permite hacer comparaciones e inferencias acerca del metabolismo de las plantas
cultivables, aislar genes, alterarlos y observar sus efectos. Se estima que las plantas producen más de 100 000
metabolitos secundarios potencialmente útiles. Así, conocer un genoma simple permite buscar características
comunes en genomas más complejos. Por ejemplo, entre los genes encontrados en Arabidopsis que pudieran ser
importantes en agricultura, están los de formación de flores, dispersión de la semilla y receptores y transductores de
señales que regulan la formación y maduración del fruto.
Por supuesto que ni las instituciones públicas, mucho menos las grandes compañías privadas como Pioneer-HiBred y Monsanto, han esperado mucho para iniciar Proyectos Genómicos en plantas de importancia agrícola (Tabla
3). Obviamente, la caza de genes significa patentes y nuevas oportunidades en el área biotecnológica. Entre los
proyectos genómicos de plantas, cabe destacar el del arroz, que probablemente será la primera monocotiledónea
secuenciada; la caña de azúcar, un proyecto financiado y realizado por Institutos Brasileños, los más avanzados en
Genómica en Latinoamérica; y los proyectos del Maíz y el Frijol, los cuales se han iniciado en la UNAM y el IPN
en México y en otros lugares del mundo.
Los Genomas del Maíz y el Frijol: la Importancia de Hacerlos en México. Resultaría paradójico que siendo
México el centro de origen y diversificación de estas plantas, terminara al cabo de unos años introduciendo en sus
campos variedades producidas por las compañias transnacionales. Si bien no es posible competir con las compañías
privadas y otras públicas, debido a que han invertido sumas considerables de dinero en identificar cuales son los
genes importantes de estas plantas, sí es necesario iniciar estudios genómicos de estos cultivos porque, en primer
lugar, disponemos de una gran diversidad genética de ambos y en segundo lugar, constituyen la base económica y
alimenticia de millones de Mexicanos.
El problema de secuenciar genomas de plantas es muy grande debido a que contienen miles de secuencias
repetidas, transposones y como en el caso del maíz, los genes constituyen pequeñas islas inmersas en océanos de
secuencias repetidas. Una solución a este inconveniente, es obtener la secuencia únicamente de los genes activos en
una determinada condición celular. Esto significa purificar los productos de estos genes (ARN mensajeros),
convertirlo a una cadena complementaria de ADN, y secuenciarlo. Esto genera segmentos de secuencia llamados
etiquetas de expresión (ESTs) muy útiles para tener una idea global de los genes activos y como marcadores en los
mapas cromosómicos. Sin embargo, los EST´s están limitados por la cantidad de ARN mensajero específico de una
condición determinada. Aquellos muy abundantes estarán sobrerepresentados sobre los que están en pocas copias.
Para solucionar esto se hace uso de bibliotecas sustractivas y normalizadas, estrategias que permiten descartar los
genes de actividad permanente o constitutiva, y además rescatar los genes pobremente representados.
En el Centro de Investigación y Estudios Avanzados (CINVESTAV) del IPN, en Irapuato, Guanajuato, se ha
emprendido recientemente la secuenciación del Maíz, con el objetivo de identificar y caracterizar genes de
importancia agrotecnológica. Se planea secuenciar 20 000 genes que se activen de manera diferencial en
condiciones de estrés ambiental, como sequía, salinidad o falta de nutrientes. También esperan caracterizar aquellos
genes que respondan a invasiones patógenas de hongos o bacterias y afecten el desarrollo de la planta y
consecuentemente la formación del grano.
En cuanto al frijol, se ha hecho mucho esfuerzo para consolidar un Proyecto Genómico a escala nacional e
internacional. Prueba de ello, es el Simposio sobre Genómica del Frijol, realizado en Febrero del año 2001 en
Cuernavaca, Morelos, con el auspicio del CIFN-UNAM. El Simposio congregó especialistas Mexicanos y
Extranjeros para discutir la importancia estratégica de obtener la secuencia de este genoma. Aún cuando no se han
definido las fuentes de financiamiento y participantes, se ha incrementado el interés en esta área. En particular, en el
CIFN se ha empezado a caracterizar de manera sistemática ADN complementario de nódulos con el objeto de
conocer cuantos y cuales son los genes de frijol expresados durante la simbiosis y elaborar un catálogo de EST´s.
Con todos los desarrollos descritos, es posible que en el curso de unos años logremos conocer todos los genes de
las plantas y microbios relevantes para la agricultura. Esto nos permitirá un manejo racional de los recursos
biológicos y diseñar adecuadamente nuestros planes de conservación de estos.
Agradecimientos. Al Dr.Miguel A. Cevallos por la invitación a colaborar en esta revista. Al Dr. Jean-Phillipe
Vielle, por proporcionarme los objetivos del Proyecto Genómico de Maíz en el CINVESTAV-Irapuato. A los
integrantes del Programa de Evolución Molecular del CIFN que revisaron atentamente el borrador de esta
colaboración.
RECUADRO
¿Cómo Secuenciar el Genoma de un Microorganismo?. Lo primero es contar con un medio de secuenciación
masiva. La tecnología de secuenciación genómica se basa en el método de terminación de cadenas inventado por
Friedrich Sanger en 1977, mejorada para la detección automática de los productos fluorescentes en capilares
ultradelgados. Los Secuenciadores Automáticos de Electroforesis Capilar, tienen un rendimiento aproximado de 48
000 bases cada dos horas. La estrategia de secuenciación depende del organismo y del estilo del investigador.
Algunos prefieren obtener mapas genéticos del o los cromosomas antes de comenzar, pero otros impacientes
prefieren una estrategia directa.
Este último método, llamado de “balazo” o “shotgun” fue aplicado por Craig
Venter del Instituto para la Investigación Genómica en Rockville, EEUU, en1995 a Haemophylus influenzae, cuyo
genoma tiene 1.8 Mb. Esta basado en la clonación al azar del genoma completo en fragmentos de 1 a 2 kilobases
(Kb), para obtener una biblioteca representativa del genoma. Cada clona que contiene un solo fragmento es
secuenciada y el resultado es enviado a una computadora que mediante poderosos programas ensambla las
secuencias similares en cadenas contiguas y consecutivas hasta inferir la secuencia total. A pesar del éxito del
método del “balazo”, aplicado también a organismos complejos como la mosca de la fruta Drosophila melanogaster
y el Genoma Humano, en la mayoría de los laboratorios se combinan mapas de los cromosomas con estrategias de
secuenciación y ensamble del tipo “balazo” para porciones establecidas del mapa..
Una vez obtenida la secuencia completa, esta debe ser analizada exhaustivamente para definir cuantos y cuales
genes tiene, donde comienzan y donde terminan, el producto que codifican, a que otros genes conocidos se parece,
cuales señales reguladoras tiene y otras, en un proceso llamado Anotación. Para ello en primer lugar se hace una
predicción de los genes potenciales, y en segundo lugar estos se comparan con las secuencias de genes conocidos
depositadas en diversas bases de datos internacionales (como el GeneBank y el Swiss-Prot). Las predicciones de
genes potenciales es muy certera para los genomas bacterianos y de arqueobacterias (99%), pero menos efectiva
para eucariótes (<50%), debido a la discontinuidad de los genes formados por exones e intrones. Las comparaciones
se hacen con programas de cómputo como el BLAST, que consiste en encontrar los mejores alineamientos entre
parejas de secuencias. Una evaluación de estos resultados y otros obtenidos con distintos programas de búsqueda y
comparación, permiten asignar la nueva secuencia a una familia de genes. En caso de no tener elementos de
comparación o que estos sean débiles o contradictorios, el gene predicho se anota como hipótetico o es descartado.
Aunque, hay procedimientos automatizados para realizar Anotaciones Genómicas, como el Magpie, del Instituto
Rockefeller, estos aún requieren intervención humana y un análisis gene por gene. Finalmente, mediante este
procedimiento, se obtiene un catálogo pormenorizado de todos los elementos que constituyen el genoma de una
especie particular, listo para usarse en cualquiera de las aplicaciones descritas.
Tabla 1. Usos de la Genómica de Plantas y Bacterias de Importancia Agronómica
Incrementar la disponibilidad de amonio a través de la fijación biológica de nitrógeno
Determinar las variedades de la planta mejor adaptadas a condiciones regionales
Modificar la riqueza nutritiva de los granos y frutos (carbohidratos, aminoácidos y grasas)
Uso efectivo y seguro de pesticidas y herbicidas
Tolerancia a condiciones extremas: salinidad, exceso o falta de agua, temperatura, sombra
Resistencia a virus, bacterias y hongos
Alteración del tiempo de maduración de los frutos
Aumentar la densidad de plantas en los cultivos
Modificar el metabolismo de algunas plantas para la obtención de productos medicinales
Explotación racional de los recursos naturales y conservación de la biodiversidad
Tabla 2. Genomas de Bacterias Simbióticas Fijadoras de Nitrógeno.
Bacteria
Mesorhizobium loti
Sinorhizobium meliloti
Tamaño del Genoma
7 596 Kb (completo)
6 690 Kb (completo)
Institución/País
Instituto Kazuza, Japón
Universidad de Stanford (EEUU),
Universidad McMaster (Canadá)
Universidad de Bielefeld (Alemania), Centro
Nacional de Investigación Científica (Francia)
Bradyrhizobium japonicum
410 Kb (isla simbiótica)
Rhizobium spp NGR324
536 Kb (plásmido simbiótico)
Rhizobium etli
372 Kb (plásmido simbiótico)
Universidad Técnica de Dresden (), Instituto de
Microbiolog Alemania ía (Suiza)
Instituto de Biología Molecular (Alemania),
Universidad de Genova (Suiza).
Centro de Investigación Sobre Fijación de
Nitrógeno, UNAM (México).
Tabla 3. Genomas de Plantas de Importancia Agronómica en Proceso de Secuencia.
Planta
Arroz
Tamaño del Genoma
440 Mb
Caña de Azúcar
Maíz
?
5 000 Mb
Trigo
Soya
Algodón
17 000 Mb
?
2 118 Mb
Cebada
Alfalfa
5 000 Mb
?
Tomate
?
Institución/País
Proyecto Internacional para la Secuenciación Genómica del Arroz (10
países), Monsanto
Universidad de Campinas (Brasil)
Cold Spring Harbor, Universidad de Minnesota, Universidad de Arizona
(EEUU). CINVESTAV-Irapuato (México)
Departamento de Agricultura (EEUU)
Universidades de Illinois, Iowa, Cornell y Washington (EEUU)
Universidades de Clemson, California, Iowa, Texas A & M, Southplains
Biotechnology Inc. (EEUU).
Universidad de Clemson (EEUU)
Departamento de Agricultura, Universidades de Kansas y Texas A & M
(EEUU)
Universidades de Berkeley, Cornell, Minnesota, Wisconsin. Instituto de
Investigación Genómica (TIGR) (EEUU)