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Replicación del DNA Cromosomas Procariontes Cromosoma lineal eucarionte Replicación semiconservativa Replicación bidireccional 7 Replicación semidiscontinua la polimerización se lleva a cabo en dirección 5´--3´ Replicación del DNA y ciclo celular Etapas de la Replicación I. Inicio: es el punto en donde se regula el proceso II. Elongación III.Terminación OriC E. coli Secuencia rica en T-A Minicromosomas para determinar el origen mínimo E. coli DNA cromosomal (E. coli) + Enzima de restricción DNA plasmídico + Enzima de restricción origen + + R R mezclado Transformar bacterias Medio con antibiótico ligasa X DNA NO se replica Ori-coli Medio con antibiótico R Se replica Metodo de footprin6ng para determinar el si6o de origen de la replicación Dna A reconoce el si6o de inicio de la replicación 1) 2) 3) 4) Nucleasa + DNA Ori Dna A + DNA Ori DnaB + DNA Ori DnaC + DNA Ori 1 2 3 4 245 1 Secuencia del origen de Replicación bacteriano Región de los treceámeros (tres repe3ciones de 13 nucleó3dos), 70% AT 5 Nonámeros o cajas DnaA once si6os GATC en la secuencia de 245pb Organización del OriC DUE: DNA unwinding element IHF: Integration host factor FIS factor DnaA DiaA: DnaA initiator-associating protein IHF: Integration Host factor 1) Activación 20-30 DnaA Arginina 285 es importante en la oligomerización Proteína DnaA • Monómero 52kDa • Se une con alta afinidad y de forma coopera6va a las cajas dnaA • Complejo DnaA-‐ATP mayor afinidad por el DNA que complejo DnaA-‐ADP • Estequiometria de hasta 20-‐30 subunidades de DnaA por oriC • Une ATP y lo hidroliza a una velocidad muy baja • Una vez abiertos los treceámeros, DnaA reconoce las cajas presentes en el DUE y se une a la cadena sencilla estabilizandola. DiaA: DnaA initiator-associating protein IHF: Integration Host factor 1) Activación 20-30 DnaA 2. Formación del pre-primosoma HELICASA DnaB C-terminal ATPasa Se mueve en dirección 5´---3´ DnaB • Monómeros de 60kDa que forman un homohexámero • Ac6vidad de helicasa • Dominios para : ü Unión a DNA de cadena doble ü Unión a DNA cadena sencilla ü Interacción con DnaC y DnaA ü Hidrólisis de NTPs (ATP) Dna C • Monómeros de 28 kDa • Homohexámero que permite la llegada de DnaB • ATPasa: al hidrolizar ATP pierde afinidad por DnaB Pre-primosoma y primosoma Regulación negativa del inicio de la replicación 1) Hda (RIDA: regulatory inactivation of DnaA) Modelo de inactivación de DnaA 2) dat locus (DnaA titulación): sitio en el cromosoma que une grandes cantidades de proteína DnaA Aproximadamente 200-300 moléculas de DnaA pueden unirse al locus dat. El locus dat (1kb) contiene 5 cajas DnaA y un sitio para IHF 3) Interacción de OriC con SeqA y la membrana Regulacion del Inicio de la Replicación Regulación de DnaA Regulación de OriC Cajas DnaA fuera del origen (locus datA) Region promotora de otros genes contienen cajas DnaA Promotor de DnaA tiene cajas DnaA y secuencias GATC. Orígenes de replicación (secuestro) Seq A Dam Reactivación de DnaA-ADP a DnaA-ATP DARS: DnaA reactivation sequence: sitios en el cromosoma que contienen cajas DnaA en orientaciones diferentes La helicasa rodea una de las hebras del DNA dúplex y se desplaza rompiendo puentes de hidrógeno, logrando la apertura de la doble hélice por exclusión estérica. Una hebra es retenida en el interior del anillo y la otra es excluida. SSB Las proteínas SSB se unen con alta afinidad al DNA de cadena sencilla y lo protegen de nucleasas y de asociaciones intracatenarias La replicación del DNA requiere un cebador • Dna G, Primasa, ≈ 60 kDa • RNA polimerasa • Sinte6za cebador de ≈ 12nt • DNA Primasa reconoce a DnaB DNA Pol I • Arthur Kornberg • primera polimerasa descrita • Pép6do de 103 kDa • • • • • • Dependiente de molde de DNA Dirección de la síntesis 5´-‐3´ Requiere extremo 3 ´OH Actividades de la DNA polimerasa I • Mutantes de E.coli en el gen de la Pol I son viables , por lo tanto la DNA polI no es la principal enzima replica6va (pero no soportan deleciones del gen). • Mutantes de DNA pol II son viables, aún con el gen deletado. • La DNApolIII es la principal enzima en la replicación del DNA. Las mutaciones son letales. • Fidelidad se refiere al seguimiento exacto de la secuencia de DNA que sirve como molde • La fidelidad de la replicación en bacterias: ≈10-‐8 a 10-‐10 • Procesividad # de nucleó6dos que se sinte6zan en un solo evento de unión. Una enzima procesiva agrega miles. DNA polimerasas en E. coli Por qué no existe una DNA polimerasa 3´--5´? Formación de la holoenzima an asymmetric dimer Subunidades de la DNA polimerasa III de E.coli sub # por holoenzima Mr Función dnaE α 2 132,000 dnaQ ε 2 27,000 holE θ 2 10,000 Acoplador dnaX τ 2 71,000 Dimerización dnaX γ 1 48,000 holA δ 1 35,000 holB δ´ 1 33,000 holC χ 1 15,000 holD ψ 1 12,000 dnaN β 4 37,000 Pol III Núcleo 10-‐15 Subunidad catalí6ca nuc/seg Proofreading Abrazadera que carga las subunidades β al DNA Complejo γ ó complejo τ Procesividad Pol III Pol III* Pol III holo 1,000 bases/seg Procesividad de la polimerasa III La procesividad de la DNApol lII* aumenta de 50 nts a más de 50,000 nts gracias a la subunidad β La replicación es semidiscon3nua Fragmentos de Okazaki 1200-‐2000 nt Interrupción de la replicación por la cadena retrasada?? Modelo del dímero Maduración de los fragmentos de Okazaki DNA polimerasa I ayuda a remover el cebador, ac6vidad exonucleasa 5´-‐3´ Ac6vidad de polimerasa reemplaza los nucleó6dos eliminados ≈17 DNA ligasa cataliza la formación de enlace fosfodiéster DNA ligasa Topoisomerasas en E. coli IA. 5´ TOPOISOMERASAS I Topoisomerasa I Topoisomerasa III IB 3´ TOPOISOMERASAS II IIA. IIB Topoisomerasa II (DNA Girasa) Topoisomerasa IV Termino de la replicación Interacción de Tus con la helicasa ORIGEN DE REPLICACION EUCARIONTE Solo uno o múltiples? Tiempo de replicación/tamaño de genoma Múltiples orígenes?/Orígenes diferenciales? Encendido durante el ciclo Existe una secuencia única? Experimentos con plásmidos Levaduras vs eucariotes superiores Replicación una vez por ciclo? Depende del ciclo celular? Inicio de la replicación en eucariotes Mas de 10 kpb En S. cerevisiae en promedio cada 30,000. En mamíferos se encuentran entre 100,000 a 250,000. La tasa de replicación es aprox. 2000bp/min. No todos los orígenes se activan al mismo tiempo Eucromatina se duplica primero, heterocromatina al final Ensayos para identificar secuencias que actúen como orígenes Inicio de la replicación en eucariontes :Saccharomyces cerevisiae ARS: Autonomously replicating sequence ATTTAATATTTTGGA % of origin function Mutaciones en A abaten la función. En B sólo se reduce ARS Proteínas ORC Origin recognition complex (ORC) complejo que se une a A y B1 Se encuentra unido durante todo el ciclo celular ORC 1-6 Cdc6 Cdt1 ORC 1-6 Orc 6 es estructuralmente relacionada a TFIIB Estructura y formación de la helicasa Mcm2-7 Traslocación 3´--5´ Pre-RC “licencia para replicar” Activación: eventos de fosforilación Complejo CMG: Cdc45-Mcm-GINS a través de Sld2 y Sld3 Iniciación Complejo CMG GINS Psf1 Psf2 Psf3 Sld5 + Cdc45+ MCM2-7 CMG Incrementan la actividad de la helicasa al inicio para abrir las cadenas y permanecen a lo largo de la elongación Control del inicio de la replicación a lo largo del ciclo celular Cdt1 CDK yDDK Cdt1 y geminina limitan la replicación del DNA Resumen de los puntos de control PCNA (Helicasa) (PCNA-like) MCM8 (primasa) Pol δ-cadena lagging Pol ε-cadena líder Polimerasas de eucariotes DNA polymerases undertake replica3on or repair DNA polymerase Func6on Structure α High fidelity replicases Nuclear replica6on Polimerasa-‐primasa 350kDa tetramer δ Nuclear replica6on Cadena discon6nua 250kDa tetramer ε Nuclear replica6on Cadena con6nua 350kDa tetramer γ Mitochondrial replica6on 200kDa dimer β High fidelity repair Base excision repair 39kDa monomer ζ Low fidelity repair Thymine dimer bypass Heteromer η Base damage repair Monomer ι Requiered in meiosis Monomer κ Dele6on and base subs6tu6on monomer Prolifera6ng Cell Nuclear An6gen PCNA ü Proteína 29kDa ü Incrementa procesividad de la DNA polimerasa ü Forma un homotrímero alrededor del DNA RFC: “ clamp loader” de PCNA Procesamiento de los fragmentos de Okazaki Terminación en eucariontes: El dilema de los cromosomas lineales Terminación en eucariones Telomerasa Telomerasa GGTTAG T-loop
