Download Crecimiento y Cultivo vegetal Técnicas de Laboratorio Trabajo

Crecimiento y Cultivo vegetal
Técnicas de Laboratorio
Trabajo Práctico de Laboratorio N°4
Raíces transformadas
Objeto de la experiencia
Obtención de cultivos de raíces genéticamente transformadas mediante la infección de
explantos de plántulas estériles, utilizando Agrobacterium rhizogenes LBA 9401.
Procedimiento
1. Obtención de plántulas germinadas en condiciones asépticas
1.1. Sumergir las semillas en una solución de EtOH 70% por un lapso de 3 minutos.
Agitar vigorosamente. Decantar el líquido de lavado.
1.2. Agregar sobre el material vegetal una solución de hipoclorito de sodio (lavandina
comercial) al 20% con unas gotas del tensioactivo Tween 80 y agitar por un período de 15 min.
Decantar la solución de lavado.
1.3. En la cámara de flujo laminar realizar sucesivos lavados con agua bidestilada
estéril. Dejar el material sumergido en agua para evitar su deshidratación.
1.4. Trasferir las semillas desinfectadas a una placa de Petri estéril que contenga papel
Whatman húmedo. Colocar el germinador en oscuridad a 22-25°C hasta observar desarrollo de
las semillas.
1.5. Trasferir los brotes germinados a 30 mL de medio líquido Lismaier-Skoog (LS) por
10 días hasta obtener plántulas uniformes de 7 gramos aproximadamente.
2. Infección de las plantas con Agrobacterium rhizogenes.
En cabina de flujo laminar, separar las hojas, los tallos y las raíces de la planta germinada en
condiciones asépticas sobre una superficie estéril. Introducir la punta de una aguja hipodérmica
(tipo tuberculina) en una suspensión bacteriana de Agrobacterium rhizogenes en medio líquido
YMB, preparada 48 h antes. Realizar varios pinchazos sobre la superficie de los tejidos vegetales de
manera de infectar los mismos con la bacteria. Reinfectar periódicamente la punta de la aguja con la
suspensión bacteriana. Disponer los explantos infectados sobre placas de Petri que contienen agaragua (9g.l-1 de agar). Cerrar las placas, identificarlas convenientemente y sellarlas con film
adherente. Incubar durante 48 h.
3. Transferencia a medio de cultivo
Transferir los explantos infectados a medio de cultivo MSRT conteniendo 1 g/ml de
ampicilina, con probada actividad antimicrobiana hacia la cepa de A. rhizogenes empleada.
Incubar los explantos en oscuridad durante varios días en condiciones controladas de
temperatura (22-26ºC) hasta observar la formación de raíces adventicias. Escindir las mismas
cuando éstas presenten una longitud de aproximadamente 1 cm. Luego de 8 subcultivos suprimir el
agregado de antibióticos al medio de cultivo.
4. Repique
Una vez establecido el cultivo de raíces transformadas, mantener el mismo por repiques
periódicos a medio de cultivo MSRT sin el agregado de fitorreguladores en oscuridad. Para este
procedimiento, se cortan 5-10 “tips” (puntas de las raíces) y se colocan en el centro de una placa de
Petri con medio de cultivo sólido. Esto mismo puede realizarse para iniciar cultivos sumergidos,
transfiriendo el material vegetal a medio líquido e incubando con agitación rotatoria a 80-120 rpm.
Nota: En todos los casos es necesario verificar la naturaleza transformante de los cultivos obtenidos
por PCR con primers específicos, para confirmar la integración de los genes bacterianos en el
genoma vegetal.