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Las enzimas como herramientas analíticas Dr. José Luis Cárdenas López Las enzimas como herramientas analíticas • Enzimas endógenas • Enzimas exógenas • Desarrollo de biosensores Enzimas exógenas usadas para monitorear calidad de pescado Enzima Medición Referencia 5’-Nucleotidasa, nucleosido K-value (Lou, 1998) Etanol en pescado (Gill, 1990) fosforliasa, xantina oxidasa Alcohol dehidrogenasa enlatado Diamina oxidasa, peroxidasa Histamina (Lopez-Sabater et al., 1993) ELISA Identificación de (Carrera, 1996) especies Glutamato dehidrogenasa Amoniaco (Huss, 1995) Octopina dehidrogenasa, piruvato Frescura de Scallops (Shin et al., 1998) ATPasa (Cheun et al., 1996) Putrescina oxidasa Poliaminas (Chemnitius et al., 1992) Trimetillamine dehidrogenasa Trimetilamina (Wong and Gill, 1987) Ureasa Urea (Sheppard et al., 1996) Xantina oxidasa Hipoxantina (Shen et al., 1996) oxidasa Purina nucleosido fosforilasa, xantina oxidasa Relacionadas con degradación de nucleótidos Análisis Hx Hx, Ino Principio · enzimas (xantina oxidasa, XO) inmovilizadas en una · simple de usar tira de ensayo · ensayo en tira, con enzimas inmovilizadas Ventajas · rápido · simple de usar fuera del laboratorio Desventajas · semicuantitativo · solamente puede medir Hx (estados finales del deterioro) Referencia Jahns et al. (1976) · rápido · simple de usar fuera del laboratorio · semicuantitativo Ehira et al.(1986) · baja reproducibilidad · limitado a Hx e Ino (estados finales del deterioro) IMP, Ino, Hx · enzima cubierta con electrodo de oxígeno · rápido · exacto · más complicado y Karube et al.(1984) consume más tiempo que la tecnología de la prueba mediante tira Indice-K · ensayo de enzima acoplado "KV-101 Medidor de Frescura" · rápido · resultados comparables a HPLC · deben adquirirse enzimas y reactivos · ¿costo? · disponible comercialmente de Orienta Electric, Niiza Saitama 352, Japón Indice-K · enzima cubierta con electrodo de oxígeno "Microfresh" · rápido · resultados comparables a HPLC · ¿costo? · disponible comercialmente de Pegasus Instruments, Agincourt, ON, Canadá Etanol • El etanol ha sido usado por muchos años como un indicador objetivo para la calidad de los productos pesqueros • Puede ser obtenido a partir de carbohidratos por fermentación anaeróbica (glucólisis), y/o deaminación y decarboxilación de aminoácidos como la alanina, es un metabolito común a una gran variedad de bacterias • Ha sido usado para medir objetivamente la calidad de una variedad de pescados, incluyendo atún enlatado • El medio más simple y confiable para medir etanol en el tejido de pescado es el uso del equipo para la prueba de enzima comercial, disponible de Boehringer Mannheim (Alemania) o de Diagnostic Chemicals (Charlottetown, P.E.I, Canadá) • La ventaja de emplear etanol como indicador de deterioro es su estabilidad al calor (a pesar de ser volátil) y puede ser usado para evaluar la calidad de productos pesqueros enlatados Las aminas biogénicas: histamina, putrescina y cadaverina NH2 N H2N-(CH2)n-NH2 n=4: Putrescine; n=5: Cadaverina N H u u u u Histamina Formada por la decarboxilación de histidina catalizada por las enzimas de los microorganismos Estimula la contracción y relajación del músculo liso Estimula neuronas sensoras y motoras Controla la secreción de ácidos gástricos u u Formada por la biodegradación de los aminoácidos ornitina y lisina por la acción de bacterias de putrefacción Sobresaturan las enzimas degradantes de la histamina, realzando el efecto tóxico de la histamina amina oxidasa de cobre (AO) Polímero Redox Activo u u u Fuentes biológicas : bacterias, hongos, plantas, animales Funciones biológicas: involucradas enc crecimiento celular, proliferación and diferenciación Cofactores: O a b N N H N O N N & HO (PVI13-dmeOs) Cu(II) N Os2+/ 3+ O Topa quinona (TPQ) N Cobre Reacción: R-CH2-NH2 + H2O + O2 → R-CHO + NH3 + H2O2 N Cl N Mecanismo de trabajo para los electrodos (monoenzimática) H N N H2 C C H2 NH2 Histamine Electrode AOox NH3 H2O H N AOred N C CHO H2 Imidazoleacetaldehyde 2e- Eappl.= +200 mV vs. Ag/AgCl Mecanismo de trabajo para los electrodos (BIenzimática) Electrode H N H2 N C C H2O H2 H2N Histamine NH3 H N N AOox (TOPA -native) H2O2 (Fe3+- H2O AOred (TOPA -inactive) HRPred native) HRPox (Fe4+ = 2e- 2 Os2+ 2 Os3+ O, P+ inactive) O2 OHC C H2 Imidazoleacetaldehyde Electrode type C Electrode type D No Os2+/3+ 2e- Eappl.= -50 mV vs. Ag/AgCl Muestras de pescado- (turbot) 30 g histamine/kg fish fish kept at -20°C fish kept at 25°C 25 20 15 10 5 0 0 2 4 6 8 10 12 Days •Contenido de histamina de pescado turbot en dos diferentes temperaturas (-20 y 25°C) analizado por el método de electródo bi-enzimático Oxidación del producto de la rx de histamina H2O + O2 H N AOred H2 C C H2 NH2 Histamine N NH3 + H2O2 H N Electrode AOox N C CHO H2 Imidazoleacetaldehyde H N N C COOH H2 Imidazoleacetic acid 2e- Eappl.= +200 mV vs. Ag/AgCl + NH3 NH2 AO + O2 + H2O O NH2 Putrescine + H2O2 + NH4+ - H2O Putrescina y cadaverina forman compuestos cíclicos - ¡no se pueden oxidar más! N 1-Pyrroline + NH3 NH2 Cadaverine AO + O2 + H2O O + H2O2 + NH4+ NH2 - H2O N 1-Piperideine ELISA para identificar especies Octopina deshidrogenasa para medir frescura en escalopas Ureasa (NH2)2CO + H2O → CO2 + 2NH3 • Usada para medir amoníaco • Amoníaco criterio de calidad microbiana (tardía) de PM • En A. clínicos la actividad de ureasa puede ser indicadora de muchas condiciones patológicas (piedras en vías urinarias, úlceras y males del hígado) Ureasa • Hay muchos métodos para inmovilizar ureasa y estimar la urea en muestras de pescado • Paper usando conjugado de fulereno-ureasa del 2013 en un electrodo potenciométrico – óptico[Kovacs, 2003], amperométric [Rajesh , 2005; Tiwari, 2009;Kuralai 2006 ], térmico[Fulton, 1980; Xie, 1996] conductométrico[Castillo-Ortega, 2002], and potenciométrico [Ahuja, 2008, 2011; Chen 2009] Lo cotidiano • Enzimas comerciales para medir algún atributo • Precio $$ y disponibilidad