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Detección de patógenos en alimentos,
utilizando la técnica de PCR, reacción en
cadena de la polimerasa.
Lic. Esp. Mariano Diego Massari
1er Congreso Bioquímico – Córdoba 2011
8ª Jornada de Actualización en Especialidades Bioquímicas
2ª Jornada: “El Rol del Bioquímico y la Formación de los Futuros Profesionales””
Tendencia en la utilización de la Biología
Molecular como herramienta para el
diagnóstico.
• Desarrollo de metodos más rápidos y efectivos,
altamente especificos.
• Los metodos convencionales son laboriosos y llevan
demasiado tiempo.
• El éxito de la implementación de la PCR para la
identificación de microorganismos patógenos es la
elección correcta de secuencias blanco.
Fundamento del PCR
• La PCR es una metodología que consiste en la
amplificación enzimática en ciclos repetidos de un
fragmento específico de ADN o ARN utiliza la
enzima ADN polimerasa, a partir de pequeñas
cantidades de moléculas de ADN o ARN. Dos
oligonucleótidos son utilizados como cebadores
“Primers”. Estos son cadenas de nucleótidos que
se unen a secuencias complementarias en el
extremo 5´ de cada hebra de ADN a amplificar.
Pasos a realizar en una PCR
•
•
•
•
•
•
Obtener el ADN “templado”
Preparación de la mezcla de la reacción .
Agregar el templado a la mezcla de reacción.
Ciclado.
Electroforesis en gel de agarosa.
Visualización / registro de resultados.
Obtención de Templados
• Estandarizar el método de extracción de acuerdo a
la matriz.
• Para el aislamiento bacteriano, solo es necesario el
proceso de hervido. En cambio para el aislamiento
en muestras mas complejas que pueden llegar a
contener inhibidores o poca carga bacteriana, es
necesario un enriquecimiento bacteriano previo y en
algunos casos la necesidad de eliminar los
inhibidores.
• Para la realización de una simple PCR no es
necesario un ADN tan limpio y purificado, pero para
realizar una secuenciación si es necesario que este
ADN este limpio y purificado.
Preparación de la mezcla de reacción
• Buffer Tris-HCl 20mM y 50nM KCl pH 8.3- 8.9. es
necesario para la adecuada actividad enzimática.
• Cloruro de Magnesio: cofactor indispensable (Taq
polimerasa) y afecta el “annealing” de los “primers“.
Los rangos de concentración utilizados son de (1 a 3)
mM.
– Altas concentraciones disminuyen la especificidad de
la reacción.
– Bajas concentraciones disminuyen la eficiencia de la
reacción.
• Deoxirribonucleotidos: ATP, CTP, GTP Y TTP,
(dNTps).
– Agregados en iguales proporciones para minimizar falsas
incorporaciones en la polimerización.
– Se ajusta la concentración para optimizar la especificidad y
fidelidad de la reacción. Generalmente 100 uM en el ensayo.
• Primers o cebadores:
– Preferentemente entre 15 y 30 pb de longitud.
– No deben ser complementarios entre si .
– Deben tener similar contenido de (G + C) y en baja conc. en
el extremo 3´.
– No deben contener estructuras secundarias.
– El rango de concentración en el ensayo varía desde
(0.3 a 1) uM.
• Altas concentraciones disminuyen la especificidad de la reacción.
• Bajas concentraciones disminuyen la eficiencia de amplificación.
• Enzima ADN polimerasa:
– Enzima Taq polimerasa.
– Tienen actividad de polimerasa y exonucleasa 5´ - 3 ´.
– Debe agregarse al final de la preparación de la
máster mix.
– El rango habitual en cada ensayo es de (0.5 – 2.5) U.
• baja concentración disminuye el rendimiento de la reacción
• altas concentraciones generan productos inespecíficos.
“ La concentración en la que se utilizan
cada uno de los reactivos va a afectar la
sensibilidad y especificidad de la
reacción”.
Todos los reactivos deben ser conservados a -20 °C.
• ADN blanco,
– La secuencia a amplificar debe contener desde menor a 0.1
a unas pocas kilobases.
– La cantidad total de ADN usado normalmente es de 0.05 a
1.0 ug.
– No es necesario que la muestra conteniendo la secuencia a
amplificar esté altamente purificada.
Controles
• Blanco de Templado:
– Reactivos solos, sin templado.
• Control positivo:
– templado de una cepa patrón que se sabe + (positiva).
• Control negativo:
- templado de una cepa patrón que se sabe – (negativa)
Pasos del termociclado
• El ciclado, consiste en una serie de pasos descriptos
a continuación:
• Desnaturalización inicial: (94-96)°C, (2-5) min
• Desnaturalización (94-96)°C , 30 seg – 1 min
• Annealing: (variable)°C, 30 seg – 1 min
• Extensión: 72°C , 30 seg – 1 min. (Temperatura
óptima de la polimerasa)
• Extensión final: 72°C, 10 min.
• Generalmente pueden ir de 25 a 35 ciclos
Temperatura
100
50
Melting
94 oC
PCR
Melting
94 oC
Extension
Annealing
72 oC
Primers
50 oC
0
3’
5’
5’
Tiempo
5’
5’
5’
5’
3’
5’
5’
5’
5’
5’
5’
30ciclos
Temperatura
PCR
100
Melting
94 oC
50
Melting
94 oC
Extension
Annealing
72 oC
Primers
50 oC
0
3’
5’
5’
Tiempo
5’
5’
5’
5’
3’
5’
Fragmentos de
tamaño definido
5’
5’
5’
5’
5’
30ciclos
Temperatura
PCR
100
50
Melting
94 oC
Melting
94 oC
Extension
Annealing
72 oC
Primers
50 oC
0
3’
5’
5’
Tiempo
5’
5’
5’
3’
Calor
5’
5’
Calor
5’
30ciclos
Producción de productos inespecíficos
• Altas concentraciones de nucleótidos.
• Bajas temperaturas de annealing.
• Bajas temperaturas de extensión.
Electroforesis en gel de agarosa
• Se utilizan soluciones de agarosa a variadas
concentraciones % P/V utilizando como solvente
Buffer Tris Acético EDTA (TAE) 1X o Tris Borato
EDTA (TBE) 0.5X.
• La concentración de la solución de agarosa a
preparar va a depender del tamaño de los
fragmentos a separar en la electroforesis
Agarosa % (P/V)
Rango de separación de fragmentos de ADN (kb)
0.7
0.8 - 10
0.9
0.5 - 7
1.2
0.4 - 6
1.5
0.2 - 3
2.0
0.1 - 2
Condiciones de corrida electroforética
• Dependiendo del número y tamaño de los
fragmentos a separar, se ajusta el voltaje y tiempo
aplicado a la cuba electroforética en donde se
realizará la corrida.
• Generalmente en varias aplicaciones se utiliza un
fuente con voltaje de 100V durante un tiempo
aproximado de 30 minutos.
Visualización del gel de agarosa
• Posterior a la corrida electroforética el gel puede
teñirse, sumergiéndolo en una solución de Bromuro
de Etidio por el transcurso de un tiempo. Luego este
es observado bajo una lámpara ultravioleta, en
donde se notaran las diferentes bandas separadas
mediante la corrida electroforética.
• Para un posterior análisis y una documentación del
ensayo realizado puede tomarse una fotografía del
gel.
Tipos de PCR
• PCR simple
Sensibilidad analítica alta (100 a 1000 copias de
genoma, detectable).
• PCR Anidado - Nested PCR
Consta de dos ciclos de amplificación (2 PCR) con cuatro
cebadores, denominados cebadores externos e internos
La primera amplificación da 2 fragmentos resultantes.
La segunda reacción trabaja sobre los fragmentos obtenidos en la
1ra reacción.
Sensibilidad analítica: menor a 10 copias de genoma. Muy sensible.
Este modo es mas especifico, ya que cuando la Taq trabaja con
grandes cantidades de DNA, su fidelidad disminuye.
En cambio con este método, se trabaja con fragmentos cortos
desde la segunda reacción, lo que hace mas efectivo el proceso.
La especificidad también aumenta porque cuatro oligonucleótidos
tienen que unirse específicamente
• PCR Multiple ( Chamberlain 1988)
Se lleva a cabo la reacción de PCR tradicional, pero
con mas de un par de primers, para amplificar varias
regiones al mismo tiempo.
• PCR Invertido o PCR con transcriptasa inversa
(RT-PCR)
Es una variante de la PCR en la que
usamos ARN como molde inicial en vez de ADN, y
emplea una transcriptasa inversa para realizar la
síntesis de un ADN complementario al ARN
(ADNc). De esta forma, el desarrollo inicial de una
RT-PCR sería:
1er paso: retrotranscripción a partir del ARN.
2º paso: amplificación a partir de la primera hebra de
ADNc.
3er paso: PCR estándar.
• Real Time PCR (r t PCR)
– Los productos de amplificación se detectan de
forma directa durante los ciclos de amplificación,
utilizando sondas marcadas con fluorescencia,
TaqMan o Molecular Beacon.
– La fluorescencia se mide a través de la tapa o del
lado del recipiente de reacción
Se puede dividir en las técnicas basadas:
1- En fluorocromos no específicos.
2- En sondas específicas.
1- Utiliza el SYBR Green, que es un fluoróforo que se
intercala en el DNA de doble hebra. Por ende,
mientras mas DNA amplificado exista en el medio,
mas SYBR green se intercalara y la luminiscencia
aumentara proporcionalmente a los fragmentos
amplificados.
-Ventaja : Utilizar cebadores normales.
Más económica que la que usa sondas
específicas.
- Desventaja: Permite cuantificar sólo una secuencia
por reacción.
2- Utilizan una sonda unida a dos fluorocromos que
hibrida en la zona intermedia entre el iniciador directo
(forward) y el inverso (reverse).
Esto permite monitorizar el cambio de patrón de
fluorescencia y deducir el nivel de amplificación del gen.
- Ventaja:
•
•
Muy Precisos y evita posibles secuencias inespecíficas.
Permite cuantificar el ADN amplificado.
- Desventaja:
•
.
Mas laborioso y costoso (diseño de secuencias específicas
como sondas)
Hairpin Probes (Molecular Beacons)
• Sondas con secuencias repetidas invertidas en sus
extremos
• Permitiendo forme una estructura de horquilla.
• Ventaja:
– Mas específica que las sondas TaqMan.
– Puede combinar varias Molecular Beacons en una única
reacción. (Multiplex PCR).
• Desventaja:
– Diseño riguroso de las regiones tallo y asa de la horquilla.
Sondas Hidrolizadas (TaqMan)
reportero
quencher
Actividad exonucleasa
Hybridization Probes :