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Universidad de Costa Rica
Escuela de Biología
Clase 2:
Micropropagación
Andrés Gatica Arias, M.Sc.
andres.gatica@ucr.ac.cr
www.biologia.ucr.ac.cr
Microprogación
• Multiplicación masiva bajo condiciones
in vitro.
Tomado de George et al. 2007.
Totipotencialidad
Ventajas
• Incremento acelerado del número de plantas.
• Reducción en el tiempo de multiplicación.
• Mayor control sobre la sanidad del material vegetal.
• Reducción en los costos.
• Facilidad en el transporte e intercambio de material
vegetal.
• Posibilidad de multiplicar rápidamente una variedad de
la cual solo existe un individuo.
Pasos en la micropropagación
• Murashige (1974):
– Establecimiento aséptico del explante.
– La multiplicación.
– Enraizamiento y aclimatación.
Etapa 0: Preparación del material vegetal
• Plantas donadoras de campo: alta contaminación.
• Pretratamiento
de
la
planta
donadora
explantes.
• Crecimiento bajo condiciones de invernadero.
• Análisis de patógenos en los explantes.
de
Explante
• Tomar en cuenta el objetivo.
• Estado y edad fisiológica de la
planta madre.
• Tamaño y la naturaleza del
explante.
• Posición en la planta madre.
• Época del año.
Tomado de George et al. 2007.
Tomado de George et al. 2007.
Tomado de George et al. 2007.
Tomado de George et al. 2007.
Etapa 1: Establecimiento cultivo aséptico
• Establecer cultivos viables y
axénicos.
• Selección del explante.
• Desinfección superficial del
explante.
Etapa 2: Multiplicación
•
Mantener y aumentar la cantidad de brotes para los nuevos ciclos de
multiplicación y enraizamiento.
•
Vías de regeneración: organogénesis y embriogénesis.
•
Evitar la formación de callos.
•
Factores importantes: medio de cultivo, reguladores de crecimiento y
las condiciones de crecimiento.
•
Se debe de reducir el estrés provocado a las plantas.
– Evitar la producción de fenoles y la hiperhidricidad.
Oxidación fenólica
• Liberación de compuestos
fenólicos al medio de
cultivo.
• Carbón activado, PVP,
ácido
cítrico,
ácido
abscórbico, modificación
del pH, inactivación de
fenoloxidasas.
Debergh et al. 1992. Plant Cell Tiss. Org. Cult. 30: 135-140.
Hiperhidricidad
• Antes llamado vitrificación.
• Proceso morfológico, anatómico y fisiológico que
producen órganos, hojas de una apariencia vidriosa y
transparente.
• Transición del estado líquido al sólido.
• Producido por la humedad relativa y el potencial de
agua.
• Afecta la fotosíntesis y la transpiración.
Síntomas de la hiperhidricidad
• Los síntomas no son idénticos en todas las plantas.
• Los brotes presentan entrenudos cortos y en forma de
roseta.
• Las hojas son gruesas, translúcidas y con un color
anormal.
• Formación de raíces en brotes adventicios es difícil.
• Menos lignina y celulosa.
• Menor peso seco y un mayor contenido de agua.
Síntomas de la hiperhidricidad
• Brotes y hojas con grandes espacios intercelulares e
hipolignificación del sistema vascular.
• Sistema vascular reducido o anormal.
• Hojas presentan un reducido número de células de
empalizada y una epidermis con una cutícula delgada.
• Más o menos estomas de lo normal y una función
anormal.
• Cloroplastos con menor contenido de clorofila.
• Pobre conexión vascular entre brotes y hojas.
Factores que causan la hiperhidricidad
•
Explante:
– Varía con la especie, cultivar y genotipo.
– Desinfección, corte del explante, posición de cultivo.
• Medio de cultivo:
– Consistencia, tipo y concentración de gelificante, citocinas y sales
minerales.
•
Contenedor:
– Material del contenedor y la tapa pueden afectar el intercambio gaseoso
(vapor de agua, CO2 y etileno).
•
El ambiente:
– Temperatura, intensidad y calidad de la luz, humedad relativa.
Soluciones: hiperhidricidad
• Contenedores con membranas permeables para el
intercambio de gas.
• Remover las hojas.
•
Eliminar, reducir o sustituir la concentración de BAP.
• Usar temperaturas bajas (2-4 •C).
• Incrementar la intensidad lumínica.
• Usar medio sólido con una alta concentración de
gelificante.
Etapa 3: Enraizamiento
• Formación de raíces adventicias.
• Subcultivo de brotes a un medio
con
menor
concentración
de
sales.
• Modificar el balance hormonal:
citocininas/ auxinas.
• Auxina más empleada: IBA
• In vitro o ex vitro.
Tomado de George et al. 2007.
Etapa 3: Aclimatación
• Paulatina adaptación de las vitroplantas a las
condiciones de invernadero.
• Fase de endurecimiento.
Factores que influyen en la micropropagación
• Planta que dona el explante.
– Edad fisiológica: requerimientos nutricionales y hormonales.
– Entre más joven y diferenciado sea el explante mejor es la respuesta in
vitro.
– Posición del explante en la planta madre.
• Tamaño del explante.
• El fotoperíodo, intensidad y calidad de la luz.
• Temperatura de crecimiento.
• Medio de cultivo.
Métodos de micropropagación
• Estímulo de las yemas axilares.
– Multiplicación de yemas preformadas.
• Diferenciación de brotes adventicios.
– Inducción de tejido meristemático e inducción de
brotes.
• Embriogénesis somática.
Tomado de George et al. 2007.
Tomado de George et al. 2007.
Tomado de George et al. 2007.
Microinjerto
Tomado de George et al. 2007.
In vitro vs. ex vitro
Tomado de George et al. 2007.
In vitro vs. ex vitro
Tomado de George et al. 2007.