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Hiperhomocisteinemia en la fertilidad de
las hembras carentes de la enzima
cistationina beta sintasa.
Mª Ángeles Navarro Ferrando
CP08/00043
I Jornadas Científicas IIS Aragón
Zaragoza, 8 de noviembre de 2010
La homocisteína es un aminoácido no esencial cuya elevación
sanguínea se asocia con el desarrollo de enfermedades de tipo
vascular, neurológico y reproductivo
Hiperhomocisteinemia
En el campo de la reproducción humana se ha visto que la
hiperhomocisteinemia (Hhcy) es un factor de riesgo asociado
a problemas placentarios como la preclampsia, abrupción,
infarto placentario o aborto espontáneo.
Metabolismo de la homocisteína
Proteínas
Remetilación
STHM
ATP
Metionina
THF
Dimetilglicina
Metilén
THF
MAT
MS
Vit B12
SMMT
S-adenosil metionina
BHMT
Metilación de
fosfolípidos, proteínas,
DNA …
Betaína
MTHFR
Metil THF
S-adenosil homocisteína
Homocisteína
Serina
CBS
SAH
Vit B6
SH2
Cistationina
CGL
Transulfuración
α - cetoglutarato + NH4
Vit B6
Cisteína
Taurina
SH2
Sulfato + CO2
Glutation
Deficiencia de la enzima cistationina beta sintasa (CBS) en
la población
El defecto se transmite de forma autosómica recesiva
Incidencia
homocigosis 1:58000 y 1:1.000.000
heterocigosis 1:100
Valores de homocisteína en homocigosis pueden llegar
hasta 400 micromolar
Modelo animal de hiperhomocisteinemia
Ratones carentes de CBS
1. Los homocigotos presentan una hiperhomocisteinemia muy
severa y logran completar el desarrollo embrionario
normalmente
Parámetro μM
Cbs +/+
Cbs -/-
Homocisteina
25,4 ± 4,8
353 ± 81
Metionina
144 ± 12
2545 ± 241
a
Animales de 2 semanas estirpe C57Bl/6J media ±SD
a, p<0.001 t Student
(Akahoshi et al ,2008)
a
Ratones carentes de CBS
2. Presentan bajo peso al nacer, retardo de apertura del ojo,
anormalidades esqueléticas tales como cara, cola y
extremidades muy alargadas y delgadas. El pelo en el lomo es
menos denso y con menor diámetro
WT (cbs +/+)
(Watanabe y cols., 1995)
KO (cbs -/-)
Ratones carentes de CBS
3. El 80% de estos animales mueren antes de cumplir los 21
días
% supervivencia
100
80
60
cbs -/cbs +/+
40
20
0
0
5
10
15
día
(Watanabe y cols., 1995)
20
25
30
Ratones carentes de CBS
4. Los hepatocitos de estos animales son de mayor tamaño
con inclusiones lipídicas intracitoplasmáticas
WT (cbs +/+)
(Watanabe y cols., 1995)
KO (cbs -/-)
Ratones carentes de CBS
5. Los machos que sobreviven son fértiles mientras que las
hembras no lo fueron
(Watanabe y cols., 1995)
Evaluación del comportamiento reproductivo en hembras
en función del genotipo
Mating
female x male
Number
of
mating
Number of
plugs
Number of
pregnacies
Number
of pups
Litters size
Number of
surviving
pups
cbs +/+ x cbs +/+
6
6
6
49
8 ± 2a
46
cbs +/- x cbs +/-
6
6
6
39
6 ± 2a
24
cbs +/- x cbs -/-
10
9
7
39
6 ± 1a
23
cbs -/- x cbs -/-
10
10
1
2
0.4 ± 1
0
Animales de 6 meses
a, p<0.001
vs cbs -/- x cbs -/- anova.
( Guzman et al Human Molecular Genetics 2006. 15: 3168–76)
Evaluación del comportamiento reproductivo en hembras
trasplantadas
Mating
Transplanted female x male
Number of
pups
Liter
size
Number of
surviving pups
cbs -/- ovary → cbs +/+ x
cbs -/-
7
3 ± 1
7
cbs -/- ovary → cbs +/- x
cbs -/-
12
3 ± 1
12
cbs -/- ovary → cbs +/-
cbs +/+
3
2 ± 1
3
11
3 ± 1
11
x
cbs +/+ ovary → cbs +/- x cbs +/+
( Guzman et al Human Molecular Genetics 2006. 15: 3168–76)
Objetivo 1
Determinación del momento del
desarrollo del embrión en el que se
produce la muerte.
Objetivo 2
Investigación de los mecanismos
implicados mediante la caracterización
de los patrones de expresión de los
úteros grávidos en el momento de fallo
del embrión.
Objetivo 1
Determinación del momento del
desarrollo del embrión en el que se
produce la muerte.
Grupos experimentales
• Grupo Control : WT (edad 12 semanas)
♀ Cbs +/+ X ♂ Cbs +/+
n=24
• Grupo Homocigoto: Cbs KO (edad 12 semanas)
♀ Cbs -/- X ♂ Cbs -/n=24
♀ gestantes sacrificadas a día 4, 8, 12 y 16
de gestación (n=6)
Diseño experimental
gestación
Ayuno
día 4,8,12,16
Toma de muestras
Eutanasia con
CO2
Tejidos
Plasma
(Ovario, útero, embriones, placenta)
Registro de pesos y nº de
sitios de implantación
Homocisteína
Cisteína
Lípidos
Análisis de
expresión
Análisis
proteómico
Análisis
histológico
Objetivo 2
Investigación de los mecanismos
implicados mediante la caracterización
de los patrones de expresión de los
úteros grávidos en el momento de fallo
del embrión.
Análisis de expresión de los úteros a día 8 de gestación
Grupos experimentales
Útero hembras cbs +/+
con
Sitios de implantación
Útero hembras cbs -/-
sin
Análisis de expresión de los úteros a día 8 de gestación
Procedimiento experimental
• Extracción y limpieza de RNA
•Análisis de expresión (Affimetrix gene chip).
•Identificación de los genes sobreexpresados y reprimidos
en las diferentes condiciones experimentales con
respecto al grupo control
•Confirmación a nivel individual por real time PCR
Objetivos Futuros
3.Recuperación del fenotipo de fertilidad femenina por
ingeniería genética y terapia celular.
4.Inducción del fenotipo de infertilidad en ausencia de
expresión de cbs utilizando siRNA.
5.Ratificación de los mecanismos propuestos en el objetivo 2
al verse corregidos en la recuperación del fenotipo.
Agradecimientos
Dr. Jesús Osada
Mario Nuño
Dr. Mario Alberto Guzmán
Dr. José Manuel Lou
Dr. Alfonso Sarriá
Dra. Natalia Guillén
Dr. Sergio Acín
Roberto Martínez
Dr. Joaquín Surra
Cristina Barranquero
Sara Sancho
Clara Gabás
Adela Ramirez