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Crecimiento y Cultivo Celular
CULTIVO IN-VITRO DE RAÍCES TRANSFORMADAS
Las raíces de plantas superiores tienen la capacidad de sintetizar gran diversidad de
metabolitos secundarios y adaptar su metabolismo en respuesta al estrés causado por factores
bióticos como abióticos. El estudio del metabolismo rizosférico es de particular interés para
comprender la interrelación entre las plantas y otros organismos del suelo ya sean
beneficiosos o perjudiciales.
Entre los metabolitos de interés farmacéutico que se producen o acumulan en sistemas
radiculares se puede citar a los venenos y alucinógenos de raíces de mandrágora, a los
componentes de Atropa belladona que antiguamente tenía uso cosmético. Otros compuestos
alcaloidales de los cuales hyosciamina y escopolamina son los ejemplos mas conocidos son
sintetizados casi exclusivamente en raíces. Su mecanismo de acción se basa en su capacidad
de unirse a receptores de acetilcolina, justificando su extendido uso como relajantes de
musculatura lisa. Otros alcaloides que se hallan principalmente en raíces son nicotina y sus
derivados. El alcaloide emetina proviene de las raíces de Cephaelis ipecacuana. Algunos
nematicidas como tirabrina y terthienil, que son compuestos policétidos, se aíslan a partir de
raíces de Calendula officinalis y otras especies de la familia Asteraceae. Shikonina y otras
naftoquinonas estructuralmente relacionadas se acumulan en raíces de plantas de la familia
Boraginaceae y presentan, entre otras actividades acción antimicrobiana de amplio espectro.
La rotenona es un isoflavonoide de las raíces de varias legumbres leñosas y se usa como
pesticida. Los diterpenos que producen las raíces de Ginkgo biloba se utilizan para tratar
enfermedades cardíacas, demencia y senilidad. La forscolina, un labdano diterpeno, de raíces
de Coleus forscolii, se usa para tratar el asma bronquial porque es activadora de la adenilato
ciclasa. Las raíces de Camptotheca acuminata producen el alcaloide camptotecina que es una
droga anticancerígena.
El estudio de la bioquímica y la química de las raíces ha sido siempre acotado debido a
las dificultades técnicas derivadas de los hábitos subterráneos de este órgano. La posibilidad
de contar con un sistema de cultivo "in-vitro" se a tornado en una herramienta sumamente útil
a los fines de investigación.
La infección de muchas especies in-vitro con el microorganismo patógeno
Agrobacterium rhizogenes permite obtener clones de raíces estables y en condiciones
axénicas. Mayoritariamente, los clones preservan la capacidad biosintética de las raíces de las
plantas que les dieron origen, tal es el caso de las raíces de Hyoscyamus muticus que
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acumulan hyoscyamina a niveles que superan la capacidad biosintética de las plantas
silvestres, mostrando además un alto grado de crecimiento in-vitro.
La capacidad biosintética de los cultivos de raíces transformadas esta estrechamente
relacionada con la diferenciación celular, esto contrasta con los sistemas de cultivos
indiferenciados y además permite manejar material genéticamente estable a través de un
número indefinido de subcultivos.
Actualmente se ha reportado que el cultivo de raíces transformadas de alrededor de
doscientas especies de plantas superiores mayoritariamente dicotiledóneas se ha realizado en
forma exitosa y con altos rendimientos en lo referente a biosíntesis de metabolitos específicos.
Además los cultivos de raíces transformadas constituyen
modelos ideales para
realizar estudios metabólicos y regulatorios. Por ejemplo con estos sistemas se ha demostrado
que las raíces pueden expresar capacidad fotosintética, llegando en algunos casos a
desarrollarse en ausencia de fuentes hidrocarbonadas, en total fotoautotrofía. Ya que la
asimilación de carbono esta estrechamente afectada por la producción de metabolitos
secundarios estos sistemas son aptos para analizar interacciones entre metabolismo primario y
secundario.
Las raíces transformadas son también capaces de biotransformar compuestos y
permiten establecer sistemas de co-cultivos
con otros organismos. Por ejemplo raíces
transformadas de Daucus carota pueden ser infectadas con varias especies de Glomus, que
son hongos que naturalmente se desarrollan simbióticamente con plantas superiores
constituyendo un modelo de producción a gran escala de micorrizas. Además que la simbiosis
in-vitro induce a la acumulación de metabolitos secundarios, por ejemplo en Hordeum
vulgare dónde se incrementa notablemente la cantidad de glicósidos terpénicos. Otro caso
interesante es el co-cultivo de raíces de Catharanthus roseus con Acaulospora scrobiculata,
donde el consumo de gran parte de los fosfatos del medio de cultivo por parte de los
microorganismos revierte el efecto inhibitorio que ejerce este anión sobre la acumulación de
alcaloides indólicos. También se han co-cultivado nemátodos y áfidos, lo cual constituye un
apropiado modelo para el estudio de interacciones y mecanismos de defensa.
Otra aplicación de los cultivos de raíces transformadas es la producción de proteínas
bioactivas; dentro de las que puede hacerse mención a la producción de exoenzimas como
peroxidasas en Brassica napus, quitinasas de acción antifúngica, glucanasas y proteínas
activantes de ribosomas (RIPs). También es posible acumular proteínas de almacenamiento,
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como es el caso de sporamina en batata que también ha demostrado jugar algún rol en
procesos de defensa.
Las principales ventajas de utilizar cultivos de raíces transformadas, en cabellera o
hairy roots para producir metabolitos secundarios en lugar de cultivos dediferenciados son:
•
Con estos sistemas no son necesarios medios suplementados con fitorreguladores para
desarrollar biomasa.
•
Las raíces transformadas crecen rápidamente, son robustas y vigorosas.
•
Sintetizan metabolitos secundarios característicos de las raíces de las plantas de las cuales
provienen.
•
La síntesis de estos metabolitos se realiza a niveles reproducibles puesto que, a diferencia
de los cultivos de células indiferenciadas, son genéticamente estables por períodos
prolongados de cultivo.
•
El cultivo masivo de raíces transformadas es sencillo y se desarrolla muy bien en
biorreactores, ampliando la posibilidad de aplicación industrial de estos procedimientos.
A modo de resumen de lo anteriormente citado el cuadro que se expone a continuación
muestra algunos ejemplos de metabolitos secundarios sintetizados en raíces, aunque a
veces en plantas silvestres se acumulen en otros órganos. Muchos de ellos presentan
potencial o comprobado uso industrial o terapéutico y pueden producirse a escala por
cultivos de raíces transformadas.
Metabolito
Especie vegetal
Aplicación
Atropina
Hyoscyamus
Anticolinérgico
Berberina
Hydratis canadensis
Antihemorrágico uterino
Esteres de bornilo
Valeriana
Sedante
Ginsenósidos
Panax
Tónico, estimulante
Rotenona
Derris elliptica
Insecticida
Vincristina, vinblastina Catharantus roseus
Antileucémico
Quinina, quinina
Cinchona
Antimalárico, antirreumático
Reserpina
Rauwolfia
Antihipertensivo
Raíces transformadas
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Algunos metabolitos secundarios sintetizados por raíces de plantas
El cultivo in-vitro de raíces transformadas.
La enfermedad vegetal denominada “raíz en cabellera” o “Hairy roots” afecta a plantas
dicotiledóneas el fitopatógeno causal es la bacteria Gram negativa Agrobacterium rhizogenes.
El microorganismo posee un plásmido llamado Ri (inductor de raíces) que integrado al
genoma vegetal induce la producción de raíces a partir de cualquier órgano. El plásmido, de
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aproximadamente 250 kb, es el factor patogénico que ocasiona la expresión de la enfermedad,
caracterizada por la producción de raíces en cabellera y la síntesis de metabolitos específicos
llamados opinas.
El T-ADN es el sector del plásmido que se transfiere a las células huésped, por lo que
esta flanqueado por las secuencias bordes de aproximadamente 25 pb esenciales para la
transferencia. En el T-ADN existen dos regiones, la derecha (TR) y la izquierda (TL). Ambas
codifican para funciones rizogénicas una vez integradas a la célula huésped. La región TR
especifica la síntesis de agropinas y auxinas, mientras que la TL porta cuatro loci que
contienen los genes rol (A,B,C y D), implicados en el desarrollo morfológico de las raíces
mediante la sensibilización de las células al efecto auxínico.
El gen rol D induce la formación de tejido de callos mientras que los genes rol A, B y
C regulan el tamaño, grado de ramificación, alteraciones de tropismo y demás características
de las raíces en cabellera.
Como fue mencionado en la región TR del T-ADN se encuentran los genes que
codifican para la producción de opinas. Estos metabolitos son aminoácidos no usuales
derivados de carboxietil o dicarboxipropilarginina (series octopina y nopalina) y del ácido
glutámico y manitol (agropinas).
Los genes codificados en el T-DNA presentan secuencias regulatorias eucarióticas que
permiten su expresión en las plantas infectadas. En la región Ri hay también genes vir cuya
transcripción induce la síntesis de compuestos fenólicos como los que liberan las plantas
mecánicamente injuriadas como las acetosiringonas.
En ausencia de TR DNA los genes Ri del TL-DNA dirigen la diferenciación hacia raíces en
cabellera si hay suministro de auxinas exógenas.
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Opinas sintetizadas por plantas infectadas con Agrobacterium rhizogenes
Las opinas son utilizadas como fuente de C y N por el Agrobacterium pero no por la
planta y su síntesis determina una desviación energética del vegetal en provecho de la
bacteria. En muchos casos las opinas son el metabolito más importante de las células
afectadas, constituyendo hasta un 7 % del peso seco total. En un proceso de infección normal
las opinas son secretadas al suelo y son catabolizadas por los Agrobacterium de vida libre.
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Tecnología básica para el desarrollo y mantenimiento de raíces transformadas.
1. Establecimiento de cultivos.
•
Se deben preparar suspensiones de A. rhizogenes de 48 h. de edad cultivado entre 2526°C, puesto que a temperaturas mayores de 28°C pueden provocar la “cura” de la
bacteria de su plásmido.
•
Acondicionar los explantos a infectar que pueden ser órganos de plantas silvestres o
preferentemente plántulas estériles.
•
Provocar cortes con una jeringa hipodérmica conteniendo la suspensión de A. rhizogenes
sobre la superficie de los explantos y cultivar.
•
A los 7-14 días, cuando las raíces emergentes tengan de 5-10 mm de longitud,
seccionarlas, separarlas del explanto y colocarlas en medio de cultivo apropiado (B5, LS o
MS de media fuerza (La mitad de la concentración salina) con 30g/l de sacarosa y 0.5
mg/ml de sulfato de ampicilina).
•
Subcultivar cada dos semanas en el mismo medio utilizando inóculos de 3 a 4 cm de
longitud con ramificaciones laterales.
•
Luego de 8 subcultivos suprimir el agregado de antibiótico al medio.
La proliferación celular solo ocurre en las zonas meristemáticas apicales.
La composición de los medios de cultivo afecta tanto a crecimiento como a la producción de
metabolitos. Algunas variables son los niveles de sacarosa, el agregado de fitoreguladores, la
naturaleza de la fuente de nitrógeno y sus proporciones, la luz y la temperatura.
Las raíces transformadas son capaces de sintetizar una cantidad estable de fotoquímicos pero
su capacidad de liberación al medio suele ser limitada. Esto constituye una dificultad
tecnológica para la recuperación y además limita la biosíntesis por retrocontrol. Ciertas
manipulaciones de las condiciones de cultivo favorecen la excreción. Por ejemplo la privación
de oxígeno en cultivos de raíces de Beta vulgaris incrementa la liberación a los medios de
betacianina. La permeabilización con Tween 20 libera al medio hyosciamina a partir de
raíces de Datura inoxia. La adición a los cultivos de resinas como XAD-2 o parafina líquida
aumenta la producción de shikonina y la liberación de alcaloides del tropano se ve
transientemente incrementada con el agregado de 5 mM de H2O2.
Una vez establecidos los cultivos de raíces transformadas se pueden desarrollar a partir
de pequeños inóculos y obtener buenos índices de crecimiento. El principal problema es el
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cambio de escala a niveles industriales ya que la agitación mecánica causa injurias que
conducen a la formación de callos.
Las características del crecimiento, dependiente y a partir de los tejidos
meristemáticos, hace que en los medios líquidos, en grandes volúmenes se formen esferas de
raíces con las raicillas jóvenes en crecimiento sobre la periferia y un corazón de tejido viejo
en el interior. La restricción nutricional que soporta esta parte interna, principalmente en lo
referido al oxígeno da origen a un “bolsillo” de tejido senescente. Debido a las ramificaciones
las raíces forman una matriz que ofrece resistencia al flujo, siendo el principal problema
nuevamente el suministro de oxígeno.
Perspectivas futuras del uso de raíces transformadas
El reconocimiento de que la función de las raíces vegetales excede ampliamente la
captación de nutrientes y el establecimiento de asociaciones simbióticas abre
muchas
posibilidades de investigación. Las raíces son órganos con un metabolismo único y propio.
Producen metabolitos y enzimas bioactivas que ayudarán a comprender y utilizar importantes
interacciones rizosféricas. La posibilidad de desarrollar raíces in-vitro de numerosas especies
permitirá manipular el metabolismo mediante la caracterización de las enzimas involucradas
en las rutas específicas y el posterior clonado de sus genes. El potencial de la ingeniería
metabólica ha sido demostrado mediante la expresión de un anticuerpo monoclonal que se une
a una proteína de superficie del Streptococcus mutanns agente causal de las caries dentales en
raíces transformadas de Nicotiana tabacum.
A partir de raíces transformadas se regeneran rápidamente plantas transgénicas o
clones con estabilidad genética, constituyendo este un buen sistema para la propagación
clonal de plantas de elite, muy aplicable a la biotecnología de especies arbóreas.
Con excepción de las secuencias border, ninguna de las otras se requiere para la
transferencia de T-DNA en A. rhizogenes, por lo tanto el resto puede ser reemplazada por
DNA extraño e introducido a células para que se desarrollen las raíces transformadas
transformantes.
Plantas enteras pueden regenerarse a partir transfiriendo las raíces a medios con
suplemento de fitorreguladores.
Las transformaciones mediadas por Agrobacterium tumefaciens presentan una lata
frecuencia de escapes, hecho que no es habitual en las mediadas por A. rhizogenes debido a
que el hecho de que los tejidos que presentan morfología de raíz son los transformantes
constituye una herramienta de selección adicional. Como la regeneración es posible sin
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atravesar el estado de callo se evitan las variaciones somaclonales y se pueden lograr vástagos
sin anormalidades citológicas, si bien se han logrado regeneraciones de algunas especies,
particularmente ornamentales, con fenotipos alterados como abundancia de raíces adventicias,
reducción de la dominancia apical y cambios morfológicos en hojas y flores que en definitiva
han resultado favorables. En algunos casos la producción de metabolitos secundarios en hojas
de plantas regeneradas a partir de raíces transformadas ha aumentado considerablemente.
Recientemente se ha reportado la producción de anticuerpos monoclonales en raíces
transformadas que fueron iniciadas a partir de plantas de tabaco transgénicas que expresaban
una IgG monoclonal.
Semillas artificiales se han desarrollado encapsulando segmentos de raíces, siendo este un
buen sistema para la propagación clonal con uniformidad genética.
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