Download Capítulo 1 Análisis bioquímico

Capítulo 1
Capítulo 1 Análisis bioquímico
Propósito
Maneja los materiales, instrumentos y equipo de laboratorio,
para realizar e instrumentar acciones de prevención, monitoreo
y control en actividades medioambientales, realizando análisis
de laboratorio de elementos físicos como; aire, agua y suelo
que conforman el medio ambiente.
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Capítulo 1
32
Capítulo 1
Introducción.
Este capítulo está orientado para proporcionar al alumno todos los
conceptos y definiciones básicas encaminados al conocimiento de las
biomoléculas y el agua desde un punto de vista bioquímico, así como
los niveles de estudio para su mejor comprensión, la descripción de las
principales características que la conforman, sus transformaciones, sus
cambios físicos y químicos, su nomenclatura y los métodos de identificación,
representación y cuantificación, en forma general para que el alumno vaya
adquiriendo los conocimientos necesarios en el desarrollo del módulo.
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Capítulo 1
34
Capítulo 1
Unidad 1 Análisis de las biomoléculas y el agua en
los procesos bioquímicos
1.1 RAP Identifica las características fundamentales de las
biomoléculas y bioelementos que conforman la célula para
interpretar los procesos bioquímicos
La palabra “bioquímico-(a)” se relaciona con la química de los procesos
vitales de organismos vivos.
La bioquímica es el estudio de las sustancias presentes en los organismos vivos y de las reacciones químicas en las que se basan los procesos
vitales.
Esta ciencia es una rama de la Química y de la Biología. El prefijo bioprocede de bios, término griego que significa “vida”. Su objetivo es el conocimiento de la estructura y comportamiento de las moléculas biológicas,
las cuales son compuestos de carbono que forman las diversas partes de
la célula y llevan a cabo las reacciones químicas que le permiten crecer,
alimentarse, reproducirse, usar y almacenar energía.
Los ácidos nucleicos son responsables del almacén y transferencia de
la información genética. Son moléculas grandes formadas por cadenas
largas de unas subunidades llamadas bases, que se disponen según una
secuencia exacta. Éstas, son “leídas” por otros componentes de las células
y utilizadas como patrones para la fabricación de proteínas.
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Capítulo 1
Los análisis bioquímicos inciden en diferentes áreas:
Determinación de agentes tóxicos en
sangre y orina. También para verificar
los electrolitos, especialmente los niveles de sodio, potasio y bicarbonato.
Para determinar una lesión en el riñón, se
realiza una ultrasonografía,
para localizar el bloqueo de la orina
y averiguar si la vejiga está vacía para
determinar el punto donde se presenta
la obstrucción. Un análisis bioquímico
del suero ayuda a determinar el grado
de lesión que se tenga.
Los productos bioquímicos son substancias químicas naturales creadas por
el cuerpo humano o de cualquier otro
animal o planta.
cional a las masas de los átomos
unidos.
2. Permiten a los átomos de carbono la posibilidad de formar esqueletos tridimensionales –C-C-C- para
formar compuestos con número variable de carbonos.
3. Permiten la formación de enlaces
múltiples (dobles y triples) entre C y
C, C y O, C y N, así como estructuras lineales ramificadas, cíclicas,
heterocíclicas, etc.
4. Permiten la posibilidad de que
con pocos elementos se de una
enorme variedad de grupos funcionales (alcoholes, aldehído, acetonas,
ácidos, aminas, etc.) con propiedades químicas y físicas diferentes.
Las biomoléculas se clasifican en inorgánicas y orgánicas:
Los estudios bioquímicos son los estudios de las substancias y procesos
químicos que tienen lugar en los seres 1.1.1 Biomoléculas inorgánicas
vivos.
Son biomoléculas no formadas por los
Las biomoléculas son las moléculas seres vivos, pero imprescindibles para
constituyentes de los seres vivos, las ellos, como el agua, la biomolécula más
cuales son: el carbono, hidrógeno, oxí- abundante; los gases (oxígeno, dióxido
geno y nitrógeno, representando alrede- de carbono) y las sales inorgánicas:
dor del 99% de la masa de la mayoría aniones como fosfato (HPO4−), bicarbonato (HCO3−) y cationes como el amode las células, Las cuales:
nio (NH4+).
1. Permiten la formación de enlaces
covalentes entre ellos, compartiendo
electrones, debido a su pequeña diferencia de electronegatividad. Estos
enlaces son muy estables; la fuerza
de enlace es directamente propor-
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Capítulo
Capítulo 11
1.2 RAP* Conocer las biomoléculas orgánicas o principios
inmediatos.
Son sintetizadas solamente por los seres vivos y tienen
una estructura con base en carbono. Están constituidas
principalmente por carbono, hidrógeno y oxígeno, y con
frecuencia están también presentes nitrógeno, fósforo y
azufre; otros elementos son a veces incorporados, pero en
mucha menor proporción.
Las biomoléculas orgánicas pueden se clasifican en cuatro
grandes tipos:
a) Glúcidos (hidratos de carbono o carbohidratos)
b) Lípidos
c) Proteínas
d) Ácidos Nucleicos
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Capítulo 13
Figura 1. Clasificación general de las biomoléculas. Las biomoléculas se clasifican, principalmente en inorgánicas y orgánicas, el grupo de las biomoléculas orgánicas esta comprendido principalmente por hidratos de carbono, proteínas y ácidos nucleicos.
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Capítulo
Capítulo 3
1
1.2.1
Glúcidos
carbohidratos)
(hidratos
de
carbono
o
Los carbohidratos son la fuente de energía primaria
utilizada por los seres vivos para realizar sus funciones
vitales; la glucosa está al principio de una de las rutas
metabólicas productoras de energía más antigua, la
glucólisis, usada en todos los niveles evolutivos, desde
las bacterias a los vertebrados. La mayoría de los
organismos, especialmente los de estirpe vegetal (algas,
plantas) almacenan sus reservas en forma de almidón.
Algunos glúcidos forman importantes estructuras
esqueléticas, como la celulosa, constituyente de la
pared celular vegetal, o la quitina, que forma la cutícula
de los artrópodos.
Los hidratos de carbono comprenden un grupo amplio de
compuestos naturales que se dividen en monosacáridos,
oligosacáridos y polisacáridos. Los
monosacáridos,
según el número de átomos de carbono en la
molécula, se clasifican en triosas, tetrosas, pentosas,
hexosas, heptosas, etc. La fórmula genérica de los
monosacáridos es CnH2nOn. Todos los monosacáridos
naturales, teniendo en sus moléculas átomos de
carbono asimétricos, son ópticamente activos y giran
en el plano de la luz polarizada. Los oligosacáridos y
polisacáridos son hidratos de carbono complejos y al
ser calentados con ácidos diluidos o hidrolizados por
enzimas, se desintegran en monosacáridos.
Los monosacáridos son los azúcares más sencillos,
pues no pueden descomponerse por hidrólisis para dar
lugar a otros azúcares más simples. En la naturaleza se
encuentran en estado libre, desempeñando importantes
funciones. Los monosacáridos naturales tienen entre
tres y ocho átomos de carbono, aunque los de siete y
ocho son relativamente raros.
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Capítulo 1
Figura 2. Monosacáridos más abundantes en la naturaleza. La glucosa, galactosa y fructosa son los monosacáridos más abundantes en la naturaleza, se encuentran en estado
libre y desempeñan diversas funciones, siendo estos los principales reactivos metabólicos.
Disacáridos Figura 3. Disacáridos más abundantes en la naturaleza. Los disacáridos o azúcares dobles, están formados por la condensación (unión) de dos monosacáridos iguales o distintos
mediante un enlace O-glucosídico (con pérdida de una molécula de agua). Los disacáridos
más comunes son la sacarosa, lactosa y maltosa.
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Capítulo 1
1.3 RAP Conocer los lípidos
Los lípidos son moléculas orgánicas, la mayoría biomoléculas, compuestas por carbono e hidrógeno y en
menor medida oxígeno, aunque pueden contener fósforo, azufre y nitrógeno, que tienen como característica
principal ser hidrofóbicas o insolubles en agua y sí en
disolventes orgánicos como la bencina, el alcohol, el
benceno y el cloroformo. En el uso común, a los lípidos
se les llama erróneamente grasas, ya que son sólo un
tipo de lípidos procedentes de animales.
Los lípidos cumplen funciones diversas en los organismos vivos:
• La de reserva energética (triglicéridos).
• La estructural (fosfolípidos de las bicapas).
• La hormonal (esteroides, prostaglandinas).
Los lípidos son un grupo muy heterogéneo de moléculas que usualmente se clasifican en tres grupos
simples, complejos y asociados.
Figura 4. Clasificación÷on de los lípidos
1.3.1 Los ácidos grasos
Los ácidos grasos están formados por cadenas hidrocarbonadas, que tienen un
número par de carbonos (entre 4 y 22 átomos) y un grupo carboxilo en uno
de los extremos.
Los ácidos grasos pueden ser saturados o insaturados. En los primeros, los
átomos de carbono de la cadena están unidos mediante enlaces simples; en
cambio, en los insaturados la cadena presenta dobles enlaces entre carbonos.
Las principales funciones biológicas de los ácidos grasos son:
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Capítulo 1
• Constituyentes de moléculas más grandes, como por ejemplo: grasas,
fosfolípidos, etc.
• Son combustibles celulares de elección.
Figura 5.
Algunos ácidos grasos de importancia biológica.
Los ácidos grasos pueden ser saturados (Esteárico) o insaturados
(Oleico). En los primeros, los átomos de carbono de la cadena están unidos mediante enlaces simples; en cambio, en los insaturados
la cadena presenta dobles enlaces entre carbonos.
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Capítulo 1
1.3.2 Grasas neutras
Una grasa neutra está compuesta por una molécula de glicerol unida a
uno, dos o tres ácidos grasos. El glicerol es un alcohol de tres carbonos.
En temperatura ambiente, estos lípidos pueden convertirse en líquidos o
sólidos, dependiendo del largo de las cadenas de ácidos grasos y si están
saturados o no..
Entre más saturados y largos sean los ácidos grasos de una grasa neutra,
podrán apachurrarse e interactuar mejor, determinando la formación de
un compuesto sólido a la temperatura ambiente, a los que vulgarmente
llamamos grasas.
Figura 6.
Fórmula de un triacilglicérido. Una grasa neutra con-
siste en una molécula de glicerol unida a uno, dos o tres ácidos
grasos
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Capítulo 1
1.3.3 Lípidos complejos
Los fosfolípidos poseen una molécula de glicerol unida
a dos ácidos grasos y un ácido fosfórico; también el
grupo fosfato puede llevar unida
una molécula de
naturaleza variable, a la que llamamos resto (R); por
ejemplo, un alcohol.
Figura 7.
Esquema de un fosfolípido.
Los fosfolípidos están compuestos por una
cabeza polar hidrofílica y dos colas de ácidos grasos.
1.3.4 Lípidos asociados
Los esteroides un tipo de lípidos
asociados, están formados básicamente, por un esqueleto carbonado
de cuatro ciclos llamado Ciclopentanoperhidrofenantreno, formado a
su vez por la repetición de muchos
isoprenos.
Figura 8.
Fórmula del colesterol. El colesterol es el esteroide
más conocido, a su vez es precursor de muchos esteroides como
las hormonas sexuales (Progesterona, estrógenos, testosterona).
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Capítulo 1
1.4 RAP Conocer las proteínas
Las proteínas son macromoléculas formadas por cadenas
lineales de aminoácidos unidos por un enlace peptídico.
Son el tipo de biomoléculas que más diversidad de funciones realizan en los seres vivos; prácticamente todos
los procesos biológicos dependen de su presencia y/o
actividad.
Dentro de la enorme cantidad de funciones que realizan
destacan las siguientes:
• estructural (colágeno y queratina),
• reguladora (insulina y hormona del crecimiento),
• transportadora (hemoglobina),
• defensiva (anticuerpos),
• enzimática,
• contráctil (actina y miosina)
1.4.1 Clasificación de las proteínas
Las proteínas pueden clasificarse, basándose en su:
• Composición (simples y conjugadas)
• Forma (globulares y fibrosas)
• Por su valor nutricional (completas e incompletas)
Según su composición, las proteínas se clasifican en:
Proteínas Simples: Son aquellas que por hidrólisis, producen solamente aminoácidos.
Proteínas Conjugadas: Son aquellas que por hidrólisis,
producen aminoácidos y conjuntamente una serie de compuestos orgánicos e inorgánicos llamados grupos prostéticos.
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Capítulo 1
Basada en la forma de las proteínas:
Proteínas globulares (esferoproteínas): Son proteínas principalmente de forma
esférica, tienen función metabólica: catálisis, transporte, regulación, protección. Estas funciones requieren solubilidad en la sangre y en otros medios
acuosos de células y tejidos. Ejemplos de estas proteínas son la Hemoglobina,
las enzimas, etc.
Proteínas fibrosas (escleroproteínas): Son insolubles en agua y forman estructuras alargadas. Se añaden fuertemente formando fibras o láminas. La mayor
parte desempeñan un papel estructural y/o mecánico. Ejemplos de estas proteínas son la queratina y el colágeno
Basada en la composición:
Proteínas Simples: Formadas solamente por aminoácidos que forman cadenas
peptídicas.
Proteínas conjugadas: Formadas por aminoácidos y por un compuesto no
peptídico. En estas proteínas, la porción polipeptídica se denomina apoproteína y la parte no proteica se denomina grupo prostético.
De acuerdo con el tipo de grupo prostético, las proteínas conjugadas pueden
clasificarse a su vez en:
• nucleoproteínas
• glicoproteínas
• flavoproteínas
• hemoproteínas
De acuerdo con su valor nutricional, las proteínas pueden clasificarse en:
Completas: Proteínas que contienen todos los aminoácidos esenciales. Generalmente provienen de fuentes animales.
Incompletas: Proteínas que carecen de uno o más de los aminoácidos esenciales. Generalmente son de origen vegetal
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Capítulo 1
1.4.2 Estructura de las proteínas
La estructura de las proteínas está dada por un conjunto
de propiedades espaciales derivadas de su secuencia de
aminoácidos, las características físicas de su entorno y la
presencia de compuestos que las estabilicen y/o conduzcan a un plegamiento específico, distinto del espontáneo.
La estructura de las proteínas puede jerarquizarse en una
serie de niveles, interdependientes. Estos niveles corresponden a:
• Estructura primaria, que corresponde a la secuencia de
aminoácidos.
• Estructura secundaria, que provoca la aparición de motivos estructurales.
• Estructura terciaria, que define la estructura de las proteínas compuestas por un sólo polipéptido.
• Estructura cuaternaria, interviene más de un polipéptido.
Figura 9. Niveles de organización de las
proteínas.
Las proteínas presentan diversos
niveles de estructuración, desde la secuencia
de aminoácidos hasta la conformación con
varias cadenas.
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Capítulo 1
1.5 RAP Conocer loa ácidos nucleicos
Los ácidos nucleicos son las biomoléculas portadoras de la información
genética. Su estructura polimérica, lineal, cuyos monómeros son los
nucleótidos, unidos mediante enlaces fosfodiéster. Se crean así, largas
cadenas o polinucleótidos, lo que hace que algunas de estas moléculas
lleguen a alcanzar tamaños gigantes (de millones de nucleótidos de largo).
Los ácidos nucleicos, ADN y ARN, desempeñan una de las funciones más
importantes para la vida, la cual es contener de manera codificada, las
instrucciones necesarias para el desarrollo y funcionamiento de la célula.
1.5.1 Estructura de los ácidos nucleicos
En 1953, los científicos Francis Crick y James Watson publicaron en un
célebre artículo la primera descripción de la estructura del ADN.
Los ácidos nucleicos consisten en una cadena formada por subunidades
de nucleótidos, las cuales contienen:
• Un azúcar de cinco carbonos, sea la ribosa o la desoxirribosa
• Un grupo fosfato
• Una base nitrogenada (púricas o pirimidinas), que es un compuesto
anular que contiene nitrógeno.
Las bases púricas son la adenina (A) y guanina (G) y las pirimidinas son
la citosina (C), timina (T) y uracilo (U)
El ADN consiste en una molécula de dos cadenas de nucleótidos,
enrolladas una alrededor de la otra en una doble hélice; contiene las
purinas adenina y guanina y las pirimidinas citosina y timina, y el azúcar
desoxirribosa y el grupo fosfato.
Las bases de ambas cadenas están unas frente a otras y se unen a través
de puentes¬de hidrógeno: dos entre la adenina y la timina (A=T) y tres
entre la guanina y la citosina (G ≡ C).
El ARN difiere del ADN en que el azúcar de los nucleótidos constituyentes
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Capítulo 1
es ribosa en lugar de desoxirribosa,
y en vez de las cuatro bases A, G,
C, T aparece A, G, C, U (es decir,
uracilo en lugar de timina).
Mientras que el ADN contiene la
información, el ARN expresa dicha
información,
pasando
de
una
secuencia lineal de nucleótidos, a
una secuencia lineal de aminoácidos
en una proteína. Para expresar dicha
información se necesitan varias
etapas y en consecuencia existen
varios tipos de ARN:
para llegar a la síntesis de una
cadena polipeptídica determinada y
por lo tanto, a la síntesis de una
proteína.
El ARN ribosómico (rRNA) es el más
abundante (80% de todo el ARN), se
encuentra en los ribosomas y forma
parte de ellos, aunque también
existen proteínas ribosómicas. El
ARN ribosómico recién sintetizado es
empaquetado inmediatamente con
proteínas ribosómicas, dando lugar
a las subunidades del ribosoma.
El ARN mensajero (mRNA) se sintetiza
en el núcleo de la célula siendo su
secuencia de bases complementaria
de un fragmento de una de las
cadenas de ADN. Actúa como
intermediario en el traslado de la
información genética desde el núcleo
hasta el citoplasma. Poco después
de su síntesis, sale del núcleo a
través de los poros nucleares,
asociándose
a
los
ribosomas
donde actúa como matriz o molde
que ordena los aminoácidos en la
cadena proteica. Su vida es muy
corta: una vez cumplida su misión,
se destruye.
El ARN de transferencia (tRNA): Son
moléculas relativamente pequeñas. Su
función es la de captar aminoácidos
en el citoplasma, uniéndose a
ellos y transportándolos hasta los
ribosomas, colocándolos en el lugar
adecuado que indica la secuencia
de nucleótidos del ARN mensajero
Figura 10. Molécula de DNA.
La es-
Figura 11 se representa es-
tructura de DNA está compuesta por dos
quemáticamente la estructura
hembras antiparalelas, Las bases de ambas
molecular del ADN.
cadenas están unas frente a otras y se
unen a través de puentes de hidrógeno:
dos entre la adenina y la timina (A=T) y
tres entre la guanina y la citosina (G ≡ C).
49
Capítulo 1
1.6 RAP Conocer el agua
Nombre común que se aplica al estado líquido del compuesto de hidrógeno y oxígeno. Los filósofos consideraban el agua como un elemento básico que representaba a las sustancias líquidas.
En un documento científico presentado en 1804, el químico francés Joseph Louis Gay-Lussac y el
naturalista alemán Alexander von Humboldt demostraron que el agua consistía en dos partículas
de hidrógeno y una de oxígeno, tal como se expresa en la fórmula actual H2O.
1.6.1 Propiedades fÍsico-químicas del agua
1) Estado físico: sólida, líquida y gaseosa
2) Color: incolora
3) Sabor: insípida
4) Olor: inodoro
5) Densidad: 1 g./c.c. a 4°C
6) Punto de congelación: 0°C
7) Punto de ebullición: 100°C
8) Presión crítica: 217,5 atm.
9) Temperatura crítica: 374°C
11) Reacciona con los anhídridos de
azufre, nitrógeno, carbono, …
produciendo ácidos.
12) Con los metales alcalinos el agua reacciona
formando hidróxidos cuyas soluciones tienen
un pH superior al 7.
13) El agua disuelve las sales electrolíticas, separándolas en sus iones al estar disueltas (13)
Algunas sales se hidratan formando compuestos más estables como por ejemplo el
sulfato de calcio dihidratado y el sulfato de
cobre pentahidratado.
14) El agua reacciona con algunos compuestos
llevando a cabo el proceso de hidrólisis.
Todos los organismos que se encuentran en el agua son importantes en el momento de utilizarla,
sin considerar si tienen su medio natural de vida en el agua o pertenecen a poblaciones transitorias
introducidas por el ser humano; si su crecimiento lo propician los nutrientes presentes en el infiltración natural y en aguas residuales municipales o lo frenan los venenos procedentes de la actividad
agrícola o industrial, y si tienen capacidad para intoxicar a las personas y a los animales superiores.
1.6.2 Principales funciones del agua
1. Función de Disolvente de Sustancias: Es básica para la vida, ya que casi todas las reacciones
biológicas tienen lugar en medio acuoso.
2. Función Bioquímica: El agua interviene en muchas reacciones, por ejemplo, en las hidrólisis
que se dan durante la digestión de los alimentos.
50
Capítulo 1
3. Función de Transporte: De sustancias desde al exterior al interior
del organismo.
4. Función Estructural: Por ejemplo, en células que no tienen una membrana
rígida, su forma y volumen se mantienen gracias a la presión que ejerce el
agua interna.
5. Función Mecánica Amortiguadora: Por ejemplo, los vertebrados poseen
en sus articulaciones bolsas de líquido sinovial que evita el roce entre los
huesos...
6. Función Termorreguladora: Debida a su elevado calor específico y a su
elevado calor de vaporización. Por ejemplo, los animales al sudar, expulsan
agua, la cual, para evaporarse, toma calor del cuerpo, y como consecuencia
éste se enfría.
7. Función Termoaislante: Los parámetros biológicos en las aguas potables
son de mucho interés. La normativa recoge una serie de análisis microbiológicos, según se efectúe sobre las aguas un análisis mínimo, coliformes
totales y fecales; hongos y levaduras, así como mesófilos aerobios, bacterias aerobias a 37ºC, estreptococos fecales, clostridios y microorganismos
parásitos y/o patógenos.
Figura 11. Estructura molecular del agua. La estructura del agua forma un ángulo de
104.5 º y se crean dos zonas parcialmente cargadas, es decir, un dipolo con carga
neta igual a cero.
51
Capítulo 1
Práctica 1
Identificación de Proteínas y carbohidratos
Reacción de Ninhidrina
Tiene como objetivo detectar y cuantificar cantidades de aminoácidos
libres. Los aminoácidos, en general reaccionan con la ninhidrina (hidrato
de
hicelohidrandeno) cuando son calentados con un exceso de la misma.
Todos los aminoácidos que poseen un grupo amino libre reaccionan y
forman dióxido de carbono, amoníaco y un aldehído que contiene un átomo
de carbono menos que el compuesto original. Esta reacción da lugar a la
formación de un producto color azul o púrpura (que posteriormente puede
ser utilizado para cuantificar el aminoácido).
C 27,06 / M 100 / Y 100 / N 27,84
Equipo y material
REACTIVOS
C 19,61 / M 10,98 / Y 19,61 / N 0
PROCEDIMIENTO
- Solución de ovoalbúmina • Se toman y rotulan tres tubos de
- Plato caliente
10% (diluir 10 gramos en ensayo diferentes (1, 2 y 3).
- Termómetro
C
44,71
/
M
41,96
/ Y 100 / N 16,86 • En cada uno de ellos se depositan
100 mL)
- Tubos de ensayo
- Solución de glucosa al 2 mL de solución de ovoalbúmina
- Probetas de 10 mL
1 % / Y 34,51 / N 10,2 10%, glucosa al 1 % y agua
- Vasos de precipitado
C 69,02 / 50,
M 53,73
- Reactivo de Ninhidrina
500 mL
destilada, respectivamente.
- Reactivo de Molisch
- Goteros
• Luego se añaden 5 gotas del
- Gradillas C 100 / M 90,98 / Y 32,55 / N 22,35 reactivo de ninhidrina y se colocan
- Pinzas para tubos de
los tubos en un baño de María a
ensayo
100° C por 1 minuto.
• Deja enfriar.
• Realiza una tabla y anota los
resultados.
52
Capítulo 1
Práctica 2
Identificación de carbohidratos
Reacción de Molisch
La presencia de carbohidratos en una muestra se pone
de manifiesto por la reacción de Molisch, que en cierto
punto es la reacción universal para cualquier carbohidrato.
Se basa en la acción hidrolizante y deshidratante del
ácido sulfúrico sobre los hidratos de carbono. En dicha
reacción, el ácido sulfúrico cataliza la hidrólisis de los
enlaces de la muestra y la deshidratación a furfural
(en las pentosas) o hidroximetilfurfural (en las hexosas).
Estos furfurales se condensan con el alfa naftol del
27,06(reacción
/ M 100de/ YMolisch),
100 / Ndando
27,84un
reactivo de CMolisch
producto coloreado.
C 19,61 / M 10,98 / Y 19,61 / N 0
Procedimiento
C 44,71 / M 41,96 / Y 100 / N 16,86
C
C
• Se toman y rotulan tres
tubos de ensayo
diferentes (1,2 y 3).
69,02 / M 53,73 / Y 34,51
N 10,2
• En /cada
uno de ellos se depositan 2 mL de las
distintas soluciones de solución de ovoalbúmina
10%, glucosa al 1 % y agua destilada
100 / M 90,98 / Y 32,55
/ N 22,35
• Agrega dos gotas de reactivo de Molisch y mezcla
bien. Luego inclina el tubo y deposita 1 mL de H2SO4
concentrado deslizándolo lentamente por la pared del
tubo. No mezcles. Sólo coloca el tubo en posición
vertical y observa la formación del anillo rojo violeta
que aparece en la zona de contacto de los dos líquidos.
•Anota los resultados obtenidos de esta práctica
- Anota los resultados en una tabla al final del
formato de práctica.
53
Capítulo 1
Práctica 3
Solubilidad de las grasas
Los lípidos desempeñan un papel muy importante en calidad de
componentes estructurales de las membranas celulares, como fuente de
energía, disolvente para las sustancias orgánicas y como precursores de
otros componentes de la célula (vitaminas del grupo D, ácidos biliares y
hormonas de naturaleza de esteroides).
Se denominan lípidos un grupo numeroso de sustancias constituidas como
los ésteres y caracterizadas por su solubilidad en disolventes orgánicos y
por su insolubilidad en agua. A ellos pertenecen los glicéridos (grasas), las
ceras, los esteroles (estearinas), fosfolípidos y glicolípidos (cerebrosidos,
gangliósidos).
Equipo y material
C 27,06 / M 100 / Y 100 / N 27,84
C
•En cuatro tubos de ensayo se
N 0 vierten de 5 a 7 gotas de aceite
de girasol.
•En el primer tubo se añaden 2
100 / N 16,86 ml de agua, en el segundo 2 ml
de alcohol, en el tercero 2 ml de
34,51 / N 10,2 benceno y en el cuarto 2 ml de
cloroformo, mezcla en los tubos de
ensayo y agita enérgicamente.
- Tubos de ensayo
- Gradillas
19,61
/ M 10,98 / Y 19,61 /
- Pinzas para tubos de ensayo
C 44,71
/ M 41,96 / Y
REACTIVOS
- Aceite de girasol
C 69,02
/ M 53,73 / Y
C
Procedimiento
- Alcohol etílico
- Benceno
100- /Cloroformo
M 90,98 / Y
32,55 / N 22,35
Respuesta
Se observan los siguientes cambios: en el primer tubo se forma una emulsión inestable que se separa rápidamente; en el segundo una disolución
turbia, que indica la mala solubilidad del aceite en alcohol; en el tercero
y el cuarto tubos de ensayo, se forman disoluciones transparentes debido
a una buena solubilidad del aceite en benceno y cloroformo.
Verifica tus respuestas con el manual.
54
Capítulo 1
Normas generales de seguridad e higiene dentro del
laboratorio
Con base en las NOM todo laboratorio de análisis ambiental debe realizar su reglamento y todas las personas
que laboran en él tienen la obligación de cumplirlo. Algunos de los lineamentos que deben incluirse en dicho
reglamento son:
2.
Antes de
empezar
el trabajo en
el laboratorio
tienes que
familiarizarte con
los elementos
de seguridad
disponibles.
4.
3.
1.
El uso de bata es
obligatorio.
Es necesario
localizar las
salidas principales y
de emergencia por
si se diese el caso
de una evacuación
por fuego o por
cualquier otro
incidente, así
como conocer la
localización exacta
de extintores,
duchas de
seguridad y duchas
de ojos.
Es
obligatorio
usar gafas
de seguridad
siempre que
se esté en el
laboratorio.
55
Capítulo 1
5.
No usar lentes
de contacto en el
laboratorio, ya que en caso
de accidente las salpicaduras
de productos químicos o sus
vapores pueden pasar detrás
de las lentes y provocar
lesiones en los ojos antes de
poder retirar las lentes. En
estos casos es recomendable
el uso de gafas graduadas
o de gafas de seguridad
cerradas.
7.
Asimismo, se recomienda
llevar zapatos cerrados
y no sandalias.
8.
6.
Si un producto químico te salpica
los ojos, utiliza inmediatamente una
ducha de ojos y lava completamente
el ojo afectado durante 15 minutos sin
interrupción. Actúa siempre con urgencia,
en menos de 10 segundos. No dirijas una
corriente de alta presión de agua de un
grifo directamente al ojo porque podrías
lesionarlo. Informa al encargado del
laboratorio de lo que ha sucedido y si es
necesario pide asistencia médica.
No comer ni beber en
el laboratorio, ya que
hay la posibilidad de que
los alimentos o bebidas
se hayan contaminado con
productos químicos.
56
Capítulo 1
10
. Cierra
herméticamente los
frascos de productos
químicos después de
utilizarlos.
9.
No inhales,
pruebes o
huelas productos
químicos
si no estás
debidamente
informado.
11
. Para
pipetear
los líquidos
utiliza siempre
una bombilla
pipeteadora,
no absorber
directamente
con la boca.
12
. Cuando calientes tubos de
ensaye hazlo siempre en la
parte superior del líquido y con
agitación suave, nunca por el fondo
del tubo, y debe estar inclinado y
no apuntar hacia ninguna persona.
57
Capítulo 1
58
Capítulo 1
Unidad 2 Determinación de las características
estructurales y funcionales de los aminoácidos,
proteínas y enzimas en los procesos bioquímicos
2.1 RAP Determina las características estructurales y
funcionales de los aminoácidos y proteínas mediante
pruebas analíticas para interpretar su comportamiento en
seres vivos y en procesos bioquímicos industriales
En 1838, el químico holandés Gerrit Jan Mulder dio el nombre de
proteínas a las sustancias que contenían nitrógeno. Las proteínas están
formadas por aminoácidos. Los aminoácidos, metafóricamente, son
representados como ladrillos que forman una pared. En esta segunda
unidad pretendemos abordar desde un punto de vista más molecular las
principales características estructurales de los aminoácidos, las proteínas y
enzimas, así como su participación en los diversos procesos bioquímicos.
2.1.1 Estructura de los aminoácidos
La gran cantidad de proteínas que se conocen están formadas únicamente
por 20 aminoácidos diferentes. Los aminoácidos son moléculas orgánicas
pequeñas con un grupo amino (NH2) y un grupo carboxilo (COOH). Se
conocen otros 150 aminoácidos que no forman parte de las proteínas.
La estructura general de un aminoácido se establece por la presencia de
un carbono central alfa unido a: un grupo carboxilo, un grupo amino, un
hidrógeno y un grupo R o cadena lateral específica para cada aminoácido.
Figura 12. Estructura básica de un aminoácido. Los aminoácidos están compuestos por
un carbono alfa al que están unidos un grupo
amino, un grupo carboxilo, un hidrógeno y un
grupo R que es específico para cada aminoácido.
59
Capítulo 1
Técnicamente hablando, se les denomina alfa-aminoácidos, debido a que el grupo amino (–NH2) se encuentra a
un átomo de distancia del grupo carboxilo (–COOH). Sin
embargo, existe un aminoácido denominado prolina, que
en realidad no es un alfa-aminoácido, pues el carbono adyacente al de la función carboxilo posee un grupo imino (=
NH); la prolina es, en términos estrictos, un iminoácido.
Figura 12. Estructura del aminoácido prolina. La cadena lateral de
la prolina está unida, tanto al átomo de carbono adyacente al grupo
carboxilo, como al átomo de nitrógeno. Esto da lugar a una molécula
anular, que hace que la prolina tenga una conformación relativamente
rígida.
En todos los aminoácidos, los
grupos funcionales poseen H en
sus estructuras químicas, lo cual
los hace susceptibles a los cambios
de pH; por eso, al pH de la célula
prácticamente ningún aminoácido
se encuentra de esa forma, sino
que se encuentra ionizado.
Los aminoácidos a pH bajo (ácido)
se
encuentran
mayoritariamente
en su forma catiónica (con carga
positiva), y a pH alto (básico) se
encuentran en su forma aniónica
(con carga negativa). Sin embargo,
existe un pH específico para
cada aminoácido, donde la carga
positiva y la carga negativa son de
la misma magnitud y el conjunto
de la molécula es eléctricamente
neutro. En este estado se dice que
el aminoácido se encuentra en su
forma de ion dipolar o zwitterión.
60
Figura 13. Las tres formas posibles de un aminoácido. Los
aminoácidos a pH bajo (ácido) se encuentran mayoritariamente en
su forma catiónica (con carga positiva), y a pH alto (básico) se
encuentran en su forma aniónica (con carga negativa).
Capítulo 1
2.1.2 Clasificación de los aminoácidos
Existen muchas formas de clasificar los aminoácidos; las dos formas que se
presentan a continuación son las más comunes.
Aminoácidos no esenciales: Pueden ser sintetizados por nuestro hígado a
partir de otras sustancias.
Aminoácidos esenciales: No pueden ser sintetizados por nuestro organismo
o lo hacen a una velocidad insuficiente, tienen que venir obligatoriamente
aportados por la dieta, en nuestro caso, comiendo alimentos proteicos, los
cuales, contienen todo el conjunto de los aminoácidos que nuestro organismo no puede sintetizar.
Los aminoácidos ingeridos en la alimentación, han de ser metabolizados y
transformados en el organismo para facilitar su digestión. Para ello, los procesos de digestión y absorción permiten que mediante la acción de enzimas
proteolíticas, las proteínas se hidrolicen liberando los aminoácidos que las
forman y que estos se asimilen a través de las microvellosidades de las células
intestinales.
Este proceso, representa la intervención de un conjunto de partes del organismo
en donde se producen o se utilizan enzimas que regulan todo el proceso de digestión. Así pues, en el estómago, la acción de la pepsina gástrica permite que
las proteínas se hidrolicen a polipéctidos, oligopéptidos y pequeñas fracciones
de aminoácidos. El páncreas, libera proteasas pancreáticas que permiten la
formación del 30 % de los oligopéptidos y el 70% de los aminoácidos. Las células intestinales, mediante aminopeptidasas, catalizan la hidrólisis de péptidos
que contienen un pequeño número de aminoácidos, los cuales se hidrolizan en
el citoplasma de la célula mediante la acción de peptidasas intracelulares.
Para que este proceso aporte el máximo rendimiento, es necesario que exista
una buena actividad hepática y pancreática, así como digestiva. Ello facilita
que el organismo asimile todo el conjunto de aminoácidos, los cuales pasan al
interior de la célula mediante diferentes mecanismos fisiológicos.
La otra clasificación de los aminoácidos es de acuerdo con su grupo R: Esta
clasificación se basa principalmente en las características de físico-químicas
del componente de la cadena lateral de cada aminoácido, lo que confiere
propiedades únicas; aunque existen diversas clasificaciones de este tipo, la
principal los divide en aminoácidos no polares, polares y neutros.
61
Capítulo 1
Figura 14. Clasificación de los aminoácidos de acuerdo con su grupo
R. Los aminoácidos se clasifican principalmente en No polares, Polares
y Neutros.
2.1.3 Principales Propiedades físico-químicas de los aminoácidos
• Ácido-básicas.
Se da con el comportamiento de cualquier aminoácido cuando se ioniza. Cualquier aminoácido puede comportarse como ácido y como base; se denominan
sustancias anfóteras.
Cuando una molécula presenta carga neta cero, está en su punto isoeléctrico.
Si un aminoácido tiene un punto isoeléctrico de 6,1 su carga neta será cero
cuando el pH sea 6,1. Todos los grupos ionizables tienen un pk, de manera que
en ese pH se dan cantidades equimolares de ambas formas.
En disolución acuosa, los grupos ionizables de los aminoácidos permiten que
la molécula ceda o capte hidrogeniones, según el pH del medio, al igual que
ocurre con todos los ácidos y bases débiles.
62
Capítulo 1
• Cuando en el medio abundan los hidrogeniones (pH ácido), la molécula
del aminoácido tiende a captarlos, y queda cargada positivamente.
• Por el contrario, a pH básico (cuando escasean los hidrogeniones), el
aminoácido tiende a liberarlos y queda cargado negativamente.
• Para cada aminoácido existe un pH en el cual las cargas positiva y negativa
están exactamente equilibradas, por lo que la carga neta de la molécula
es cero. Este pH se le llama isoeléctrico o punto isoeléctrico del aminoácido.
• Cada grupo disociable de un aminoácido tiene un pK característico.
Conocido el pK, se puede estimar la proporción de moléculas disociadas
y no disociadas a un pH cualquiera, aplicando la ecuación de HendersonHasselbalch.
El pH isoeléctrico puede obtenerse promediando los valores de pK’s que
delimitan la forma ± o zwitterión.
Todos los aminoácidos presentan en solución acuosa propiedades, tanto ácido
como base; los grupos ionizables son los siguientes:
Figura 15. Comportamiento de cualquier aminoácido cuando se ioniza. Para cada aminoácido existe un pH en el cual las cargas positiva y negativa están exactamente equilibradas, por
lo que la carga neta de la molécula es cero. Este pH se le llama isoeléctrico o punto isoeléctrico
del aminoácido.
63
Capítulo 1
Ópticas
Todos los aminoácidos excepto la glicina, tienen el carbono alfa asimétrico, lo
que les confiere actividad óptica; esto es, sus disoluciones desvían el plano de
polarización cuando un rayo de luz polarizada las atraviesa.
Cuando los cuatro sustituyentes sobre el carbono central son diferentes se
dice que el carbono es asimétrico y permite la existencia de isómeros ópticos.
Si el desvío del plano de polarización es hacia la derecha (en sentido de las
manecillas del reloj), el compuesto se denomina dextrógiro, mientras que si se
desvía a la izquierda se denomina levógiro.
Un aminoácido puede en principio existir en sus dos formas enantioméricas
(una dextrógira y otra levógira), pero en la naturaleza lo habitual es encontrar
sólo una de ellas.
Estructuralmente, las dos posibles formas enantioméricas de cada aminoácido
se denominan configuración D o L dependiendo de la orientación relativa en el
espacio de los 4 grupos distintos unidos al carbono alfa. Las configuraciones
D y L no tienen nada que ver con la polarización de la luz.
Son dos las posibles disposiciones de los átomos enlazados al carbono (central) en los aminoácidos, aunque solamente la estructura L, se encuentra en las
moléculas proteicas. Sin embargo, los D-aminoácidos se encuentran naturalmente en antibióticos y paredes celulares de bacterias.
Figura 16. Las dos posibles formas enantioméricas de un aminoácido. Se denominan de
configuración D o L dependiendo de la orientación relativa en el espacio de los 4 grupos distintos
unidos al carbono alfa. Las configuraciones D y L no tienen nada que ver con la polarización
de la luz.
64
Capítulo 1
Químicas
Las que afectan al grupo carboxilo, como la descarboxilación.
Las que afectan al grupo amino, como la transaminación.
Las que afectan al grupo R.
2.1.4 Reacciones de descarboxilación
La descarboxilación es una reacción química en la cual un grupo carboxilo es
eliminado de un compuesto en forma de dióxido de carbono (CO2).
Los aminoácidos más frecuentemente descarboxilados son la histidina, la tirosina, la arginina, la lisina, el triptófano y el glutamato.
El interés de esta reacción es suprimir el grupo carboxilo (- COOH) del producto tras haber sido útil en un intermedio de la síntesis de un aminoácido. Esto
puede llevarse a cabo fácilmente a determinad temperatura la cual depende
del grupo R unido al carboxilo La descarboxilación es una reacción metabólica
fundamental durante la oxidación de moléculas orgánicas, catalizada por enzimas de tipo descarboxilasa. El mecanismo de la reacción es diferente.
Figura 17. Reacción de descarboxilación de un aminoácido. La descarboxilación es una
reacción química en la cual un grupo carboxilo es eliminado de un compuesto en forma de dióxido
de carbono (CO2) más una amina.
2.1.5 Reacción de transaminación
Las reacciones de transaminación se producen siempre entre un α-aminoácido
y un α-cetoácido, donde el primero traspasa el grupo amino al segundo, para
formar el α-cetoácido correspondiente al α-aminoácido y el α-aminoácido procedente del α-cetoácido.
65
Capítulo 1
Figura 18. Reacción de transaminación del glutamato. El glutamato reacciona con un
α-cetoácido para transferir su grupo NH3 y producir α-cetoglutarato y su respectivo aminoácido. Las enzimas que llevan a cabo esta reacción son las transaminasas o aminotransferasas.
2.1.6 Estructura de los 20 aminoácidos
Figura 19. Grupos R
de los 20 aminoácidos
presentes en las proteínas.
Estructuralmente,
los aminoácidos son
muy variables, desde el
menos complicado que
es la glicina que en su
grupo R contiene solo
un H, hasta los aminoácidos
aromáticos
que contienen estructuras policíclicas de carbonos.
66
Capítulo 1
2.2 RAP* Conocer las
características estructurales y
funcionales de las proteínas.
Las proteínas son macromoléculas
de enorme importancia biológica.
Prácticamente, todas las funciones
biológicas desempeñadas en todos
los organismos vivos (incluyendo
a los virus incluso) son llevadas a
cabo por proteínas. Las proteínas
son cadenas de aminoácidos que se
pliegan adquiriendo una estructura
tridimensional
que
les
permite
llevar a cabo miles de funciones.
Las proteínas están codificadas
en el material genético de cada
organismo, donde se especifica su
secuencia de aminoácidos y luego
son sintetizadas por los ribosomas.
2.2.1. Estructura de las proteínas
Las proteínas poseen una misma estructura química central, que consiste
en una cadena lineal de aminoácidos.
Lo que hace distinta a una proteína de
otra es la secuencia de aminoácidos
de que está hecha, a tal secuencia
se conoce como estructura primaria
de la proteína. La estructura primaria de una proteína es determinante
en la función que cumplirá después;
así las proteínas estructurales (como
aquellas que forman los tendones y
cartílagos) poseen mayor cantidad de
aminoácidos rígidos y que establezcan enlaces químicos fuertes unos con
otros para dar dureza a la estructura
que forman.
Estructura primaria
La estructura primaria de las proteínas radica en la secuencia de sus aminoácidos. Nos indica qué aminoácidos componen la cadena polipeptídica y el
orden en que dichos aminoácidos se encuentran. La función de una proteína
depende de su secuencia y de la forma que ésta adopte. Como consecuencia
del establecimiento de los enlaces peptídicos entre los distintos aminoácidos
que forman la proteína se origina una cadena principal o “esqueleto” a partir
del cual emergen las cadenas laterales de los aminoácidos.
Figura 20. Secuencia de aminoácidos. La estructura primaria de los aminoácidos. La estructura primaria de las proteínas radica en la
secuencia y número de sus aminoácidos.
67
Capítulo 1
Conocer la estructura primaria de una proteína no sólo es importante para entender su función (ya que ésta depende de la secuencia de aminoácidos y de
la forma que adopte), sino también en el estudio de enfermedades genéticas.
Es posible que el origen de una enfermedad genética radique en una secuencia
anormal. Esta anomalía, si es severa, podría resultar en que la función de la
proteína no se ejecute de manera adecuada o, incluso, en que no se ejecute
en lo absoluto.
La secuencia de aminoácidos está especificada en el ADN por la secuencia de
nucleótidos. Existe un sistema de conversión, llamado código genético, que
se puede utilizar para deducir la primera a partir de la segunda. Sin embargo,
ciertas modificaciones durante la transcripción del ADN no siempre permiten
que esta conversión pueda hacerse directamente.
El enlace peptídico
El enlace peptídico es un enlace covalente entre el grupo amino (–NH2) de un
aminoácido y el grupo carboxilo (–COOH) de otro aminoácido. Los péptidos y
las proteínas están formados por la unión de aminoácidos mediante enlaces
peptídicos. El enlace peptídico implica la pérdida de una molécula de agua y
la formación de un enlace covalente CO-NH. Es, en realidad, un enlace amida
sustituido.
Figura 21. Formación
de un enlace péptido. El enlace peptídico es un enlace covalente entre el grupo
amino (–NH2) de un
aminoácido y el grupo
carboxilo (–COOH) de
otro aminoácido.
68
Capítulo 1
Estructura secundaria de las proteínas
La estructura secundaria de las proteínas es el plegamiento regular local entre residuos de aminoácidos cercanos de la cadena polipeptídica. Se adopta
gracias a la formación de enlaces de hidrógeno entre las cadenas laterales
(radicales) de aminoácidos cercanos en la cadena.
Las principales formaciones secundarias son:
• Hélice alfa: En esta estructura la cadena polipeptídica se enrolla en espiral
sobre sí misma debido a los giros producidos en torno al carbono alfa de
cada aminoácido. Esta estructura se mantiene gracias a los enlaces de hidrógeno intracatenarios formados entre el grupo -NH de un enlace peptídico
y el grupo -C=O del cuarto aminoácido que le sigue.
• Láminas beta o láminas plegadas: algunas regiones de proteínas
adoptan una estructura en zigzag y se asocian entre sí estableciendo
uniones mediante enlaces de hidrógeno intercatenarios. Todos los enlaces peptídicos participan en estos enlaces cruzados, confiriendo así
gran estabilidad a la estructura. La forma en beta es una conformación
simple formada por dos o más cadenas polipeptídicas paralelas (que
corren en el mismo sentido) o antiparalelas (que corren en direcciones
opuestas) y se adosan estrechamente por medio de puentes de hidrógeno y diversos arreglos entre los radicales libres de los aminoácidos.
Esta conformación tiene una estructura laminar y plegada, a la manera
de un acordeón.
Estructura de alfa hélice
En las proteínas, la hélice α es el principal motivo de estructura secundaria.
Fue postulada primero por Linus Pauling, Robert Corey, y Herman Branson en
1951, basándose en las estructuras cristalográficas entonces conocidas de
aminoácidos y péptidos y en la predicción de Pauling, de la forma planar de los
enlaces peptídicos.
Los aminoácidos en una hélice α están dispuestos en una estructura helicoidal
dextrógira, con unos 3.6 aminoácidos por vuelta. Cada aminoácido supone un
giro de unos 100° en la hélice, y los Carbonos α de dos aminoácidos contiguos
están separados por 1.5 Å. Todas las cadenas laterales de los aminoácidos
están dispuestas hacia el exterior de la hélice.
69
Capítulo 1
El grupo N-H del aminoácido (n) puede establecer un
enlace de hidrógeno con el grupo C=O del aminoácido
(n+4). De esta forma, cada aminoácido (n) de la hélice
forma dos puentes de hidrógeno con su enlace peptídico y el enlace peptídico del aminoácido en (n+4) y en
(n-4). En total son 7 enlaces de hidrógeno por vuelta.
Esto estabiliza enormemente la hélice
Figura 22. Formación alfa hélice. Las fuerzas que estabilizan las estructuras alfa hélice
de las proteínas son los enlaces entre puentes
de hidrógeno.
Estructura de lámina de enlace o puente de hidrógeno
La beta lámina u hoja plegada β es una de las estructuras secundarias posibles adoptada por las proteínas. Se forma por el posicionamiento paralelo o
antiparalelo de dos cadenas de aminoácidos dentro de la misma proteína, en
el que los grupos N-H de una de las cadenas forman enlaces de hidrógeno con
los grupos C=O de la opuesta. Es una estructura muy estable que puede llegar
a resultar de una ruptura de los enlaces de hidrógeno durante la formación de
la hélice alfa. Los grupos R de esta estructura están posicionados sobre y bajo
el plano de las láminas. Estos R no deben ser muy grandes, ni crear un impedimento estérico, ya que se vería afectada la estructura de la lámina.
Figura 23. Formación de una hoja beta
plegada. Se forma por el posicionamiento paralelo o antiparalelo de dos cadenas de aminoácidos dentro de la misma proteína.
70
Capítulo 1
Estructura terciaria de las proteínas
La estructura terciaria de las proteínas es el modo en el que la cadena polipeptídica se pliega en el espacio, es decir, la disposición de los dominios de la
proteína en el espacio.
La estructura terciaria se realiza de tal manera que los aminoácidos apolares
se sitúan hacia el interior y los polares hacia el exterior.
Las fuerzas que estabilizan la estructura terciaria son principalmente enlaces
covalentes entre cisteínas (s-s), puentes de hidrógeno entre cadenas laterales,
interacciones iónicas entre cadenas laterales, interacciones de van der Waals
entre cadenas laterales y el efecto hidrófobo (exclusión de las moléculas de
agua, evitando su contacto con los residuos hidrófobos, que quedan empaquetados en el interior de la estructura).
Figura 24. Estructura terciaria
de las proteínas. La estructura
terciaria de las proteínas se forma a partir de las diversas interacciones como: enlaces puentes
de hidrógeno, enlaces disulfuro,
interacciones hidrofóbicas etc.
71
Capítulo 1
Estructura cuaternaria de las proteínas
Muchas proteínas presentan este tipo de estructura, que es el grado máximo de
organización proteica y consiste en dos o más cadenas polipeptídicas unidas
generalmente mediante enlaces débiles.
Estas proteínas se denominan oligoméricas o multiméricas y se las designa
según el número de cadenas polipeptídicas que intervienen en la estructura
cuaternaria. Cada una de las subunidades proteícas tienen su propia estructura
terciaria.
Por ejemplo, una proteína formada por cuatro subunidades es un tetrámero,
como es el caso de la hemoglobina.
Figura 25. Estructura cuaternaria de las
proteínas. Las proteínas con estructura cuaternaria se denominan oligoméricas o multiméricas y se las designa según el número de
cadenas polipeptídicas que intervienen en la
estructura.
72
Capítulo 1
Función de las Proteínas
Las proteínas dirigen la totalidad de los procesos celulares, incluso su propia
síntesis. Las funciones de mayor importancia de las proteínas en los seres
vivos son:
Función estructural: como el colágeno,
Función Reguladora: como las ciclinas
que controlan el ciclo celular y los
factores de transcripción que regulan
la expresión de los genes.
Función Motora:
actina y miosina
del músculo.
Función de Receptores: como las proteínas receptoras de membrana.
Función de Defensa: Los anticuerpos son proteínas simples
globulares y son sintetizadas por las células plasmáticas
(linfocitos B activados); son también conocidas como inmunoglobulinas o gamaglobulinas. Estas proteínas presentan
gran diversidad ya que cada anticuerpo es específico para
un determinado antígeno. Sin embargo, podemos mencionar que en general están compuestas por cuatro cadenas
polipeptídicas: dos contienen 220 aminoácidos (cadenas
livianas) y las otras más largas, con 440 aminoácidos cada
una (cadenas pesadas).
Función de Reserva: La ovoalbúmina,
componente principal de la clara de
huevo o la gliadina del trigo.
la tubulina de los microtúbulos, las de
las cápsides virales, etc. Las moléculas de colágeno son ejemplos típicos
de las proteínas simples fibrosas. Son
la clase de proteínas más abundantes
de nuestro cuerpo, son componentes de la matriz extracelular del tejido
conectivo, de modo que las podemos
encontrar en tendones, ligamentos,
membrana basal, etc.
Función de Transporte: Globulinas en general, hemoglobina,
mioglobina y las lipoproteínas
son algunos ejemplos.
Función Enzimática: La enzimas catalizan todas las reacciones metabólicas.
Dada su importancia biológica, este
tema será tratado con mayor detalle
más adelante.
73
Capítulo 1
2.3 RAP Determinación de las características estructurales
y funcionales de los aminoácidos, proteínas y enzimas en los
procesos bioquímicos
Todas las reacciones que se efectúan en los seres vivos son catalizadas por
enzimas. Se llaman enzimas las sustancias de naturaleza proteica que catalizan reacciones químicas, siempre que sean termodinámicamente posible (si
bien no pueden hacer que el proceso sea más termodinámicamente favorable).
En estas reacciones, las enzimas actúan sobre unas moléculas denominadas
sustratos, las cuales se convierten en diferentes moléculas, los productos.
Casi todos los procesos en las células necesitan enzimas para que ocurran en
tasas significativas. A las reacciones mediadas por enzimas se les denomina
reacciones enzimáticas. Estas hacen posible que las reacciones metabólicas
se desarrollen en un ritmo razonable, compatible con la vida.
El término catalizador se emplea para referirse a cualquier sustancia que
acelera el transcurso de una reacción química, sin intervenir en ella ni como
reactivo ni como producto. El catalizador no provoca la reacción, sólo afecta
la velocidad con que ocurre la misma. Esto es posible porque los catalizadores
disminuyen la energía de activación, como lo indica el siguiente gráfico.
Figura 26.
Perfil de energía de una reac-
ción exergónica. La curva punteada indica
el curso de la reacción sin enzima. La curva
continúa el curso de la reacción en presencia
de la enzima
74
Capítulo 1
Una enzima puede estar formada por una sola cadena de polipéptido, consistir
en subunidades múltiples o requerir de componentes no proteicos. En general,
las reacciones catalizadas por enzimas se llevan a cabo por presión, temperatura y pH moderado.
2.3.1Clasificación
Desde el punto de vista estructural podemos clasificar a las
enzimas en simples y conjugadas.
Figura 27. Clasificación de las enzimas según su estructura.
Enzimas simples: son aquellas que constan sólo de una estructura proteica.
Pueden estar formadas por una o varias cadenas polipeptídicas.
Enzimas conjugadas: también llamadas holoenzimas poseen en su estructura
una parte no proteica denominada cofactor y una parte proteica que se denomina apoenzima. Para que estas enzimas actúen como catalizadores es necesario que la apoenzima se una al cofactor. El término cofactor puede aplicarse
tanto a un Ión como a una molécula orgánica de naturaleza variable (grupo
prostético y coenzimas). Las coenzimas funcionan como portadores de grupos
químicos pequeños como ser acetilo, metilo o bien protones y electrones. Las
coenzimas se unen no covalentemente a la apoenzima permitiendo que la holoenzima así formada lleve a cabo reacciones que la apoenzima sola no puede
75
Capítulo 1
efectuar. Por ejemplo, ninguna de las cadenas laterales de los aminoácidos es
capaz de transportar electrones pero cuando se agrega por ejemplo la coenzima FAD+, la proteína adquiere esta función. Las moléculas orgánicas que están
fuertemente unidas a la apoenzima se denominan grupos prostéticos. Muchas
coenzimas derivan de vitaminas solubles en agua, como son las del grupo B.
Otra forma de clasificarlas es de acuerdo con las reacciones que catalizan.
76
Capítulo 1
Clasificación de las Enzimas (según International Union of Biochemestry)
77
Capítulo 1
2.3.2 Mecanismos de acción
La actividad catalítica de una enzima resulta de la unión de la molécula de
sustrato al sitio activo de la enzima por medio de interacciones generalmente
débiles. Al parecer, las más significativas son las interacciones puente hidrógeno. También debemos recordar que esta unión es sumamente específica.
Figura 29. Ciclo catalítico de una enzima.
Una vez que la enzima reconoce al sustrato y se ajusta a
él, se forma un complejo que recibe el nombre de complejo
enzima-sustrato. La ruptura y la formación de los enlaces
se llevan a cabo por las interacciones entre las cadenas
laterales de la enzima y los enlaces dentro del sustrato.
Una vez que se han formado los productos obtenemos un
complejo que recibe el nombre de complejo enzima–producto; finalmente, los productos se separarán de la enzima
recuperándose ésta para reaccionar con otra molécula de
sustrato, es decir, que en el transcurso de la reacción la
enzima no se modifica.
78
Capítulo 1
2.3.3Factores que modifican la velocidad de las reacciones
químicas
Una determinada reacción química ocurre sólo en condiciones termodinámicas
favorables, esto es cuando la energía de los reactivos o sustratos es mayor
que la energía de los productos. La velocidad con que dicha reacción ocurrirá
depende de distintos factores como son: la cantidad de reactivo o sustrato que
interviene, la temperatura, el pH, etc.
Como hemos mencionado, las enzimas aumentan la velocidad de las reacciones químicas; sin embargo, no las provocan; por lo tanto, la concentración de
enzimas es otro de los factores que modifican la velocidad de la reacción, así
como también aquellas sustancias que pueden inhibir la acción de la enzima
(inhibidores).
1. Concentración de sustrato
En general, a medida que aumenta la cantidad de reactivos
o sustratos, la velocidad también aumenta. En el caso de
las reacciones químicas conviene aclarar que la velocidad
se mide como cantidad de producto formado por unidad
de tiempo, las unidades serán: gr/seg, moles/seg, moles/
min, etc. De este modo, cuanto más reactivo tenemos, más
producto se formará.
En el caso de las reacciones catalizadas por enzimas,
el efecto de la cantidad de sustrato es el siguiente:
A medida que aumenta la cantidad de sustrato la velocidad
aumenta en forma lineal (zona proporcional), luego si bien
la velocidad continúa aumentando, ya no lo hace en forma
lineal (zona mixta), hasta que finalmente la reacción alcanza una velocidad máxima que es constante, se vuelve independiente de la cantidad de sustrato (zona de saturación).
Esto ocurre debido a que los sitios activos de las enzimas
se encuentran todos interactuando con las moléculas de
sustrato; por lo tanto, hasta que no finalice la reacción, la
enzima no puede unirse a otro sustrato.
Figura 30. Efecto de
la concentración de
sustrato sobre la cinética enzimática.
79
Capítulo 1
2. Concentración de enzimas
La concentración de enzimas es otro de los factores que modifican la velocidad;
cuanto mayor cantidad de enzima esté presente, mayor será la velocidad que
se alcanzará, debido a que se necesita más cantidad de sustrato para alcanzar
la saturación.
3. Temperatura
En general, las reacciones ocurren más rápidamente cuando se les otorga calor,
ya que el aumento de la temperatura hace que aumente la energía cinética de
las moléculas y de esta manera reaccionen con facilidad.
Cuando las reacciones están catalizadas por enzimas se produce primero
un efecto complementario, es decir, la velocidad va aumentando conforme al
aumento de temperatura; sin embargo, la velocidad llega a un punto óptimo a
partir del cual la velocidad comienza a decaer. No nos olvidemos que las enzimas son proteínas, por lo tanto son susceptibles a la desnaturalización, es decir,
que la velocidad decae porque las enzimas pierden su actividad biológica como
consecuencia de la desnaturalización. Algunas enzimas son termoestables, es
decir, su actividad biológica permanece aún a temperaturas mayores a 90 °C.
4. pH
El gráfico de actividad en función del pH es similar al de la temperatura, es
decir, a pH extremos las proteínas se desnaturalizan; por lo tanto, la actividad
biológica decae. Algunas enzimas no varían su actividad con el pH, sino que
ésta se mantiene constante en un amplio rango. Otra tendrá el pH óptimo ácido
o básico, teniendo en cuenta el medio en donde actúan.
Figura 31. Efecto de la temperatura (a) y el pH (b) sobre la actividad enzimática.
80
Capítulo 1
5. Inhibidores
Aunque hay muchos ejemplos de inhibidores, los mecanismos de inhibición
pueden ser de dos clases: reversibles e irreversibles; también hay mecanismos
intermedios.
Inhibidores irreversibles: estos inhibidores se enlazan con fuerza a la enzima, generalmente se unen covalentemente a algún aminoácido del sitio
activo. Existen algunos inhibidores que
se conocen como sustrato suicida, que
se enlazan al centro activo y químicamente se transforman en una especie
reactiva que modifica en forma irreversible al aminoácido del sitio activo.
Inhibidores reversibles: este tipo de
inhibidores se disocian fácilmente de
las enzimas; dentro de este grupo encontramos los inhibidores competitivos y los no competitivos.
Figura 32. Perfil de una reacción en presencia de inhibidor COMPETITIVO y sin inhibidor. 81
Capítulo 1
Práctica 4
Coagulación de proteínas
Las proteínas, debido al gran tamaño de sus moléculas, forman con el agua
soluciones coloidales. Estas soluciones pueden precipitarse con formación
de coágulos al ser calentadas a temperaturas superiores a los 70 ºC o al ser
tratadas con soluciones salinas, ácidos, alcohol, etc.
La coagulación de las proteínas es un proceso irreversible y se debe a su desnaturalización por los agentes indicados, que al actuar sobre la proteína la
desordenan por la destrucción de su estructura terciaria y cuaternaria.
C 27,06 / M 100 / Y 100 / N 27,84
C 19,61 / M 10,98 / Y 19,61 / N 0
C 44,71 / M 41,96 / Y 100 / N 16,86
C 69,02 / M 53,73 / Y 34,51 / N 10,2
Figura 1. Desnaturalización de una proteína. C 100 / M 90,98 / Y 32,55 / N 22,35
Equipo y material
- Tubos de ensayo
- Gradillas
- Pinzas para tubos de ensayo
- Baño María
- Mechero
82
Reactivos
- Clara de huevo
- Ácido acético
- Ácido nítrico
- Benceno
- Cloroformo
Capítulo 1
Procedimiento
Para ver la coagulación de las proteínas se puede utilizar
clara de huevo; para conseguir más volumen puede prepararse para toda la clase una dilución de clara de huevo en
agua, de forma que quede una mezcla aún espesa.
1. Colocar en un tubo de ensayo una pequeña cantidad de
clara de huevo.
2. Añadir 5 gotas de ácido acético y calentar el tubo en la
llama del mechero.
3. Anota LOS RESULTADOS.
83
Capítulo 1
Práctica 5
Reacción xantoproteica
Es debida a la formación de un compuesto aromático nitrado de color amarillo,
cuando las proteínas son tratadas con ácido nítrico concentrado. La prueba da
resultado positivo en aquellas proteínas con aminoácidos portadores de grupos
bencénicos, especialmente en presencia de tirosina. Si una vez realizada la
prueba se neutraliza con un álcali, vira a un color anaranjado oscuro.
C 27,06 / M 100 / Y 100 / N 27,84
C 19,61 / M 10,98 / Y 19,61 / N 0
C 44,71 / M 41,96 / Y 100 / N 16,86
C 69,02 / M 53,73 / Y 34,51 / N 10,2
Procedimiento
C 100 / M 90,98 / Y 32,55 / N 22,35
1. Poner en el tubo de ensayo de 2 a 3 ml. de solución
problema (clara de huevo). Y en otro 3ml de agua
2. Añadir 1 ml. de HNO3 concentrado en cada tubo.
3. Calentar en baño María a 100 ºC
4. Enfriar en agua fría
5. Añadir gota a gota una disolución de NaOH al 40% en
cada tubo
6. ANOTA LOS RESULTADOS
84
Capítulo 1
Práctica 6
Reacción de Biuret
La producen los péptidos y las proteínas, pero no los aminoácidos, ya que se
debe a la presencia del enlace peptídico (- CO- NH -) que se destruye al liberarse los aminoácidos.
Cuando una proteína se pone en contacto con un álcali concentrado, se forma
una sustancia compleja denominada Biuret, de fórmula:
Que en contacto
con una
solución
diluida, da una coloración
C 27,06
/M
100 de
/ Ysulfato
100 /cúprico
N 27,84
violeta característica.
Reactivos necesarios para la práctica
C 19,61 / M 10,98
/ Y 19,61 / N 0
1.
Albúmina de huevo
2. / YSolución
C 44,71 / M 41,96
100 /deNhidróxido
16,86de sodio al 20%
3.
Solución de sulfato cúprico al 1%
C 69,02 / M 53,73 / Y 34,51 / N 10,2
Procedimiento
C 100 / M 90,981. /Tomar
Y 32,55
/ N 22,35
dos tubos de ensayo y etiquetarlos,
poner 3 ml
de albúmina de huevo en uno y 3ml de agua en otro.
2. Añadir 2ml. de solución de hidróxido de sodio al 20%
en cada tubo.
3. A continuación, 4 o 5 gotas de solución de sulfato
cúprico diluida al 1% en cada tubo.
4. Debe aparecer una coloración violeta-rosácea característica.
5. Anota los resultados
85
Capítulo 1
Práctica 7
Efecto del calor en la coagulación de las proteínas del huevo
Procedimiento
1. Preparar un baño María llevándolo a calentamiento
hasta alcanzar 40°C aproximadamente.
2. Toma un huevo y separa la clara de la yema, colocándolas en dos vasos de precipitado de 100 mL identificados respectivamente.
3. Rotula dos tubos de ensayo con la letra A y B.
4. En el tubo A coloca 5 mL de clara de huevo y en el
tubo B 5 mL de yema de huevo; introduce ambos tubos
en el C
baño
de agua
el paso
1.
27,06
/ Mpreparado
100 / Y en
100
/ N 27,84
5. Sujeta un termómetro dentro del vaso de precipitado y
anota la temperatura en la cual la albúmina y la yema de
19,61
M 10,98
/ Y 19,61
/N0
huevoCse
tornan/opacas,
es decir,
se coagulan.
6. Anota tus observaciones y discute tus resultados.
C 44,71 / M 41,96 / Y 100 / N 16,86
C 69,02 / M 53,73 / Y 34,51 / N 10,2
C 100 / M 90,98 / Y 32,55 / N 22,35
86
Capítulo 1
Práctica 8
Factor pH
Procedimiento
C 27,06 / M
C 19,61 / M
C 44,71 / M
C 69,02 / M
1. Rotula tres tubos de ensayo con la letra A, B y C.
2. Coloca en los tubos lo siguiente:
Tubo A: 5 mL de yema de huevo y mide su pH.
Tubo B: 5mL de yema de huevo y 2ml. de limón, mide el
pH.
Tubo C: 5mL de yema de huevo y 2mL solución de bicarde sodio,
mide el pH.
100bonato
/ Y 100
/ N 27,84
3. Introduce ambos tubos en el baño de agua preparado
en el paso 1 del experimento anterior
10,98
/ Y 19,61
/ N 0 dentro cada tubo de ensayo y
4. Sujeta
un termómetro
anota la temperatura en la cual la yema de huevo se torna
opaca, es decir, se coagula.
41,96
/ Y 100 / N 16,86
5. Anota las observaciones respecto de cada tubo, considerando el cambio de la temperatura de coagulación a
53,73
/ Y 34,51
/ N 10,2
diferentes
pH y discute
tus resultados.
C 100 / M 90,98 / Y 32,55 / N 22,35
87
Capítulo 1
Unidad 3 Determinación de las características estructurales y funcionales de
los carbohidratos, lípidos y ácidos nucleicos en los procesos bioquímicos
3.1 RAP Determina las características estructurales y funcionales de los carbohidratos mediante pruebas analíticas para interpretar su
comportamiento en seres vivos y en procesos
bioquímicos industriales
Las biomoléculas son la materia prima con que se encuentran construidos los seres vivos; siendo la base esencial y fundamental de la vida y de la salud, presentan
una armónica y común afinidad entre las distintas especies vivas, los alimentos naturales y el cuerpo humano.
Entender la relación entre la especificidad biomolecular,
su organización y su función, es una necesidad fundamental para quien desee desarrollarse en el ámbito de
los procesos bioquímicos del ser humano.
Los carbohidratos, desde lo químico, son aldehídos o
cetonas polihidroxilados. Esto quiere decir que en su estructura tienen: un grupo formilo o un grupo oxo y varios
grupos hidroxilo.
Una clasificación más general es la siguiente:
3.1.1 Carbohidratos Simples
• Monosacáridos: monosacáridos o azúcares simples son
los glúcidos más sencillos, que no se hidrolizan, es decir,
que no se descomponen para dar otros compuestos.
• Disacáridos: formados por la unión de dos monosacáridos iguales o distintos: lactosa, maltosa, sacarosa, etc.
• Oligosacáridos: polímeros de hasta 20 unidades de
monosacáridos.
88
Capítulo 1
3.1.2 Carbohidratos Complejos
• Polisacáridos: están formados por la unión de más de 20 monosacáridos
simples. (almidón, glucógeno y dextranos).
Los monosacáridos se clasifican con base en dos criterios:
• Grupo funcional
• Número de átomos de carbono
De acuerdo con el grupo funcional, los monosacáridos se clasifican en
dos grupos:
• Aldosas: Dentro de su estructura un grupo formilo (grupo de aldehídos).
• Cetosas: Contienen en su estructura un grupo oxo (grupo de cetonas.
Figura 1. Principales grupos presentes en los carbohidratos
89
Capítulo 1
Los monosacáridos forman estructuras cíclicas al cerrarse la cadena
abierta mostrada anteriormente.
Figura 2. La glucosa en sus dos conformaciones es una aldohexosa conocida también con el nombre de dextrosa
De acuerdo con número de átomos de carbono, los monosacáridos se
clasifican en:
• Las triosas: son frondosas en el interior de la célula, ya que son metabolitos intermediarios de la degradación de la glucosa
• Las pentosas, son glúcidos de 5 carbonos y entre los que se encuentran:
Ribosa y Desoxirribosa; forman parte de los ácidos nucleicos y la ribulosa que
desempeña un importante papel en la fotosíntesis, debido a que en ella se fija
el CO2 atmosférico y de esta manera se incorpora el carbono al ciclo de la
materia viva.
• Las hexosas: son glúcidos con 6 átomos de carbono. Entre ellas tienen
interés en biología, la glucosa y galactosa entre las aldohexosas, y la
90
Capítulo 1
fructosa entre las cetohexosas
Todos los monosácaridos son azúcares reductores, ya que al menos
tienen un
-OH hemiacetálico libre, por lo que dan la Reacción de
Maillard y la Reacción de Benedict.
Todos los carbohidratos ( menos la dihidroacetona) tienen la propiedad
de desviar la luz polarizada, propiedad que le confiere su carbono asimétrico (estereoisomería), llamándose dextrógiros los que la desvían hacia la
derecha, y levógiros, hacia la izquierda.
Epímeros: dos monosacáridos se diferencian en la configuración de uno
solo de sus carbonos asimétricos. Por ejemplo, la D-Glucosa y la D-Manosa sólo se diferencian en la configuración del hidroxilo en el C2
Anómeros:
dos
monosacáridos
ciclados que se resaltan sólo en el
grupo -OH del carbono anomérico
(el que en principio pertenece al
grupo aldehído o cetona). Dan lugar
a las configuraciones α y β.
Enantiómeros: monosacáridos con
una estructura especular en el plano
(D y L). D por la derecha y L por
la izquierda.
http://es.wikipedia.org/wiki/Monosac%C3%A1rido
Figura
3.
Estructuras
de
las
aldosas:
triosas,
tetrosas,
pentosas y hexosas.
91
Capítulo 1
Una vez ingeridos, los carbohidratos se hidrolizan en glucosa, la sustancia
más simple. La glucosa es importante para el correcto funcionamiento del
sistema nervioso central (SNC). Nuestro cerebro consume más o menos
100 g. de glucosa al día; cuando estamos en ayuno, SNC recurre a los
cuerpos cetónicos que existen en bajas concentraciones, es por eso que
en condiciones de hipoglucemia podemos sentirnos mareados o cansados.
3.1.3 Disacáridos
Los disacáridos están formados por dos moléculas de monosacáridos que
pueden ser iguales o diferentes.
Los disacáridos no se utilizan como tales en el organismo, sino que éste
los convierte en glucosa. En este proceso participa una enzima específica
para cada disacárido, lo rompen y se producen los monosacáridos que
los forman.
Figura 4. Disacáridos. Las uniones entre los disacáridos pueden ser de dos formas:
1. Mediante enlace monocarbonílico, entre el C1 anomérico de un monosacárido y un C no anomérico de otro monosacárido, como se ve
en las fórmulas de la lactosa y maltosa. Estos disacáridos conservan
el carácter reductor.
92
Capítulo 1
Figura 5. Estructura de la lactosa.
2. Mediante enlace dicarbonílico, si se establece entre
los dos carbonos anoméricos de los dos monosacáridos, con lo que el disacárido pierde su poder reductor;
por ejemplo, como ocurre en la sacarosa.
• La maltosa o azúcar de malta se obtiene por hidrólisis
del almidón con la enzima maltasa.
• La maltosa o azúcar de malta se obtiene por hidrólisis
del almidón con la enzima maltasa.
• La sacarosa (azúcar de mesa) es un disacárido de
glucosa y fructosa. Se sintetiza en plantas, pero no en
animales superiores. Contiene 2 átomos de carbono
anomérico libre, puesto que los carbonos anoméricos
de sus dos unidades monosacáridos constituyentes se
hallan unidos entre sí, covalentemente mediante un
enlace O-glucosídico.
• La lactosa es el principal carbohidrato presente en la
leche de los mamíferos. Se le obtiene comercialmente
por evaporación del suero de la leche, luego de la
coagulación de las proteínas presentes durante la
fabricación de queso.
Figura 6. Estructura de la sacarosa
93
Capítulo 1
3.1.4 Enlace glucosídico
Figura 7. Los dos enlaces glucosídicos presentes en los disacáridos y
El enlace O-glucosídico es el enlace para unir monosacáridos con
el fin de formar disacáridos o polisacáridos. Existen principalmente
dos tipos de enlace glucosídico alfa
1- 6 y beta 1 – 4. En el enlace O
- glucosídico reaccionan los grupos
-OH (hidroxilo) del C anomérico del
primer monosácarido con un -OH
de otro C del otro monosacárido
(ya sea C anomérico o no) formando un disacárido y una molécula
de agua.
polisacáridos son principalmente α 1-4 y α 1-6
3.1.5Polisacáridos
Es el conjunto de muchas moléculas de monosacáridos a través de
enlace glicosídico, dando lugar a los polisacáridos. Estos alcanzan grado
de polimerización exageradamente altos. A diferencia de otros polímeros
biológicos, como los ácidos nucleicos o las proteínas, los polisacáridos no
son portadores totalmente de información.
Los polisacáridos cumplen dos funciones en el medio biológico: la de
reserva energética o la estructural. En este sentido, el tipo anomérico de
enlace suele ser decisivo. Mientras que los polisacáridos con azúcares
unidos energética, los formados por enlaces de tipo β- suelen cumplir
funciones estructurales, .tales como:
Se distinguen dos tipos principales de polisacáridos, los homopolisacáridos,
formados por un sólo tipo de monosacárido, y heteropolisacáridos,
formados por dos o más tipos de monosacáridos.
94
Capítulo 1
Según la función biológica, los polisacáridos se clasifican en dos grupos:
1. Polisacáridos de reserva: La principal molécula proveedora de energía para las células de los seres vivos es la glucosa. Cuando ésta no
es descompuesta en el catabolismo energético para extraer la energía
que contiene, se almacena en forma de polisacáridos de tipo α(1->4),
aparecen en las plantas por el almidón y en los animales por el glucógeno.
2. Polisacáridos estructurales: Se trata de glúcidos que participan en la
edificación de estructuras orgánicas. Entre los más importantes tenemos la celulosa que es el principal componente de la pared celular en
las plantas y la quitina; cumple el mismo papel en los hongos, además
de ser la base del exoesqueleto de los artrópodos y otros animales
emparentados.
3.1.6Almidón
Es un polisacárido formado por moléculas de α-D-glucosa unidas por
enlaces glucosídicos α(1→4) y α(1→6). En la molécula de almidón se
clasifica en dos tipos de polímero:
• Amilosa. Es un polímero no ramificado formado por largas cadenas
de unidades de α-D-glucosa unidas por enlaces α-(1→4). Estas cadenas
adoptan una disposición helicoidal con 6 moléculas por vuelta, y tienen
masas moleculares relativas que oscilan entre unos pocos miles y 500.000
daltons.
• Amilopectina. Es un polímero muy ramificado formado por moléculas de
α-D-glucosa. Los sucesivos restos de glucosa a lo largo de las cadenas
están unidos por enlaces α(1→4), y los puntos de ramificación, que se
encuentran espaciados por un número de restos de glucosa que oscila
entre 24 y 30, consisten en enlaces α(1→6) (ver Figura 7.14). Su masa
molecular relativa puede alcanzar hasta un millón de daltons.
El almidón actúa como sustancia de reserva en las células vegetales.
Una parte sustancial de los glúcidos producidos en la fotosíntesis se
almacenan en forma de almidón, dando lugar a unos agregados insolubles
de gran tamaño, los granos de almidón, que se encuentran en todas las
células vegetales, siendo especialmente abundantes en las de las semillas,
frutos y tubérculos.
95
Capítulo 1
Proporciona el 70-80 % de las calorías consumidas por
los humanos. Tanto el almidón como los productos de
la hidrólisis del almidón constituyen la mayor parte de
los carbohidratos digestibles de la dieta habitual. Del
mismo modo, la cantidad de almidón utilizado en la
preparación de productos alimenticios, sin contar el
que se encuentra presente en las harinas usadas para
hacer pan y otros productos de panadería.
Figura 8. Debido a las ramificaciones de la amilopectina la estructura resultante del almidón toma una forma muy particular.
96
Capítulo 1
3.1.7Glucógeno
Es un polisacárido con estructura parecida la de la amilopectina. Al igual
que ésta, ella, formado por moléculas de α-D-glucosa unidas por enlaces
glucosídicos α(1→4) a lo largo de las cadenas, y con puntos de ramificación consistentes en enlaces α(1→6). La diferencia con respecto a la
amilopectina consiste en que las ramificaciones se encuentran menos
espaciadas, concretamente cada 8 a 12 restos de glucosa. Esta mayor
proximidad entre los puntos de ramificación hace que el glucógeno sea
mucho más compacto que el almidón, pudiendo alcanzar pesos moleculares del orden de varios millones de daltons.
El glucógeno actúa como sustancia de reserva en las células animales.
Es abundante en el hígado,puede llegar a representar el 7% de su peso;
también abunda en el músculo esquelético. En el interior de las células el
glucógeno se almacena en forma de gránulos insolubles de gran tamaño.
Cuando las células recurren a sus reservas de almidón o de glucógeno,
determinados enzimas van liberando una a una moléculas de glucosa, en
forma de derivados fosforilados, las cuales pueden después ser utilizadas
como combustible metabólico. Los enzimas degradativas actúan a partir
de los extremos no reductores.
Figura 9. Estructura ramificada del glucógeno.
97
Capítulo 1
3.2 RAP Determinación de las características estructurales y funcionales de
los lípidos mediante pruebas analíticas para interpretar su comportamiento
en seres vivos y en procesos bioquímicos industriales
3.2.1 Definición de lípidos
Los lípidos son aquellas moléculas orgánicas, se presentan en el tejido de
los animales y las plantas, los cuales pueden ser separados o aislados
con solventes de baja polaridad tales como: tetracloruro de carbono, cloroformo, éter de petróleo, éter etílico, bencina, benceno, tolueno, mezclas
de benceno o tolueno y etanol en proporción 2:1.
3.2.2 Clasificación de lípidos desde el punto de vista funcional
Los lípidos pueden clasificarse de acuerdo con su estructura química,
aquellos que presentan enlaces éster y pueden ser hidrolizados, tales
como ceras, glicéridos se denominan lípidos hidrolizables y los que no
presentan enlaces ésteres, denominados no hidrolizables, en los que se
encuentran los esteroles, esteroides, terpenos y terpenoides.
Figura 10. Estructura general de un éster.
Los lípidos hidrolizables, se clasifican en: lípidos simples, compuestos; los
lípidos no hidrolizables se clasifican en isoprenoides y esteroides.
Los lípidos también se clasifican en dependencia de las reacciones químicas
que experimentan; de esta manera, aquellos que reaccionan con disolución
de NaOH al 40%, originando sales, se denominan lípidos saponificables,
y los que no experimentan este tipo de reacción se consideran lípidos no
saponificables.
98
Capítulo 1
3.2.3 Lípidos simples
Los lípidos simples se caracterizan por presentar la
función éster. Son abundantes en la naturaleza en forma de: ceras y glicéridos. Los glicéridos a su vez se
encuentran en forma de grasas y aceites.
Las ceras son consideradas mezclas de ésteres de alta
masa molecular formadas por ácidos grasos y alcoholes
monohidroxilados, donde n y m representan el número de
veces que se repite el grupo CO2.
Los glicéridos presentan un grupo hidroxilo esterificado,
denominados monoacilglicérido; diacilglicérido cuando
presentan dos grupos hidróxilos esterificados y triacilglicérido, cuando se esterificaron los tres grupos
hidroxilos.
Figura 11. Estructura de una cera.
Figura 12. Glicéridos
Los glicéridos cuando presentan cadenas carbonadas saturadas reciben la denominación de grasas. Los aceites
se caracterizan por presentar instauraciones; esto quiere
decir la presencia de dobles enlaces en las cadenas de
los ácidos grasos que forman la estructura del glicérido;
los ácidos grasos presentes son no saturados, también
un empaquetamiento u ordenamiento específico en las
moléculas de triglicérido; lo que explica que las grasas
sean sustancias sólidas, mientras que la estereoquímica
particular de los ácidos grasos que constituyen los aceites
(ácidos grasos no saturados) con isomería geométrica,
siendo más abundante el isómero cis, proporciona un
ordenamiento espacial diferente.
Los lípidos simples son sustancias neutras, solubles en
solventes orgánicos de baja polaridad, insolubles en agua,
con olores característicos; su consistencia varía desde
líquidos oleaginosos hasta sustancias semi-sólidas a sólidas.
99
Capítulo 1
3.2.4 Propiedades físico-químicas de los lípidos
• Carácter Anfipático. Ya que el ácido graso está formado por un
grupo carboxilo y una cadena hidrocarbonada, ésta última es la que
posee la característica hidrófoba, siendo responsable de su insolubilidad en agua.
• Punto de fusión: Estriba en la longitud de la cadena y de su número
de insaturaciones, siendo los ácidos grasos insaturados los que requieren menor energía para fundirse.
• Esterificación: Los ácidos grasos pueden formar ésteres con grupos
de alcohol de otras moléculas
• Saponificación: Por hidrólisis alcalina los ésteres formados anteriormente dan lugar a jabones (sal del ácido graso)
• Autooxidación: Los ácidos grasos insaturados pueden oxidarse espontáneamente, dando como resultado aldehídos donde existían los
dobles enlaces covalentes.
Estas propiedades se pueden determinar mediante los siguientes índices:
Índice de yodo: gramos de yodo que se adicionan a 100 g de grasa o
aceite; mide el grado de saturación de la grasa o aceite.
Índice de acidez: es el número de miligramos de hidróxido de potasio
que se necesitan para neutralizar 1 g de grasa o aceite; es una medida
de la acidez de los lípidos simples.
Índice de saponificación: miligramos de hidróxido de potasio que se
necesitan para saponificar 1 g de grasa o aceite.
Los ácidos carboxílicos presentes en la estructura de los lípidos simples,
presentan un grupo carboxilo y cadenas que varían en longitud desde 4
hasta 40 átomos de carbono, siendo los más abundantes en la naturaleza
los ácidos de 16 a 18 átomos de carbono. Los ácidos se clasifican en saturados (enlaces simples) y no saturado (dobles enlaces), son abundantes
en el grano del maíz, fríjol de soya, grasa humana y animal.
100
Capítulo 1
3.2.5 Isomería de los ácidos grasos presentes en los lípidos
simples
Dado que los dobles enlaces son estructuras rígidas, las moléculas que
los contienen pueden presentarse en dos formas: cis y trans. En los isómeros trans, los grupos semejantes o idénticos se encuentran en el lado
opuesto de un doble enlace, mientras que en los cis, están en el mismo
lado.
Figura 13
En la siguiente tabla se muestran la estructura de algunos de ellos:
Los ácidos carboxílicos, que se presentan en la naturaleza, como constituyentes de las ceras y los glicéridos
pueden presentar diferentes longitudes de las cadenas
y grupos funcionales diferentes al grupo carboxilo.
101
Capítulo 1
Figura 14
3.2.6 Clasificación de los ácidos carboxílicos
Ceras
102
Capítulo 1
3.2.7 Estructura de los principales ácidos grasos
Figura 15
Los ácidos grasos presentes en las ceras y los glicéridos, tienen temperaturas de fusión que aumentan con
el aumento de la masa molecular en el caso de los
ácidos grasos saturados. En el caso de los ácidos grasos no saturados, la temperatura de fusión disminuye
en la medida que aumenta el número de instauraciones.
103
Capítulo 1
Las ceras son mezclas de ésteres de alta masa molecular, están formadas
por ácidos grasos y alcoholes monohidroxilados, son abundantes en la
naturaleza, pueden ser obtenidas de fuentes animales y plantas; ejemplos
de ellas tenemos la cera de abeja, la cera de carnauba, la lanolina; en
los árboles forestales se puede encontrar la cera del follaje de conífera y
de varios tipos de latifolias.
Figura 16
Comportamiento químico
Las ceras, debido a la presencia del enlace éster, experimentan reacciones
de sustitución nucleofílica. La hidrólisis en medio alcalino origina sales de
ácidos grasos y alcoholes monohidroxilados y en un medio ácido causa
ácidos grasos y alcoholes de la misma naturaleza (monohidroxilados).
La ecuación general que representa la hidrólisis alcalina de una cera se
muestra a continuación:
Figura 17
104
Capítulo 1
La hidrólisis de las ceras es de gran utilidad cuando se
necesita estudiar la composición de los ácidos grasos
y alcoholes presentes en las ceras.
Figura 18
Glicéridos
Las reacciones químicas en que participan los glicéridos han sido estudiadas debido a que presentan un gran valor para la industria y la civilización
humana.
Cabe señalar que la extracción de grasas y aceites, marcó un precedente
importante en la alimentación humana y su refinamiento ha constituido un
paso de avance para disminuir enfermedades por el consumo de colesterol, presentes en estos materiales lipídicos.
Reacciones de los glicéridos
La hidrólisis de los triglicéridos se produce mediante la escisión del enlace
éster, y la formación de ácidos y glicerina.
Ecuación general de hidrólisis ácida de un triglicérido
Figura 19
105
Capítulo 1
La hidrólisis enzimática se produce en presencia de catalizadores biológicos (enzimas lipasas). En los animales se originan en el estómago y el
intestino. En los vegetales y plantes superiores lignificadas, las enzimas
lipasas tienen su máxima actividad en el proceso de germinación de las
semillas oleaginosas.
Ecuación general de hidrólisis enzimática de un triglicérido.
Triglicérido Glicerol Ácido graso
Un ejemplo de la hidrólisis de los triglicéridos en presencia de enzimas
lipasas puede ser representado por la siguiente ecuación química.
Figura 21
106
Capítulo 1
Saponificación
El jabón es una mezcla sales de metales alcalinos (usualmente sales de
sodio), provenientes de ácidos de 16 a 18 átomos de carbono; pero
pueden contener sales de sodio de ácidos carboxílicos de baja masa
molecular.
La preparación o manufactura del jabón no ha cambiado; desde sus
inicios hasta hoy, se usan las mismas técnicas, se trata la grasa o aceite
con disolución de NaOH al 40%, mediante la reacción conocida como
Saponificación; por tanto, se produce la hidrólisis de los triglicéridos.
Formando ácidos grasos y glicerol o glicerina, los ácidos se convierten en
sales en presencia de una base.
Figura 22. Ecuación general de saponificación de un triglicérido.
Los aceites se conviertan en mezclas de sales de ácidos grasos insaturados
y la glicerina.
En la antigüedad, cuando no se conocía la sosa (NaOH), se utilizaban cenizas
de madera, las cuales contienen potasio en forma de carbonatos (K2CO3), y
estas sales proporcionaban el medio alcalino para producir la reacción de
saponificación. El jabón es purificado en agua en la temperatura de ebullición,
precipitado, secado en moldes, adicionados varios aditivos, como perfumes,
sustancias medicinales, bactericidas etc.
107
Capítulo 1
3.2.8 Importancia biológica de los lípidos
Los lípidos simples como las ceras presentan gran importancia en las
plantas ya que cumplen funciones como las recubrir las hojas para evitar
la transpiración y evitan el ataque de plagas y enfermedades cuando se
encuentran en la corteza de las diferentes especies forestales.
Los glicéridos forman parte de la doble membrana que tapa las células
animales, forman el tejido adiposo en los animales y el hombre formando un material de reserva y que constituyen fuentes de ácidos grasos
esenciales para la alimentación; mediante su degradación o catabolismo
reportan energía metabólicamente aprovechable en forma de ATP ( trifosfato de adenosina )
Fosfolípidos
Los fosfolípidos son lípidos hidrolizables, debido a que contienen la función éster y son lípidos compuestos que rinden por hidrólisis, glicerol,
ácidos orgánicos grupos fosfatos y otros compuestos. Estos compuestos
usualmente contiene dos grupos ésteres formados por ácidos grasos y un
enlace éster con el grupo fosfato en el átomo de carbono tres.
La particularidad de los fosfoglicéridos es que sus moléculas contienen
dos largas cadenas hidrofóbicas y un grupo hidrofílico altamente polar
(un grupo que constituye un ión dipolar). Los fosfoglicéridos son por esta
razón surfactantes neutrales.
FIGURA 23 L-lecitina
L-cefalina
La lecitina y cefalina son dos tipos de fosfoglicérido que se encuentran en
el cerebro, en las células nerviosas, en el hígado, yema de huevo, germen
de trigo, levadura de soya y otros compuestos.
108
Capítulo 1
Esteroides
Los esteroides son lípidos no hidrolizables, no saponificables en general, que contienen una estructura
química muy particular, que presenta cuatro anillos
condensados, designados por A, B, C, D. Los átomos
de carbono son enumerados, como se muestra en la
estructura siguiente.
Figura.24 Fórmula semidesarrollada del colestano
Varios esteroides pueden ser considerados como derivados del colestano.
Observe que en esta estructura aparece la estructura base del perhidrociclopentanofenantreno.
Los esteroides se encuentran encontrados en casi todos los tejidos de los
organismos vivos. Muchos esteroides actúan como hormonas en animales
y el hombre.
Dentro del grupo de esteroides el colesterol es un importante componente
de las membranas celulares en los animales superiores y es un intermediario necesario en la biosíntesis de hormonas esteroidales. Sin embargo,
éste puede ser sintetizado a partir del acetil coenzima A, y no es necesario como suplemento en la dieta. Altos niveles de colesterol en sangre
están asociados con la ateroesclerosis (endurecimiento de las arterias).
Otros esteroides, como la cortisona y cortisol son ampliamente utilizados
para el tratamiento de la inflamación debida a procesos alérgicos o artritis
reumatoidea.
Los andrógenos, estrógenos y progesterona son compuestos esteroidales,
así como los ácidos biliares. Cumpliendo funciones de regulación sexual,
reproductivo y en caso de éste último, se combinan con sales de sodio
de la glicina en el intestino, los que propician la formación de agente
emulsificantes, facilitando la digestión.
109
Capítulo 1
Figura 25 Esteroides
3.3 RAP* Determinación de las características estructurales y
funcionales de los ácidos nucleicos mediante pruebas analíticas
para interpretar su comportamiento en seres vivos y en procesos
bioquímicos industriales.
Los Ácidos Nucleicos son las biomoléculas portadoras de la información
genética. Son biopolímeros, de elevado peso molecular, formados por otras
subunidades estructurales o monómeros, denominados Nucleótidos. Desde
el punto de vista químico, los ácidos nucleicos son macromoléculas formadas
por polímeros lineales de nucleótidos, unidos por enlaces éster de fosfodiester,
sin periodicidad aparente. De acuerdo con la composición química, los
ácidos nucleicos se clasifican en Ácidos Desoxirribonucleicos (ADN) que se
encuentran residiendo principalmente en el núcleo celular y algunos organelos,
y en Ácidos Ribonucleicos (ARN) que actúan en el citoplasma.
El conocimiento de la estructura de los ácidos nucleicos permitió la elucidación
del código genético, la determinación del mecanismo y control de la síntesis
de las proteínas y el mecanismo de transmisión de la información genética de
de la célula madre a las células hijas.
110
Capítulo 1
3.3.1 Historia del ADN El descubrimiento de los ácidos nucleicos se debe a Meischer (1869), el
cual trabajando con leucocitos y espermatozoides de salmón, obtuvo una
sustancia rica en carbono, hidrógeno, oxígeno, nitrógeno y un porcentaje
elevado de fósforo. A esta sustancia se le llamó en un principio Nucleína,
por encontrarse en el núcleo.
Años más tarde, se fragmentó esta nucleína, y se separó un componente
proteico y un grupo prostético; este último, por ser ácido, se le llamó
Ácido Nucleico.
En los años 30, Kossel comprobó que tenían una estructura bastante
compleja.
En 1953, James Watson y Francis Crick, descubrieron la estructura tridimensional de uno de estos ácidos, concretamente del Ácido Desoxirribonucleico (ADN).
El modelo de la Doble Hélice propuesto por Watson y Crick está basado
en estudios del ADN en disolución (hidratado). La denominada forma B o
ADN-B tiene un mayor interés biológico ya que es la que presenta el ADN
en interacción con las proteínas nucleares. Además de la forma B, existen
otras estructuras posibles que puede presentar el ADN. Algunas de estas
alternativas son las siguientes:
• ADN-B: ADN en disolución, 92% de humedad relativa, se encuentra
en soluciones con baja fuerza iónica, se corresponde con el modelo
de la Doble Hélice.
• ADN-A: ADN con 75% de humedad, requiere Na, K
o Cs como
contraiones, presenta 11 pares de bases por giro completo y 23 Å de
diámetro. Es inte
111
Capítulo 1
resante por presentar una estructura parecida a la de los híbridos
ADN-ARN y a las regiones de autoapareamiento ARN-ARN.
• ADN-C: ADN con 66% de humedad, se obtiene en presencia de iones Li, muestra 9+1/3 pares de bases por giro completo y 19 Å de
diámetro.
• ADN-Z: doble hélice sinistrorsa (enrollamiento a izquierdas), 12 pares
de bases por giro completo, 18 Å de diámetro, se observa en segmentos de ADN con secuencia alternante de bases púricas y pirimidínicas (GCGCGC), debido a la conformación alternante de los residuos
azúcar-fosfato, sigue un curso en zig-zag. Requiere una concentración
de cationes superior a la del ADN-B, y teniendo en cuenta que las proteínas que interaccionan con el ADN tienen gran cantidad de residuos
básicos sería posible que algunas convirtieran segmentos de ADN-B
en ADN-Z. Las posiciones N7 y C8 de la Guanina son más accesibles.
Figura 26. James Watson y Francis
Crick con su modelo de DNA.
3.3.2 Los ácidos desoxirribonucleicos (DNA)
Existen dos tipos de ácidos nucleicos: el ácido ribonucleico (RNA) y el ácido
desoxirribonucleico (DNA); la diferencia entre estas moléculas es por el tipo
de azúcar que contienen y de ahí su nombre: en el RNA el anillo de pentosa
presenta un grupo OH (Figura. 27a) en la posición 2 mientras que en el DNA se
pierde un oxigeno, quedando solo un H en la misma posición (Figura.27b). La
composición de bases en ambas moléculas es prácticamente la misma, solo
que en el RNA encontramos U en lugar de T.
112
Capítulo 1
Figura 27 La desoxirribosa y la ribosa son los azucares presentes, tanto en el DNA
como en el RNA, respectivamente.
3.3.3 Características de la estructura del DNA
La estructura del DNA presenta las siguientes características:
La molécula de DNA está formada por dos cadenas de polinucleótidos
enrolladas alrededor de un mismo eje, formando una doble hélice. Esta
estructura tiene semejanza a una escalera de «caracol». La unión entre
los nucleótidos es principalmente por un enlace fosfodiester.
Las dos cadenas complementarias de polinucleótidos
en el DNA son anti­
paralelas, ya que una de las cadenas empieza por el extremo donde se encuentra el
residuo 5’, mientras que la otra lo hace por el extremo
donde se encuentra el residuo 3’ (3´significa que en ese
Figura 28. Enlace fosfodiester entre dos
extremo, la desoxirribosa tiene el –OH del carbono 3´
nucleótidos.
libre y 5´ se refiere al carbono 5´de la desoxirribosa que
llevará el fosfato).
Las bases nitrogenadas de los nucleótidos se orientan
hacia el interior de la doble hélice, mientras que los
grupos fosfato y las moléculas de azúcar se orientan
hacia el exterior conformando un esqueleto azúcarfosfato.
113
Capítulo 1
Figura
29.
Bases
púricas y pirimídicas
componentes
básicos de los acidos nucleicos.
Las bases de ambas cadenas están unas frente a otras y se unen a través
de puen­
tes de hidrógeno: dos entre la adenina y la timina (A=T) y tres
entre la guanina y la citosina (G Ξ C).
Figura 30. Enlaces
presentes entre las
bases púricas y pirimídicas.
La longitud de cada vuelta en la hélice es de 3.4 ηm
Figura 31 El DNA está compuesto por
dos cadenas antiparalelas, una que va
de 5´ a 3´ y otra en sentido contrario.
114
Capítulo 1
La distancia entre un par de nucleótidos y otro es de 0.34 ηm; por lo
tanto, en cada vuelta debe haber 10 pares de nucleótidos.
Figura 32. Distintos
tipos
de
cadenas
de DNA.
3.3.4 Ácido ribonucleico (RNA)
Los ácidos ribonucleicos son polímeros lineales de ribonucleótidos de
cadena sencilla (pesos moleculares menores). Son mucho más cortos que
los ADNs, pero también más abundantes (de un mismo ARN se pueden
encontrar muchas copias). El esqueleto covalente del ARN consiste en un
polímero lineal de unidades de ribonucleótidos unidos mediante enlaces
fosfodiéster 5’®3’. En este aspecto es idéntico al DNA, pero el RNA se
diferencia estructuralmente del DNA en tres puntos:
o El azúcar del RNA es la ribosa y no la 2’-desoxiribosa.
o La timina se sustituye por uracilo en lo referente a las bases nitrogenadas. La timina posee un grupo metilo en el C-5, mientras que en
el uracilo se sustituye por un H. Las otras bases son comunes al DNA,
adenina, guanina y citosina.
o Las moléculas de RNA son generalmente monocatenarias.
115
Capítulo 1
Figura 33. Diferencias entre el RNA y el DNA
116
Capítulo 1
3.3.5
Principales tipos de RNA
• RNAm (RNA mensajero) : Es una molécula de una sola banda larga que
contiene los codones que serán traducidos en una secuencia de aminoácidos de una proteína. Su objetivo en las células eucarióticas es que las
moléculas de RNAm sean sintetizadas en el núcleo y lleguen al citoplasma
a través de los poros de la envoltura nuclear. En el citoplasma, el RNAm es
traducido al idioma de los aminoácidos contenidos en las proteínas.
• RNAr (RNA ribosomal) : Forma una parte importante de la síntesis proteica
de un ribosoma, los cuales están compuestos de RNAr y una gran cantidad
de proteínas. Cada ribosoma se compone de dos subunidades. En las células eucarióticas, la subunidad pequeña consta de una molécula de RNAm
y 30 proteínas aproximadamente. Reconoce y se une al RNAm y RNAt. La
subunidad ribosomal grande consta de tres moléculas de RNAm y de 45 a
50 proteínas. Su función es el reconocimiento de RNAm y la canalización
de la formación de uniones peptídicas entre los aminoácidos de la proteína.
• RNAt (RNA de transferencia) : Esta molécula decodifica la secuencia de
bases del RNAm en una secuencia aminoacídica de una proteína. Unen
aminoácidos y los entregan al ribosoma donde son incorporados en cadenas proteicas. Hay muchos tipos de RNAt y son las únicas moléculas en
la célula que pueden descifrar los codones del RNAm y traducirlos a los
aminoácidos de las proteínas.
Figura 34. Principales estructuras del RNA
117
Capítulo 1
Prácticas 1 y 2
Solubilidad de carbohidratos
Carbohidratos
Los carbohidratos son en general más solubles en agua
y solventes inorgánicos y menos solubles o insolubles en
solventes inorgánicos.
• Glucosa
• Fructosa
• Xilosa
Reactivos
- Agua destilada
• HCl 5%
• NaOH 5%
• Etanol
• Cloroformo
C 27,06 / M 100 / Y 100 / N 27,84
Procedimiento
Coloca aproximadamente 15 mg de
cada uno de los carbohidratos en tubos
etiquetados y examina su solubilidad
16,86en agua, NaOH diluido, ácido diluido,
etanol y cloroformo, añadiendo 2ml de
solvente.
C 19,61 / M 10,98 / Y 19,61 / N 0
Resultados
C 44,71 / M
41,96 / Y 100 / N
C 69,02 / M 53,73 / Y 34,51 / N 10,2
C 100 / M 90,98 / Y 32,55 / N 22,35
Observaciones
118
Capítulo 1
Prueba de Bial para pentosas
Cuando se calienta pentosas con HCl concentrado se forma furfural que
se condensa con orcinol (3,5-dihidroxitolueno), en presencia de iones férricos para dar un complejo coloreado.
Reactivos
-• Reactivo de Bial. Disolver 1.5 g de
orcinol en 500 ml. De HCl concentrado.
• Agregar a esta solución 20 gotas
de FeCl3. Guardar en frasco ámbar.
Solución de carbohidratos:
• Glucosa: 1g/100 ml
• Xilosa: 1g/100 ml
• Agua destilada.
Actividad
Procedimiento
1. Rotular los tubos de ensaye con el nombre del carbohidrato, agua y el nombre de
la prueba (Bial).
2. Pipetear 1ml de la muestra (sol. de carbohidrato) y de agua destilada al tubo de
ensaye correspondiente, y 2.5 ml de reactivo de Bial.
3. Colocar en baño de agua hirviente hasta
la aparición de color, y sacar inmediatamente.
4. Dibuje los resultados.
Explique y dibuje que es un monosacárido y un disacárido.
Monosacárido:
Disacárido:
119
Capítulo 1
Práctica 3
Determinación del índice de iodo
Se denomina índice de iodo la cantidad de gramos de iodo que pueden
combinarse con 100 g de grasa. Este número permite evaluar el grado de
insaturación de la grasa provocado por la presencia de glicéridos con ácidos grasos de dobles enlaces, la capacidad de la grasa para la oxidación,
para la reducción y otras reacciones. Cuanto mayor es el contenido de
ácidos grasos no saturados en la grasa, tanto mayor es su índice de iodo.
El índice de iodo de algunas grasas y aceites oscila dentro de los siguientes
límites:
• de res, 27—47;
• de carnero,31—46;
• de cerdo, 46—66;
• aceite de girasol,
• aceite de linaza, 175—201.
C 27,06 / M 100 / Y 100 / N 27,84
Equipo y material
C 19,61 / M 10,98 / Y 19,61 / N 0
- Tubos de ensayo
- Gradillas
C 44,71
/M
41,96
- Pinzas para
tubos de
ensayo
- Pipetas graduadas
• En
/ Y 100 / N 16,86
Procedimiento
un matraz (prueba experimental)
se pone 0.1 g de aceite de girasol
(se pesa en una balanza analítica),
C 69,02 / M 53,73 / Y 34,51 / N 10,2
en el otro (prueba de control) 0.1 mi
de agua, y se añaden de la bureta 5
ml de cloroformo en cada uno.
C 100 / M 90,98 / Y 32,55 / N 22,35
Reactivos
• Cuando la muestra de aceite sea
disuelta, en los matraces se añaden
- Aceite de girasol
con la pipeta 10 ml (¡exactamente!) de
- Cloroformo
disolución 0.1 N de iodo en alcohol,
- Iodo disolución 0.1 N en alcohol
los matraces se cierran con tapones,
(12.691 g de iodo se disuelven en
el contenido se remueve agitándolo,
1 L de alcohol etílico al 96%)
y los se dejan en la oscuridad.
- Tiosulfato sódico 0.1 N
- Disolución al 1% de almidón
120
Capítulo 1
Procedimiento
• Al cabo de 5 min las pruebas se evalúan, agitando
permanentemente, con disolución de tiosulfato sódico
0.1 N, primero hasta que la coloración se ponga amarilla
clara, y luego al añadir 1 ml de disolución de almidón
al 1%, desaparición de la coloración azul.
El índice de iodo (x,g) se calcula según la fórmula:
(b – a) × N × mEq × 100
Índice de yodo= ___________________________
P
• donde b es el volumen de disolución de tiosulfato sódico 0.1 N,
consumido en la valoración de la prueba de control en ml;
• a es el volumen de la disolución de tiosulfato sódico 0.1 N consumido
en la valoración de la prueba experimental, en ml;
• N es el coeficiente de corrección del título de la disolución 0.1 N
de tiosulfato sódico;
• mEq = 0.01269 es la cantidad de iodo (g) equivalente a 1 ml de
disolución de tiosulfato sódico 0.1 N;
• 100 es el coeficiente de recuento para los 100 g de grasa;
• P es la muestra pesada de grasa, g.
Determinar el índice de iodo para las muestras indicadas y anotar los
resultados.
121
Capítulo 1
Autoevaluación
Sección I. Lee con atención los siguientes enunciados subraya la respuesta correcta en los casos de opción múltiple y en los otros seguir la instrucción que
se indica.
1. Los glúcidos están formados por:
a) Aminoácidos
b) Monosacáridos
c) Ácidos grasos
d) Nucleótidos
2. Los monómeros que forman las proteínas se llaman:
Actividad
a) Aminoácidosb) Monosacáridos
b) Ácidos grasos
d) Nucleótidos
3. ¿Cuál de las siguientes funciones no es llevada a cabo por el agua?
a) Transporte de sustancias
b) Energética
c) Capacidad de amortiguación térmica
d) Disolvente de muchas sustancias
4. Las biomoléculas que están formadas de nucleótidos y grupos fosfato son:
a) Los ácidos nucleicos
b) Los glúcidos
b) Las proteínas
d) Las sales minerales
5. La sacarosa es el azúcar de caña que empleamos en nuestras casas y se trata
de:
a) Un monosacárido
b) Un disacárido
c) Un polisacárido estructural
d) Un polisacárido de reserva
Práctica
6. El polisacárido de almacenamiento de energía en las células animales es:
a) La glucosa
b) La celulosa
c) El almidón
d) El glucógeno
122
Capítulo 1
7. ¿Qué tipo de lípido forma parte de las membranas celulares?
a) Fosfolípidos
b) Esteroides
c) Ceras
d) Triglicéridos
8. ¿Qué son los anticuerpos?
a) Proteínas con función de transporte
b) Lípidos con una función protectora
c) Proteínas con una función defensiva
d) Lípidos que no desempeñan ninguna función en nuestro cuerpo
9. ¿Qué diferencia existe en la composición química del adn y arn?
a) En el azúcar y en que el ADN presenta timina y el ARN uracilo
b) Sólo en el azúcar, ya que el ADN presenta ribosa y el ARN desoxirribosa
c) En el azúcar y en que el ARN presenta timina y el ADN uracilo
d) Sólo en el azúcar, ya que el ARN presenta ribosa y el ADN desoxirribosa
10. Si en un pequeño fragmento de una cadena de adn tenemos la siguiente
secuencia de bases nitrogenadas: acacga, ¿cuál será la secuencia en la cadena
complementaria?
a) UGUGCU
b) TGTGCT
c) ACACGA
d) Ninguna de las anteriores respuestas es verdadera
11. ¿Cuál de las siguientes afirmaciones es falsa?
a) El ARN no tiene estructura de doble hélice
b) Los lípidos son insolubles en agua
c) Los glúcidos son solubles en agua
d) Las proteínas son utilizadas por nuestras células fundamentalmente como fuente de energía
12. Los lípidos que tienen una función energética son:
a) Los triglicéridos
b) Las ceras
c) Los fosfolípidos
d) Todas las anteriores son verdaderas
13. Elabora un dibujo de un disacárido que no se haya visto en clase.
14 Escribe la fórmula general de un aminoácido.
123
Capítulo 1
15 ¿Qué tipo de isómero forma parte de las proteínas?
¿A qué se debe esta isomería?
16 ¿Por qué a ph ácido (ej: 2.3) un aminoácido neutro
tiene carga positiva?
17 ¿Qué entiendes por punto isoeléctrico de un
aminoácido? y ¿de una proteína?
18- Esquematiza la formación del enlace peptídico.
¿Qué características resaltarías en este enlace?
19 ¿Cómo definirías a la estructura primaria de una
proteína? ¿Qué enlace la mantiene?
20 ¿Qué tipos de estructuras secundarias conoces?
21 ¿Qué tipo de estructura terciaria conoces?
22. ¿Cómo definirías a una proteína conjugada? ¿Cuál
es su grupo prostético?
23. Enumera 3 ejemplos de proteínas con diferentes
funciones
24 ¿Qué diferencias establecerías
simples y compuestas? (conjugadas).
entre
proteínas
25 ¿Entre las proteínas filamentosas y las globulares?
26. ¿Cuál es la composición química de las enzimas?
27. ¿Qué función desempeñan?
28 - ¿Qué nombre recibe el componente proteínico de
las holoenzimas?
29- ¿Cómo actúa una enzima en una reacción? ¿Altera
la constante de equilibrio? ¿Se gasta en la reacción?
124
Capítulo 1
30. ¿Qué se entiende por energía de activación?
31. ¿Qué entiendes por especificidad enzimática?
32. ¿Qué es el sitio activo de una enzima?
33- ¿Cómo puedes explicar la velocidad que alcanzan las
reacciones catalizadas por enzimas?
34. ¿Qué significa que las enzimas son termolábiles?
35. ¿Qué son las isoenzimas? y ¿las enzimas alostéricas?
36. ¿Qué importancia biológica tiene el proceso de
inhibición enzimática?
37. Diferencia la inhibición irreversible de la reversible.
38. Diferencia la inhibición competitiva de la no competitiva.
39-Explica cómo se forma el enlace peptídico y pon un
ejemplo concreto.
40. ¿Qué es la estructura secundaria de las proteínas?
¿Cómo se mantiene estable?
41-¿Cómo es la estructura cuaternaria de la “hemoglobina”
y cómo se mantiene estable?
42.Indica las principales funciones de las proteínas y pon
ejemplos.
43-Indica los componentes de un nucleótido y representa
uno de ARN y otro de ADN.
44-Explica la doble hélice de Watson y Crick, para el ADN.
45-¿Cuáles son las diferencias entre el ADN y el ARN, en
cuanto a composición química, estructura y función?
125
Capítulo 1
Lee con atención los siguientes enunciados y subraya la
respuesta correcta.
1. De acuerdo con el número de átomos de carbono, ¿Cuál
es la denominación para un monosacárido?
a) Polisacáridos
b) Pentosa
c) Aldosa
d) Catosa
2- ¿Cuál de las siguientes opciones es dos monosacáridos
ciclados que se resaltan sólo en el grupo OH? C
a)enantiómero
b)epímeros
c)anómeros
d)triosa
3-¿Por cuántas moléculas de monosacáridos están formados
los disacáridos? C
a)5
b)10
c)2
d)3
4- Se optiene por hidrólisis del almidón con la enzima
maltaza b
a)Sacarosab) Maltosa
c)Lactosa
d)Monosacáridos
5- Conjunto de moléculas de monosacáridos a través de
enlaces glicosídicos
a)Proteínas
b)Polisacáridos
c)Lactosa
d) Ninguna de las anteriores
6- De acuerdo con la funcion biológica de los polisacáridos
¿qué grupo se define como los glúsidos que participan en la
edificación de estructuras orgánicas? A
a)Estructurales
126
Capítulo 1
b)Simples
c) de reserva
d)Primarias
7- La molécula del almidón se clasifica en dos tipos.
a) Anoméricos y covalentes
b) Simples y compuestas
c) maltosa y lactosa
d) Amilosa y amilopectina
D
8- Los lípidos simples se caracterizan por a
a) Fusión éster
b)Incoloros
c) carbosilos
d)Sólidos
9- Es la propiedad fisica de los lípidos que forma esteres con
grupos de alcohol de otras moleculas. B
a) Anfipático
b)Esterifacación
c) Punto de fusión
d)Autooxidación
10-¿Cómo se determinan las propiedades fisicas de los
lipidos? D
a) Grados centígrados
b) Índice de carbono
c) Índice molecular
d) Índice de yodo
11- Son mezclas de esteres de alta masa molecular, están
formadas por ácidos grasos y alcoholes monohidroxilados- b
a)Glicéridos
b)Ceras
c)Lípidos
d) Ácidos grasos
12-¿Cuál de las opciones es saponificacion?
a)Cera
b)Jabón
c)Lípido
d)Papel
B
127
Capítulo 1
13- Dentro del grupo de esteriodes que componente
membranas celulares. A
a)Aceite
b) Jabón
c)Colesterol
d)Cortisona
es importante
para las
14- De acuerdo con la composición química, los ácidos nucleicos se clasifican
en: a
a) ADN y AM
b) AND y ATM
c) ARN y AND
d) ADN y ATM
15- ADN en disolución, 92% de humedad relativa, se encuentra en soluciones
con baja fuerza iónica, se corresponde con el modelo de la doble hélice. B
a)ADN-a
b) ADN -b
c) ADN -c
d) ADN -z
16- La distancia entre un par de nucleótidos y otro es de 0.34 ηm; por lo
tanto, en cada vuelta hay. D
a) 2 pares
b) 5 pares
c) 13 pares
d) 10 pares
128
Capítulo 1
17-¿Cuál es el nombre de la siguiente de las diferencias del rna del adn; es
ribosa y no de 2 desoxiribosa? C
a) La timina
b) Las moléculas del rna
c) El azúcar del rna
d) Ninguna de las anteriores
18- ¿Cuál es la molécula de ARN que forma parte de la síntesis proteica en un
ribosoma?
a) ARN – m
b) ARN – t
c) ARN – r
d) ARN – z
19- La molécula de dna está formada por dos cadenas de a
a)Polinucleótidos
b)Átomos
c)Autoxidación
d)Tianina
20- Están formados por dos moléculas de monosacáridos que pueden ser
iguales o diferentes. C
a)Polisacáridos
b)Monosaáaridos
c)Disacáridos
d)Megasacáridos
129
Capítulo 1
Instrucciones Lee con atención los siguientes enunciados y
subraya la respuesta correcta
1. ¿Qué estudia la bioquímica?
(a) Es la ciencia que estudia los organismos vivos
(b) Estudia las transformaciones en los compuestos orgánicos
(c) Estudia las sustancias presentes en los organismos vivos y sus
reacciones químicas
(d) Es la ciencia que estudia los productos organometálicos
2. Los gúcidos están formados por:
(a) Aminoácidos
(b) Monosacáridos
(c) Ácidos grasos
(d) Nucleótidos
3. Los monómeros que forman las proteínas se llaman.
(a) minoácidos
(b) Monosacáridos
(c) Ácidos grasos
(d) Nucleótidos
4.¿cuál de las siguientes funciones no es llevada a cabo por el agua?
(a) Transporte de sustancias
(b) Energética
(c) Capacidad de amortiguación térmica
(d) Disolvente de muchas sustancias
5. Las biomoléculas que están formadas de nucleótidos y grupos fosfatos
son:
(a) Los ácidos nucleicos
(b) Los glúcidos
(c) Las proteínas
(d) Las sales minerales
6. La sacarosa es el azúcar de caña que empleamos en nuestras casas
y se trata de:
(a) Un monosacárido
(b) Un disacárido
130
Capítulo 1
(c) Un polisacárido estructural
(d) Un polisacárido de reserva
7. El polisacárido de almacenamiento de energía en las células animales es:
(a) La glucosa
(b) La celulosa
(c) El almidón
(d) El glucógeno
8. ¿Qué tipo de lípido forma parte de las membranas celulares?
(a) Fosfolípidos
(b) Esteroides
(c) Ceras
(d) Triglicéridos
9. ¿Qué son los anticuerpos?
(a) Proteínas con función de transporte
(b) Lípidos con una función protectora
(c) Proteínas con una función defensiva
(d) Lípidos que no desempeñan ninguna función en nuestro cuerpo
10. ¿Qué diferencia existe en la composición química del adn y rna?
(a) En el azúcar y en que el ADN presenta timina y el ARN uracilo
(b) Sólo en el azúcar, ya que el ADN presenta
ribosa y el ARN
desoxirribosa
(c) En el azúcar y en que el ARN presenta timina y el ADN uracilo
(d) Sólo en el azúcar, ya que el ARN presenta ribosa y el ADN desoxirribosa
11. ¿Cuál de las siguientes aseveraciones es falsa?
(a) El ARN no tiene estructura de doble hélice
(b) Los lípidos son insolubles en agua
(c) Los glúcidos son solubles en agua
(d) Las proteínas son utilizadas por nuestras células fundamentalmente
como fuente de energía
12. Los lípidos que tienen una función energética son?
(a) Los triglicéridos
(b) Las ceras
(c) Los fosfolípidos
(d) Todas las anteriores son verdaderas
131
Capítulo 1
13. ¿Cuál es el enlace peptídico de una proteína?
(a) Es el plegamiento regular local entre residuos de aminoácidos cercanos de la cadena polipeptídica
(b) Es el enlace covalente entre el grupo amino (–NH2) de un aminoácido y el grupo carboxilo (–COOH) de otro aminoácido.
(c) Es la estructura primaria de las proteínas que radica en la secuencia de sus aminoácidos y que componen la cadena polipeptídica
(d) Es la estructura secundaria de las proteínas entre residuos de aminoácidos cercanos de la cadena polipeptídica
14. ¿Cuáles son las enzimas conjugadas?
(a) Son aquellas que constan solo de una estructura proteica. Pueden
estar formadas por una o varias cadenas polipeptídicas.
(b) Son las que tienen una especificidad hacia su sustrato como una
de las características más notables
(c) Son aquellas que poseen en su estructura una parte no proteica
denominada cofactor y una parte proteica que se denomina apoenzima.
(d) Son moléculas enormes que interactúan con el sustrato en general
cinco o seis aminoácidos.
15. ¿Cuáles son los grupos prostéticos?
(a) Son los que funcionan como portadores de grupos químicos pequeños como el acetilo, metilo o bien protones y electrones
(b) Son moléculas orgánicas que están fuertemente unidas a la apoenzima
(c) Son aquellas que derivan de vitaminas solubles en agua
(d) Son aquellos que interaccionan entre la enzima y su sustrato
16. ¿Cuál es el mecanismo de la actividad catalítica de una enzima?
(a) El sitio activo se modifica para hacerse complementario al sustrato
(b) Se debe a la especificidad de una enzima hacia su sustrato
(c) El rompimiento y formación de los enlaces entre las cadenas laterales
de la enzima y los enlaces dentro del sustrato
(d) Se debe a la unión de la molécula de sustrato al sitio activo de
la enzima
132
Capítulo 1
17. ¿Cuál es la diferencia entre el ácido ribonucleico (ARN) y el ácido desoxirribonucleico?
(a) La timina
(b) Las moléculas del rna
(c) El azúcar de rna
(d) Ninguna de las anteriores
18. ¿Cómo se descomponen los disacáridos en sus monosacáridos?
(a) A través de calentamiento.
(b) Mediante el cambio del pH
(c) Utilizando una enzima específica
(d) Utilizando un oxidante
19. ¿Cómo se observa la maltosa o azúcar de malta?
(a) A partir de la sacarosa
(b) Por hidrólisis del almidón con la enzima maltasa
(c) Por extracción de algunas plantas
(d) Por evaporación del suero lácteo
20. ¿Cuál es el enlace glucosídico?
(a) Es el enlace anomérico de un monosacárido
(b) Es el enlace para unir monosacáridos con el fin de formar disacáridos o polisacáridos.
(c) Es el enlace dicarbonílico, que se establece entre los dos carbonos
anoméricos de dos monosacáridos
(d) Es el enlace de los glúcidos que participan en la construcción de
estructuras orgánicas.
133
Capítulo 1
Respuestas a la autoevaluación
134
Sección I
1.(b)
2.(a)
3.(b)
4.(a)
5.(b)
Sección II
1.(b)
2.(c)
3.(c)
4.(b)
5.(b)
6.(d)
7.(a)
8.(c)
9.(d)
10.(a)
11.(d)
12.(a)
6.(a)
7.(d)
8.(a)
9.(b)
10.(d)
11.(b)
12.(b)
13.(a)
14.(a)
15.(b)
16.(d)
17.(c)
18.(c)
19.(a)
20.(c)
Capítulo 1
Sección III
1.(c)
2.(b)
3.(a)
4.(b)
5.(a)
6.(b)
7.(d)
8.(a)
9.(c)
10.(d)
11.(d)
12.(a)
13.(b)
14.(c)
15.(b)
16.(d)
17.(a)
18.(c)
19.(b)
20.(b)
135
Capítulo 2
136
Capítulo 2
Capítulo 2 Análisis de procesos
microbiológicos
Propósito
Conoce, determina muestras y comportamientos de
los organismos, para su reproducción y control de los
mismos, en laboratorios y en la industria.
137
Capítulo 2
138
Capítulo 2
Introducción
Para determinar la carga microbiana como medio preventivo, se puede
realizar una inspección por medio de un análisis microbiológico de
alimentos.
Entonces, no se puede lograr un aumento de la calidad microbiológica
mediante el análisis microbiológico, por lo que es más pertinente, determinar
en la Industria cuáles son los puntos de riesgo, tanto en la contaminación
o la multiplicación microbiana (a los cuales llamaremos Puntos Críticos
del proceso) y anularlos siguiendo un código estricto de Buenas Prácticas
de Elaboración y Distribución del alimento (BPE).
Al evitar el uso de productos de baja calidad en la manufactura, estamos
contribuyendo con la prevención para evitar la baja calidad microbiológica
de los ya elaborados (con esto se presenta una relación costo beneficio
muy baja, cuando se analiza una gran cantidad de muestras).
139
Capítulo 2
140
Capítulo 2
Unidad 1 Preparar muestras de materia prima para
su análisis microbiológico
1.1 RAP Identifica las características generales de la preparación de muestras, así como los procedimientos y valores
de referencia
1.1.1 Generalidades sobre la toma de muestras y el análisis
microbiológico de los productos finales
Cuando es desigual la distribución de los microorganismos en las muestras, se hace necesario continuar un esquema de toma de muestras para
obtener resultados representativos.
El primer paso para la toma de muestras es seleccionar los puntos de muestreo y con la ayuda de un muestreador microbilógico se recoge la muestra y
se lleva a una caja Petri previamente preparada con un agar adecuado a los
microorganismos que se deseen evaluar. La distribución de la muestra en la
caja Petri se puede llevar a cabo extendiendo la muestra en líneas formando
un ángulo o en puntos distribuidos homogéneamente en todo el espacio de la
caja Petri, Figura 1.
Esquema 1: Caja de petri donde se pueden
observar diversos microorganismos de una
sola muestra.
141
Capítulo
Capítulo 2
2
En la Figura 2 se muestran los diferentes tipos de microorganismos que se
pueden encontrar en un muestreo de control de alimentos, exudados fluidos
corporales etc.ras.
Esquema 2: Los
diversos tipos de
microorganismos.
142
Capítulo 2
1.1.2 Fundamentos de los procedimientos analíticos
La variedad en la presencia de microorganismos en los alimentos es un
factor muy importante en el análisis, por lo cual este muestreo incluye:
(a) Que para evitar la distorsión provocada por los microorganismos, es
necesario evaluar la muestra que encontramos dentro de la superficie
de canales, máquinas o sistemas de alimentos diversos como ensaladas,
platos, congelados, entre otros.
(b) Remover el microorganismo muestra de una manera óptima el lugar
adoptado como parte del muestreo.
(c) La evitación de la contaminación ambiental durante la toma o
transporte de muestras.
Transporte de muestras: Es importante evitar que durante el transporte
de las muestras se produzca:
• Multiplicación de los microorganismos presentes y;
• Inactivación de algún microorganismo.
1.1.3 Necesidad de valores de referencia
Al comparar los resultados con valores microbiológicos
de referencia, estos valores no pueden ser considerados como muestra típica aceptable, sino que son valores logrados cuando la producción del alimento se ha
ajustado a las BPE (Buenas Prácticas de Elaboración).
La Microbiología de alimentos puede evaluar el riesgo
asociado a estos valores de referencia y cuantificar
los valores asociados a un alimento concreto para
medir su alejamiento de la referencia (y por tanto de
las BPE).
143
Capítulo 2
Unidad 2 Selección y preparación de
muestras microbiológicas
2.1 RAP Conoce y determina los tipos de
muestreo, análisis y muestras representativas, para el uso en laboratorio y la industria
2.1.1 Muestreo único
Cuando se obtiene una muestra de una partida única
de alimento, hay que considerar que los datos importantes son los que proporcionan las normas de elaboración y conservación del alimento. Esto es esencial en
lotes de alimentos importados, y más en los enlatados.
Es claro que ningún muestreo puede dar una garantía
total de calidad microbiológica del alimento; si se analizan un promedio de 30 muestras de un lote grande
y no aparece ninguna en malas condiciones microbiológicas, aún hay una probabilidad razonable de que el
10% del lote sea microbiológicamente malo.
Debe ser una norma general, cuando es un lote desconocido, es pertinente realizar un análisis en un número
de muestras equivalente al 1%, si éste es grande y al
10% si es pequeño, por lo que estos valores hay que
ajustarlos a las condiciones reales.
Cuando la muestra es única el mejor criterio para analizarlo, y darle seguimiento, será de acuerdo con las
especificaciones del fabricante, por lo que las muestras
únicas siempre tendrán una alta probabilidad de falsos
negativos.
144
Capítulo 2
2.1.2 Análisis repetido
Se pueden encontrar dos tipos de riesgo microbiológico: (a) el riesgo de que los que consumen acepten
la probabilidad de lotes substándard y (b) el riesgo
de que el fabricante tenga una alta probabilidad de
rechazo de lotes substándard.
Cuando hay 10 muestras al azar, puede que en el
muestreo al azar haya un rechazo del lote de productos cuando se detecte un defecto, obligando al fabricante a tomar medidas de seguridad suficientes para
proteger adecuadamente al consumidor.
2.1.3 Toma de muestras representativas
Estadísticamente es representativa la muestra, cuando
se utilizan las tablas de número al azar. En el caso
de alimentos haya que homogeneizar la muestra con
batidoras o mezcladoras, para lograr que esta muestra
sea representativa.
En la Figura 3 se muestra la evolución
de ciertos microorganismos que fueron muestreados y sembrados en la
caja Petri, por lo que se puede realizar
la evaluación de los organismos presentes en la muestra.
Esquema 3
145
Capítulo 2
146
Capítulo 2
Unidad 3 Preparación de métodos de cultivo, soluciones y diluciones; esterilización
3.1 RAP Identifica los diferentes tipos de métodos de cultivo, su preparación, clasificación, para su uso en laboratorios y la industria
3.1.1 Preparación de una muestra para el análisis microbiológico
Al llevar a cabo un análisis, resulta importante llevar la muestra a condiciones adecuadas. La solubilización de la muestra es una operación que
debe realizarse, en gran medida a casi todas éstas; así mismo, cuando
deben analizarse compuestos inorgánicos, la eliminación de compuestos
orgánicos que a veces los acompañan e interfieren en los ensayos de
dichas sustancias inorgánicas. Los métodos mas frecuentes para la preparación de las muestras son la trituración, pulverización y finalmente la
homogenización.
Esquema 4: Trituración de una muestra
empleando un mortero con pistilo.
147
Capítulo 2
3.1.2 Preparación de medios de cultivo
Lo que permite el crecimiento de microorganismos son los medios de
cultivo con una mezcla de nutriente, en concentraciones adecuadas y
en condiciones físicas óptimas, por lo que su control en su fabricación,
preparación, conservación y uso, asegura la exactitud, confiabilidad y
reproducibilidad de los resultados obtenidos dentro de los laboratorios
de microbiología. El cultivo es el crecimiento de poblaciones microbianas
en ambientes artificiales (medios de cultivo) y bajas condiciones de
laboratorio (temperatura, humedad, presión de oxígeno y pH óptimos
para el crecimiento del microorganismo concreto y sin presencia de
microorganismos contaminantes).
3.1.3 Clasificación de los medios de cultivo
Se utilizan diferentes tipos de medios de cultivo que pueden ser preparados
en forma líquida o en forma sólida. Usualmente para preparar un medio
sólido se parte de un medio líquido al que se le añade un agente
solidificante como el agar, la gelatina o la sílicagel.
Medios de cultivo generales. En ellas se da el
crecimiento de una
gran variedad de microorganismos. Se encuentran en esta categoría: las
infusiones de extractos de carne y peptona, una mezcla de composición
similar a la de los líquidos orgánicos, que se utiliza para muchas bacterias
patógenas (causantes de enfermedades).
Medios de cultivo selectivos. Se da el crecimiento de un género o de
una especie concreta de microorganismos. Son útiles para aislar ciertos
microorganismos a partir de una población mixta. Por ejemplo, si a un
cultivo se le añade un inhibidor del crecimiento de bacterias Gram +, como
el cristal violeta, nos aseguramos de que en ese cultivo sólo van a crecer
bacterias Gram-.
148
Capítulo 2
Los medios de cultivo se utilizan en una de las formas siguientes:
Medios Líquidos o caldos de cultivo. Una vez preparados se mantienen
en estado líquido. Se utilizan para realizar la suspensión de disolución de
la muestra por analizar con el fin de conseguir la disolución madre. Pueden presentarse en bolsas de 5 litros, en frascos de 250 ml, o en tubos
de un solo uso.
Medios sólidos. Contiene un agente espesante, por lo general agar, en
una concentración del 1,5 %. El agar es un derivado de algas. Es sólido
en temperaturas inferiores a los 40 o 45ºC.
Medios semisólidos. Tienen una consistencia intermedia entre la de los
anteriores. Suelen contener una concentración de agar del 0,7 %.
Medio de cultivo
Esquema 5: Esquema representativo en la preparación de medios de cultivo.
Los medios de cultivo se pueden preparar en el laboratorio a partir de
cada uno de sus constituyentes básicos o por simple rehidratación de
productos asequibles comercialmente (medios de cultivo deshidratados).
Es más común que se prefiera el uso de los medios de cultivo deshidratados porque simplifican el trabajo, obteniéndose mayor probabilidad de
alcanzar resultados reproducibles.
149
Capítulo 2
Para su preparación se deben tener en cuenta los siguientes aspectos:
• Prepararlos sólo a partir de productos que provengan de fabricantes o proveedores que suministren productos de calidad.
• Utilizar agua destilada o desmineralizada con una calidad microbiológica y físico-química
adecuada.
• Utilizar materiales de vidrio bien lavado y enjuagado con agua destilada o desmineralizada.
• Controlar el tiempo y la temperatura recomendada durante su esterilización.
• Nunca se deben exceder las condiciones señaladas por el fabricante.
3.1.4 Medios de cultivo más utilizados
Medio EMB (Agar de Eosina y Azul de metileno)
Se utiliza para la identificación, diferenciación y aislamiento de enterobacterias; determina la funcionalidad
del medio de cultivo con microorganismos típicos. Por su
composición de lactosa y sacarosa podemos diferenciar
en el primocultivo: salmonellas y shigellas, Proteus vulgaris, Citobacter y Aeromonas.
Desarrollo de microorganismos mediante la selección adecuada del medio
de cultivo puesto en una caja petri
Lo que entorpece el aislamiento de los gérmenes es la microflora, de interés médico y es
ampliamente inhibida por los colorantes de la fórmula, sobretodo la flora Gram positiva. En
este medio también es posible la identificación de Cándida albicans (incubación en CO2) y
a veces se logra asilar Nocardia.
Se compone: Peptona de gelatina (10g), lactosa (5g), sacarosa (5g), fosfato dipotásico (2g), agar
(13.5g), eosina (0.4g) y azul de metileno (0.065g). *pHf = 7.2 ±0.2
Medio Agar de Mac Conkey
Se ocupa para aislar e identificar selectivamente a enterobacterias como salmonellas, shigellas y
coniformes, a partir de heces fecales, orina, aguas negras y diversos alimentos.
Los microorganismos Gram-positivos son acabados por las sales brillantes y el cristal violeta. Las
150
Capítulo 2
enterobacterias fermentadoras de la lactosa disminuyen el pH del medio que
es detectado por el indicador rojo neutro dando colonias rosadas o rojas; Las
no fermentadoras presentan colonias transparentes, incoloras o ambarinas.
Por otro lado, también crecen los bacilos Gram-negativos que no pertenecen a la familia enterobacteriae como pseudomonas y aeromonas.
Éstas pueden desarrollarse en número reducido de colonias puntiformes
de Streptococcus fecales (enterococos) de color rojo y de algunos estafilococos cuyas colonias son pequeñas, opacas de color rosa pálido. Puede
usarse en la diferenciación de Mycobacterium
Su composición: Peptona de caseína (17g), peptona de carne (3g), lactosa
(10g), mezcla de sales biliares(1.5g), NaCl (5g), rojo neutro (0.03g), cristal
violeta (0.001g), agar-agar (13.5g). *pH (37ºC) = 7.1 ±0.1
Sal Manitol Rojo de Fenol
Es selectivo y muy empleado para aislar estafilococos patógenos de materiales clínicos diversos (orina, genitales, heridas, exudados faríngeos, etc.).
La degradación del manitol con producción de ácidos cambia el color del
medio de rosado a amarillo. Debido a su gran contenido de NaCl, puede
hacerse una siembra masiva del material en estudio.
Por lo general se incuban las placas unas 36 hrs; pasado el tiempo, las
colonias de estafilococos no patógenos se presentan de tamaño pequeño
y rodeado de una zona roja; en cambio, las colonias de estafilococos
patógenos fermentadores del manitol, se presentan colonias más grandes
y rodeadas de una zona amarilla.
Está compuesto: Extracto de carne (1.0g), mezcla de peptonas (10.0g),
NaCl (75g), D-Manitol (10.0g), agar (15.0g), rojo de fenol (0.025g) *pHf =
7.4 ±0.2
Caldo nutritivo
Es un medio acuoso, elaborado de acuerdo con la fórmula del APHA y
en el cuál se desarrollan una gran variedad de microorganismos que no
son tan exigentes con respecto a sus necesidades nutricionales. Utilizado
ampliamente en muchos procedimientos de laboratorio, tal y como viene
preparado o bien adicionado de indicadores, carbohidratos, líquidos orgánicos, sales, etc.
151
Capítulo 2
Medio SIM
Es un medio semisólido frecuentemente usado para diferenciar e identificar en cultivos puros de enterobacterias, la producción de sulfuros, indol
y movilidad de las mismas. La coloración obscura indica producción de
sulfuros. El desarrollo sólo a lo largo de la punción indica inmovilidad. La
movilidad del germen se revela por una turbidez difusa en el seno del
medio, y la producción de indol por medio de los reactivos Ehrlich o de
Kovacs que dan una coloración rojo púrpura si es positiva.
También puede usarse para el mismo propósito, la tira de papel filtro
impregnada con una solución de ácido oxálico. Esta se coloca seca, en la
boca del tubo virando a un color rosado en caso de formación de indol.
Composición: Peptona de caseína (20.0g), peptona de carne (6.1g), sulfato
de hierro y amonio (0.2g), tiosulfato de sodio (0.2g), agar (3.5g). *pHf =
7.3 ±0.2
3.1.5 Preparación de diluciones y soluciones
Las diluciones se utilizan en los análisis microbiológicos; para la contabilización de microorganismos presentes en la muestra representa un problema, es decir, cuando se sospecha que un número de microorganismos
opta por realizar una dilución para evitar errores en la cuenta.
Supongamos el siguiente ejemplo:
Considérese el caso de una muestra de suelo a la que se le desea contabilizar por cierto método la cantidad de tres microorganismos diferentes. Ya que la concentración de estos es muy alta como para realizar la
medición directamente, normalmente se procede a diluir la muestra, antes
de realizar la medición propiamente dicha.
Supóngase entonces que se toman 25 ml de la muestra original en un
matraz aforado y se diluyen a 250 ml con agua destilada, (Solución A).
Luego de homogenizar la solución recién preparada, se toman ahora 10
ml de esta solución en un matraz aforado y se diluyen nuevamente con
agua
152
Capítulo 2
destilada a 250 mls, (Solución B). Si posteriormente se realizan las determinaciones sobre la solución B y se encuentra que en ella las concentraciones son 15, 45 y 85, ¿cual será entonces la concentración de estos
elementos en la muestra original?
Esquema 6: Preparación de diluciones y soluciones.
Si se toman 10 ml de la solución A y se diluyen en un volumen de 250
ml con agua destilada, todas las substancias que se hallaban disueltas
en A, estarán ahora en la solución B, 25 veces más diluidas (250/10). En
general, en las operaciones de dilución, el volumen final al cual se lleva
una dilución, dividido por el tamaño de la alícuota, se conoce como el
“Factor de Dilución”.
El factor de dilución es el número por el cual se debe multiplicar la
concentración de un soluto en una solución diluida, para reproducir la
concentración de la muestra original.
Volumen total
Factor de dilución = ____________________
Volumen de alícuota
Así, el factor de dilución para pasar de la muestra original a la Solución A, será igual a 250 mls / 25 mls
= 10. A su vez, el factor de dilución para pasar de la
Solución A, a la Solución B, sería igual a 250 mls / 10
mls = 25. Por lo tanto, el factor de dilución para pasar
de la muestra original a la Solución B, será igual a 10
× 25 = 250. Esto significa que la concentración en la
muestra original es 250 veces mayor que la concentración en la solución B, donde se realiza la medida.
153
Capítulo 2
Soluciones
Una solución es una mezcla homogénea de un soluto en un solvente. Un
Soluto es la sustancia en la que se disuelve un compuesto químico determinado y el solvente es la sustancia en la cual se disuelve un soluto.
Esquema 7: Soluciones.
Soluciones a partir de un soluto sólido:
Los cálculos para preparar una solución a partir de un
soluto sólido son los siguientes:
1. Conocer el peso molecular del soluto para poder
calcular la masa molecular.
2. Establecer la concentración de la solución por preparar y el volumen necesario de la misma.
Ejemplo: ¿Cuántos gramos de NaOH se necesitan para
preparar 200 ml de solución 0,3 mol/ml?
154
Capítulo 2
Actividad 1
Investigar en la tabla periódica la
masa atómica de los componentes
del NaOH.
Paso
2
Cálculo de la Masa molecular del
NaOH (1x23) + (1 x 16) + (1 x 1) =
40 g
Práctica
3
Paso
Cálculo de la Masa de NaOH en
1.000 ml (1L) de solución 0,3 mol/L
Planteamiento: Si 1 mol de NaOH
equivale a 40 g de NaOH, 0,3 mol
de NaOH a cuanto equivale:
4
Paso
Paso
1
Masa contenida en los 200 ml de
NaOH.
C 27,06 / M 100 / Y 100 / N 27,84
C
Una vez obtenido este valor, lo que debe hacerse en el laboratorio es
pesar 2,4 g de NaOH y disolverlo en aproximadamente 150 ml de agua y
19,61
/ M 10,98 / Y 19,61 / N 0
luego aforar el matraz colocando agua hasta que llegue a 200 ml. Y se
tendrá una solución de NaOH al 0,3 molar.
C 44,71 / M 41,96 / Y 100 / N 16,86
C 69,02 / M 53,73 / Y 34,51 / N 10,2
155
Capítulo 2
3.1.6 Esterilización
Para la eliminación o muerte de todos los microorganismos la esterilización es un medio útil que contiene un objeto o sustancia, acondicionados
en tal forma que no pueden contaminarse nuevamente.
Existen diversos métodos entre los cuales se encuentran los:
• físicos,
• mecánicos y;
• químicos.
A continuación, se presenta una clasificación más general de los métodos de esterilización empleados en la industria y en los laboratorios de
análisis clínicos:
Esquema 8: Clasificación de los métodos de esterilización.
156
Capítulo 2
3.1.7 Métodos físicos
Calor Húmedo
Se utilizar calor, su eficacia depende de dos factores: el tiempo de exposición y la temperatura. Todos los microorganismos son susceptibles, en
distinto grado, a la acción del calor. El calor provoca desnaturalización
de proteínas, fusión y desorganización de las membranas y/o procesos
oxidantes irreversibles en los microorganismos.
El calor húmedo provoca desnaturalización y coagulación de proteínas; se
deben principalmente a dos razones:
1) El agua es una especie química muy reactiva y muchas estructuras
biológicas son producidas por reacciones que eliminan agua y
2) El vapor de agua posee un coeficiente de transferencia de calor
mucho más elevado que el aire.
Vapor a presión (autoclave)
Se realiza la esterilización por el vapor de agua a presión. El modelo
más usado es el de Chamberland. Esteriliza a 120° a una atmósfera de
presión (estas condiciones pueden variar) y se deja el material durante 20
a 30 minutos. El vapor a presión proporciona elevadas temperaturas con
penetración y humedad en grandes cantidades que facilitan la coagulación
de las proteínas.
Equipo: una caldera de cobre, sostenida por una camisa externa metálica,
que en la parte inferior recibe calor por combustión de gas o por una
resistencia eléctrica, ésta se cierra por la parte superior con una tapa de
bronce. Esta tapa posee tres orificios, uno para el manómetro, otro para
el escape de vapor en forma de robinete y el tercero, por una válvula de
seguridad que funciona por contrapeso o por resorte.
Funcionamiento: Se coloca agua en la caldera, previendo que su nivel no
alcance a los objetos que se disponen sobre una rejilla de metal. Se cierra perfectamente la tapa, sin ajustar los bulones y se da calor, dejando
abierta la válvula de escape hasta que todo el aire salga por completo y
comience la salida de vapor en forma de chorro continuo y abundante.
157
Capítulo 2
Esquema 9: Esquema general de una autoclave.
Calor Seco
El calor seco produce desecación de la célula, es esto tóxico por niveles
elevados de electrolitos. Estos efectos se deben al cambio de calor desde los materiales hasta los microorganismos que están en contacto con
estos.
La acción destructiva del calor sobre las proteínas y los lípidos
requieren una elevada temperatura cuando el material está seco o la actividad de agua del medio es baja.
Radiaciones ionizantes
Producen iones y radicales libres que alteran las bases
de los ácidos nucleicos, estructuras proteicas y lipídicas,
y componentes esenciales para la viabilidad de los microorganismos, dando lugar a mutaciones en los microorganismos que los incapacitan metabólicamente para
producir una enzima esencial y sobreviniendo la muerte
bacteriana. Las radiaciones tienen gran penetrabilidad y
se les utiliza para esterilizar materiales termolábiles (termosensibles) como jeringas descartables, sondas, etc. Se
utilizan en escala industrial por sus costos.
158
Capítulo 2
Rayos Gamma: Su empleo sus cimientos parten de los conocimientos sobre la energía
atómica. Este tipo de esterilización se utiliza en los productos o materiales termolábiles
y de gran importancia en el campo industrial. Puede esterilizar antibióticos, vacunas, alimentos, etc.
Rayos X: Penetran bien, pero requieren mucha energía, son pocos operativos para su
empleo masivo, su uso es muy costoso; por lo tanto, casi no se utiliza para fines de
esterilización.
Rayos Ultravioletas: Afectan a las moléculas de DNA de los microorganismos. El ADN
absorbe una longitud de onda de 260 nm y libera energía ocasionado la mejora de
enlaces químicos; son escasamente penetrantes, se utilizaron para superficies y en la
esterilización en quirófanos.
3.1.8 Métodos químicos
Estos métodos provocan la perdida ligroso por ser inflamable y exploside viabilidad de los microorganis- vo, y además cancerígeno.
mos.
b) Aldehídos: Son agentes alquilantes que actúan sobre las proteínas,
a) Óxido de etileno: Es un agente provocando una modificación irrealquilante que se une a compues- versible en enzimas e inhiben la actos con hidrógenos lábiles como los tividad enzimática. Estos compuesque tienen grupos carbxilos, amino, tos destruyen las esporas.
sulfhidrilos, hidroxilos, etc. Se utiliza
en la esterilización gaseosa, general- c) Glutaraldehído: Consiste en premente en la industria farmacéutica. parar una solución alcalina al 2% y
Destruye todos los microorganismos sumergir el material por esterilizar
incluso virus; es un agente micro- de 20 a 30 minutos, y luego un
biano de amplio espectro, destruye enjuague de 10 minutos. Este métobacterias en estado vegetativo, in- do tiene la ventaja de ser rápido y
cluyendo al bacilo de la tuberculo- ser el único que esteriliza de manesis, las esporas y los virus. Por otra ra efectiva en frío. Puede esterilizar
parte, sirve para esterilizar material plástico, goma, vidrio, metal, etc.
termosensibles como el descartable
(goma, plástico, papel, etc.), equipos
electrónicos, bombas cardiorrespiratorias, metal, etc. Es altamente pe-
159
Capítulo 2
160
Capítulo 2
Unidad 4 Aislamiento e inoculación
4.1 RAP Identifica los diferentes tipos de métodos de cultivo,
su preparación, clasificación, para su uso en laboratorios y
la industria
4.1.1 Aislamiento de microorganismos
El aislamiento y la purificación de bacterias a partir de muestras ambientales requieren la aplicación de metodologías pautadas en función del grupo
bacteriano que se desee estudiar.
Cuando se trabaja con comunidades de microorganismos, generalmente
sólo una fracción minoritaria (entre el 0,1 y el 10%) puede ser cultivada
en medios artificiales. Cuando el objetivo es el estudio de microorganismos cultivables que se encuentran en muy baja proporción en la muestra
original, conviene realizar cultivos de enriquecimiento.
Para esto se utilizan medios de cultivo líquidos que mediante alguna
estrategia de selección (composición
química, temperatura de incubación,
etc.) permitan la proliferación hasta
niveles detectables de los microorganismos que se desean aislar. Si
además se buscan microorganismos
con alguna actividad metabólica o
característica particular, para ‘ponerlos en evidencia’ debemos hacer
que nuestros medios sean diferenciales, es decir, que nos permitan
detectar de alguna manera la presencia de la estructura o actividad
buscada.
161
Capítulo 2
Esquema 10: Mecanismo general para el aislamiento de un
microorganismo de interés.
El aislamiento de cepas puede llevarse a cabo utilizando
las técnicas empleadas normalmente en microbiología;
se pudiera seguir el siguiente esquema a partir de una
muestra de suelo:
1. La muestra de suelo se suspende en agua estéril.
2. El sobrenadante se diluye 10-1 a 10-10 veces.
3. Muestras de estas series de diluciones (c.a. 100
µL) se siembran sobre varios medios de cultivo
(dependiendo del tipo de microorganismos que queramos aislar) y luego se incuban.
4. Se aíslan colonias separadas de distinta morfología y se purifican por resiembra.
5. Los cultivos puros se mantienen en tubos de
ensayo como cultivos en medio sólido listos para
realizar las pruebas de selección.
162
Capítulo 2
El procedimiento de selección puede ser acelerado
frecuentemente probando la actividad biológica de los
aislados iniciales directamente..
163
Capítulo 2
164
Capítulo 2
Unidad 5 Diferentes aspectos de la microbiología
y fuentes de obtención de microorganismos
5.1 RAP Identifica y conoce los aspectos más importantes
de la microbiología y la fuente de obtención de
microorganismos
5.1.1 Selección de microorganismos
Búsqueda: Detección y aislamiento de microorganismos de interés industrial
de una población compleja de organismos, utilizando procedimientos selectivos.
Búsqueda Primaria: Detección y aislamiento de microorganismos potencialmente
útiles.
Búsqueda
Secundaria: Estudio de los microorganismos aislados en la
búsqueda primaria para separar los que tienen interés potencial de los que
tienen interés real y mejorar estas cepas seleccionadas.
Para llevar a cabo una búsqueda primaria generalmente se parte de una
población mixta (suelo, fermentaciones naturales, etc.) donde existe, tanto una
gran cantidad como variedad de microorganismos potencialmente útiles que
debemos seleccionar. Lo primero que debemos utilizar son medios selectivos
donde crezca el tipo de microorganismo que nos interesa aislar. A este medio
se le pueden añadir inhibidores para eliminar los que no nos interesan.
Por ejemplo, si queremos obtener un microorganismo aerobio lo creceríamos
en presencia de O2 con lo que los anaerobios no crecerían; o bien, si
queremos seleccionar hongos, añadiríamos cloranfenicol, antibiótico que actúa
frente a bacterias, pero que no afecta a los hongos.
Los parámetros generales que tenemos que tener en cuenta son la fuente
de carbono, fuente de nitrógeno, aireación, temperatura, pH e inhibidores.
Posteriormente se reaislan en cultivo puro aquellos microorganismos que
hemos aislado para su posterior estudio.
165
Capítulo 2
166
Capítulo 2
Unidad 6 Técnicas de cultivo y conservación de microorganismos
6.1 RAP Determina las técnicas de cultivo más adecuadas, la
obtención, aislamiento y conservación de microorganismos
6.1.1 Fuentes de obtención de microorganismos
1. Fermentaciones naturales: vino, pan, queso, materiales en descomposición.
2. Animales y plantas enfermos: vacunas.
3. Suelo: es el mayor almacén; también es el más difícil de manejar, ya que se
pueden encontrar todo tipo de microorganismos y en una concentración de 100
millones por gramo de suelo (gran variedad y cantidad).
4. Colecciones internacionales de cultivos tipo. Para el aislamiento de nuevos
productos metabólicos, se intentan aislar cepas a partir de ambientes extremos
o poco corrientes esperando que de que tales cepas sean capaces de producir
nuevos metabolitos. Por ejemplo, se están examinando microorganismos de las
grandes altitudes, hábitats fríos, aguas marinas, profundidades de los océanos,
desiertos, géiseres, campos de petróleo, etc.
Para aislar se utiliza alguno de los siguientes procedimientos:
a) Aislamiento por estrías
b) Aislamiento por dilución
Existen distintas técnicas, el objeto es obtener colonias aisladas. Una de ellas
consiste en cargar el asa con la muestra y hacer estrías paralelas en la cuarta parte
de la superficie de la placa, Esquema 11 (d) y (e); se quema el asa, Esquema 11 (a) y
(b) se enfría, se gira la placa 90° y se vuelve a estriare tocando 3 y 4 veces el área
sembrada inicialmente y cubriendo otro cuarto de placa. Esquema 11 (c).Por último,
sin quemar el asa, se estría el resto de la superficie sin sembrar.
167
Capítulo 2
En algunos otros métodos se realizan en forma las siembras en forma radial, Esquema 11 (f); o en forma de “T” Esquema 11 (g); o de contorno, Esquema 11 (h).
Esquema 11: Esquema de técnicas de aislamiento.
11 a)
11 b)
11 d)
11 e) Cuadrante
11 f) Radiante
11 g) Forma de T
11 h) Continuo
Esquema 12: Métodos de siembra.
168
11 c)
Capítulo 2
6.1.2 Aislamiento por dilución
Se emplean, tanto el método de siembra incorporada como
el de siembra en superficie. Suele ser necesario diluir la
muestra.
Para ello se pueden preparar las diluciones decimales en
condiciones asépticas usando suero fisiológico o algún
otro diluyente.
La siembra incorporada se realiza obteniendo una dilución
y sembrándola antes de gelidificar el agar sobre la placa,
es decir, incorporando el inóculo en el agar. También se
pueden preparar las diluciones directamente en tubos de
agar fundido, se agita por rotación entre las manos y se
vierte en placas de Petri estériles.
Para llevar a cabo las diluciones para siembras de microorganismos, se toma un mililitro de líquido de cultivo y se
pasa a un frasco cuya capacidad sea superior a 100 mililitros y se le agregan 99 mililitros de agua destilada, se agita
la nueva solución y se toma de está un mililitro y se pasa
a otro frasco cuya capacidad sea superior a 100 mililitros
y se agregan 99 mililitros de agua destilada. Con lo que
tendremos una disolución 1:10,000.
Nuevamente del último frasco se toma un mililitro de la
solución y se pasa a un tercer frasco cuya capacidad sea
superior a 100 mililitros y se le agregan 99 mililitros para
tener una dilución 1:1’000, 000.
169
Capítulo 2
A
B
C
1 ml
Esquema 13. Método de diluciones
para sembrar microorganismos.
170
Se toma un mililitro del segundo frasco dilución 1:10,
000 y se siembra en una caja Petri (No. 1); luego de ese
frasco se toma un mililitro de la solución con 9 mililitros
de agua destilada y se siembran en otra caja Petri (No.
3), se toma un mililitro del último frasco y se siembra en
otra caja Petri (No. 2), y luego se vuelve a tomar 1 mililitro
de este frasco con 9 mililitros de agua para tener una
dilución 1:10’000,000 (No. 4). Esquema 13
Capítulo 2
Se pasa un mililitro de muestra de cultivo a otro recipiente
de capacidad superior a los 100 ml y se completa con agua
destilada a 100 ml. (esto es se agregan 99 ml); dando una
dilución de 1:100. Luego de este frasco se toma un mililitro
y se pasa a otro frasco de igual capacidad (mayor o igual a
100 ml) y se completa con agua destilada a 100 ml, dando
una dilución de 1:10,000 respecto al cultivo inicial.
Finalmente de este frasco se toma un mililitro y se pasa a
otro frasco de igual capacidad que los anteriores y se completa, de igual forma a 100 ml, de tal forma que se tendrá
una dilución de 1:1’000,000 respecto al cultivo inicial. En
esta forma se ha logrado tener una siembra por dilución
de un cultivo original.
171
Capítulo 2
172
Capítulo 2
Unidad 7 Control de microorganismos y su importancia
industrial
7.1 RAP Determina y controla los microorganismos de interés
para la industria
7.1.1 Microorganismos de interés industrial
Un microorganismo de uso industrial debe producir la sustancia de interés;
debe estar disponible en cultivo puro; debe ser genéticamente estable y
debe crecer en cultivos a gran escala. Otra característica importante
es que el microorganismo industrial crezca rápidamente y produzca el
producto deseado en un corto período de tiempo. El microorganismo debe
también crecer en un medio relativamente barato de cultivo disponible en
grandes cantidades. Además, un microorganismo industrial no debe ser
patógeno para el hombre o para los animales o plantas.
7.1.2 Algunos tipos de microorganismos
Levaduras
Las levaduras se utilizan desde hace miles de años para la fabricación de pan
y bebidas alcohólicas. La levadura que sin duda fué la primera y la que aún se
sigue utilizando.
Saccharomyces cerevisiae de estas se emplean diferentes cepas para la
fabricación de cerveza, vino, sake, pan y alcoholes industriales.
Kluyveromyces fragilis es una especie fermentadora de la lactosa que se explota
en pequeña escala para la producción de alcohol a partir del suero de la leche.
Yarrowia lipolytica es una fuente industrial de ácido cítrico.
Trichosporum cutaneum desempeña un importante papel en los sistemas de
173
Capítulo 2
digestión aeróbica de aguas residuales debido a su enorme capacidad
de oxidación de compuestos orgánicos, incluidos algunos que son tóxicos
para otras levaduras y hongos, como los derivados fenólicos.
Saccharomyces cerevisiae
Kluyveromyces fragilis
Esquema 14: Esquema de levaduras.
Hongos filamentosos
Los hongos tienen una gran importancia económica, no
tan sólo por su utilidad, sino también por el daño que
pueden causar. Estos son responsables de la degradación de gran parte de la materia orgánica de la Tierra,
una actividad enormemente beneficiosa, ya que permite
el reciclaje de la materia viva.
Por otro lado, los hongos causan enfermedades en
plantas y animales; del mismo modo pueden destruir
alimentos y materiales de los que depende el hombre.
Los efectos perjudiciales que causan están contrarrestados por su utilización industrial.
174
Capítulo 2
Son la base de muchas fermentaciones como la combinación de soja, habichuelas, arroz y cebada que dan lugar a los alimentos orientales miso,
shoyu y tempeh. Los hongos son también la fuente de muchos enzimas
comerciales (amilasas, proteasas, pectinasas), ácidos orgánicos (cítrico,
láctico), antibióticos (penicilina), quesos especiales (Camembert, Roquefort)
y, evidentemente, de las setas.
Bacterias
Entre las especies bacterianas de interés industrial están:
a) Las bacterias del ácido acético, Gluconobacter y Acetobacter que
pueden convertir el etanol en ácido acético. El género Bacillus es productor de antibióticos (gramicidina, bacitracina, polimixina), proteasas
e insecticidas.
Del género Clostridium cabe destacar Clostridium acetobutylicum que
puede fermentar los azúcares originando acetona y butanol.
b) Las bacterias del ácido láctico incluyen, entre otras, las especies de
los géneros Streptococcus y Lactobacillus que producen yogur. Corynebacterium glutamicum es una importante fuente industrial. Tienen un
olor característico a tierra mojada; se debe a compuestos volátiles
(geosmina) producidos por Streptomyces, aunque su importancia radica en la producción de antibióticos como anfotericina B, kanamicina,
neomicina, estreptomicina, tetraciclina, etc.
175
Capítulo 2
Autoevaluación
1. Los criterios utilizados para juzgar la calidad microbiológica de los
alimentos debe ser: b
a) Al máximo
b) Al mínimo
c) Medio
d) Ninguna de las anteriores
e) Medio y mínimo
2. La variedad en la presencia de microorganismos incluye alguna de las
siguientes opciones. ¿Cuál de ellas corresponde? d
a) La contaminación ambiental durante la toma o transporte de muestra.
b) No será necesario evaluar la muestra que encontramos dentro de la
superficie.
c) Provocar a los microorganismos evaluando la muestra dentro de
superficies.
d) Que para evitar la distorsión provocada por los microorganismos es
necesario evaluar la muestra que encontramos.
e) Plantar un microorganismo como parte de muestreo.
Actividad
3. ¿Cuál es el porcentaje que se le asigna a un lote pequeño de muestras? c
a) 14%
b) 1%
c) 10%
d) 20%
e) 9%
Práctica
4. Los riesgos microbiológicos se representan de dos formas; indica cuál de
las opciones las menciona d
a) Que los que consumen no acepten lotes substàndar y el riesgo del
fabricante
b) El rechazo de un lote de productos y obligar al fabricante a tomar
medidas
c) Obligar a tomar un muestreo al azar y proteger al consumidor.
d) El riesgo de que los que consumen acepten la probabilidad de los
totes subtàndar y el riesgo de que el fabricante tenga probabilidad de
rechazo de lotes.
e) Ninguna de las anteriores
176
Capítulo 2
5. ¿Cuáles son los métodos mas frecuentes que se utilizan para la preparación de
las muestras? c
a) la trituración, ionización, la pulverización
b) la pulverización, sulubilizaciòn, homogenización
c) la trituración , la pulverización, homogenización
d) ionización , subutilización trituración
e) pulverización , homogenización, ionización
6. Dentro de la clasificación de los medios de cultivo, ¿ cuál es que se mantiene en
un estado liquido y se utiliza para realizar suspensión de disolución c
a) cultivos generales
b) cultivos selectivos
c) caldos de cultivo
d) sólidos
e) semisólidos
7. Es uno de los medios más utilizados, el cual menciona que la degradación del
minitol con producción de ácido cambia el color del medio de rosa a amarillo. C
a) Medio EMB
b) Agar de Mac Conkey
c) Sal Manitol
d) Caldo nutritivo
e) SIM
8. Es la sustancia en la que se disuelve un compuesto químico determinado.
a) Un solvente
b) Un soluto
c) Una solución
d) Un químico
e) Un compuesto
b
9. ¿Cuál de las siguientes opciones representan los métodos de esterilización físicos?
a) Oxido de etileno, radiaciones ionizantes
b) Aldehídos, glutaraldehìdos
c) Vapor a presión aldehídos
d) Oxido de etileno vapor a presión
e) Calor húmedo, calor seco
177
Capítulo 2
10. ¿Cual de la selecciones de microorganismos menciona que para realizarse es necesario partir de una población mixta? c
a) La secundaria
b) La terciaria
c) La primaria
d) La secundaria y la primaria
e) Terciaria y primaria
11. Una fuente de obtención de microorganismos que se da a través del
vino, el pan y queso. c
a) Animales
b) Colecciones internacionales de cultivo
c) Fermentaciones naturales
d) Suelo
e) El aire
12. ¿Cuál de las siguientes opciones menciona uno de los métodos de
siembra? b
a) Aldehídos
b) Cuadrante
c) Circular
d) Semisólido
e) Rectangular
13. Dentro de los tipos de microorganismos que causan enfermedades en
plantas y animales, así mismo destrucción de alimentos. c
a) Levaduras
b) Bacterias
c) Hongos
d) Suelo
e) Microbios
178
Capítulo 2
Respuestas a la autoevaluación
1.b
2.d
3.c
4.d
5.c
6.c
7.c
8.b
9.e
10.c
11.c
12.b
13.c
179
Capítulo 3
180
Capítulo 3
Capítulo 3 Fermentación de
productos industriales
Propósito
Conocer y manejar los conceptos fundamentales de la
microbiología microbiana como base para los procesos
de fermentación.
181
Capítulo 3
182
Capítulo 3
Introducción
Las Fermentaciones de Productos Industriales comprenden un buen número
de procesos industriales que son utilizados por el hombre para producir
satisfactores para la salud y la alimentación.
Para poder aprovechar las fermentaciones se deben desarrollar tecnologías
que permitan fabricar productos en cantidades industriales para satisfacer
necesidades del hombre, tanto en el ámbito doméstico, como social y
comercial.
En el desarrollo de las tecnologías de las fermentaciones se debe buscar
siempre el bajo costo, de tal forma que compitan con los productos que
se usan actualmente.
Existen procesos fermentativos que se conocen desde la antigüedad, como
la fabricación del vino, la cerveza, etc. Tradicionalmente, la humanidad
utilizaba estos procesos fermentativos y se consumían sin considerar
que se podría desarrollar tecnológicamente a un costo más bajo y con
mejores resultados de calidad de los productos.
183
Capítulo 3
184
Capítulo 3
Unidad 1 Antecedentes de la microbiología industrial
1.1 RAP Identifica y maneja los conceptos fundamentales
de la microbiología industrial
1.1.1 Antecedentes históricos de la microbiología industrial
Es el estudio de la microbiología orientada a la producción de elementos de
interés industrial mediante procesos en los cuales interviene, en algún paso,
un microorganismo. Es el caso de la producción de alimentos (fermentación
del vino, pan o cerveza) y suplementos dietéticos (como los cultivos de algas,
vitaminas o aminoácidos) biopolímeros, como el xantano, alginato, celulosa, ácido
hialurónico, polihidroxialcanatos; biorremediación de entornos contaminados
o tratamiento de desechos, así como la producción de principios activos
de interés en medicina, como la insulina y hormona del crecimiento o de
sustancias implicadas en el diagnóstico, como las Taq polimerasas empleadas
en PCR cuantitativa.
Es tan antigua ésta, como la manipulación de alimentos fermentados como el
vino, pan o yogur. No obstante, durante el siglo XX su aplicación se diversificó
con el ánimo de generar un gran número de compuestos químicos complejos de
forma más sencilla y barata que mediante síntesis orgánica; este hecho se debe
a la enorme versatilidad metabólica de los microorganismos que, frecuentemente,
son capaces de producir los compuestos deseados o sus precursores. Así mismo,
ha sido clave en la producción de penicilinas, ya naturales, como la penicilina
G (esto es, producidas de forma totalmente microbiológica), ya semisintéticas,
como la meticilina, que requieren la purificación de un intermediario que luego
ha de modificarse química o enzimáticamente. Por último, la tecnología avocada
al estudio del ADN recombinante ha permitido, con un enfoque de ingeniería
genética, diversificar aún más la disciplina, llegando a producirse proteínas
humanas mediante microorganismos transformados con genes humanos.
185
Capítulo 3
Los microorganismos pueden ser considerados en dos criterios. El primero corresponde a las actividades útiles que
tienen algunos para obtener bienes o servicios y el segundo, a los efectos perjudiciales que ocasionan, que están
generalmente asociados a la producción de enfermedades,
tanto en el hombre como en los animales, y que también se
pueden extender al deterioro producido sobre alimentos y
materiales diversos.
La Microbiología Industrial se ocupa fundamentalmente de
las actividades útiles de los microorganismos. El término
Cultivo de un Penicillium productor de penicilina microorganismo se aplica en este Manual, a los organisy estructura de la penicilina G.
mos tales como bacterias, hongos y levaduras, es decir
procariotes y eucariotes, con inclusión de algas microscópicas, pero que no comprende a los virus. Aunque existen
aplicaciones industriales de los virus como es el caso de
la producción de algunas vacunas, esos procesos quedan
excluidos de este Manual.
La biosíntesis de ácidos grasos,
ocurre a través de la condensación de unidades de dos carbonos, es el sentido opuesto a la
β oxidación.
Figura: diferencias entre las vías de oxidación de los ácidos grasos y su síntesis. Las diferencias se encuentran a
5 niveles: 1. localización celular; 2. acarreador del grupo
acilo; 3. pares dador/aceptor de electrones; 4. estereoquímica de la reacción de hidratación/deshidratación; y 5. la
forma en que las unidades C2 son producidas o donadas.
186
Capítulo 3
Las aplicaciones de los microorganismos son de tiempo
inmemorial. El hombre inventó o descubrió al azar la manera de hacer cerveza, vinagre, vino o pan. La cerveza era
conocida antes del año 6000 a.C. por sumerios y babilonios, y en el antiguo Egipto existía ya verdadera producción
en el año 1700 a.C.; el vinagre se producía desde antes de
esa fecha y el vino es también muy antiguo, ya que existe
evidencia de su producción antes del año 2000 a.C. en
Egipto y China, y finalmente, el pan se conoce desde el año
4000 a.C. aproximadamente.
Evidencia de la producción de vino por los
egipcios antes del año
2000 a. c.
La fermentación es la parte principal
del proceso de la elaboración del vino,
tiene como principal efecto la conversión de los azúcares del mosto en
alcohol etílico.
Figura Producción de vino (Archivo:Red wine cap.jpg
En los comienzos del siglo XX existían muy pocos o ningún
control de los procedimientos utilizados para la elaboración de esos productos o alimentos. Se pueden fijar 4
grandes etapas en el desarrollo de la Microbiología Industrial: 1) hasta 1900; 2) 1900-1945; 3) 1945-1979 y 4) 1979
hasta el presente, y considerar el comienzo del siglo XXI
como el inicio de cierto control en los procesos de utilización de cultivos puros.
187
Capítulo 3
Para 1900 comienza la etapa de producción de una serie de productos nuevos que se suman a los conocidos
desde la más remota antigüedad, y que son la levadura
de cerveza, glicerol, ácido láctico, acetona butanol y etanol. Hasta el 1945 el futuro de la Microbiología Industrial,
ya que solamente unos pocos productos eran fabricados
con microorganismos, y además varios de esos productos
podían obtenerse por otras vías, ya más convenientes por
razones económicas, como etanol, ácido láctico o acetona butanol. Con la aparición de la penicilina en 1945
y la necesidad de su producción, se produce un impacto
formidable sobre los procedimientos microbiológicos, ya
que se plantea el desafío de la producción en gran escala
en condiciones de mucho mayor control y con necesidad
de operaciones más complejas para la separación y purificación de los productos. Como consecuencia de los
avances logrados en esos desarrollos se produce en pocos
años la aparición de un gran número de nuevos productos,
como otros antibióticos, aminoácidos, esteroides, enzimas,
biomasa aplicada a la alimentación animal y humana (proteínas unicelulares), nucleótidos, etc.
La Microbiología Industrial para 1979 recibe un nuevo y notable impulso que se suma al anterior cuando se concretan
a nivel de procedimientos prácticos las posibilidades que
ofrece la ingeniería genética, disciplina surgida como consecuencia del avance de la Biología Molecular. Este nuevo
impulso posibilita la producción industrial, basada en la
utilización de microorganismos recombinantes, de sustancias nuevas nunca producidas antes por esa vía como la
insulina, hormona de crecimiento, interferón y otras de muy
reciente aparición en el mercado de productos relacionados con el área de la salud. A través de una evolución en
los conceptos, el avance de los conocimientos y sobre
todo, con la necesidad de resolver problemas de producción vinculados a procesos cada vez más complejos, se fue
haciendo necesaria la participación de ingenieros y bioquímicos además de los microbiólogos, y se fue produciendo
también la integración de conocimientos provenientes de
188
Capítulo 3
varias disciplinas. Se fue profundizando, el estudio de
los microorganismos de interés industrial, no sólo en sus
aspectos microbiológicos, sino también en relación a los
requerimientos surgidos de las aplicaciones industriales
de los mismos. Si de esta manera diferenciando la metodología general empleada en la selección, mantenimiento
y mejoramiento de los microorganismos, estos aspectos
debían orientarse a los productos de interés y al aumento
de la productividad de las cepas empleadas.
La insulina humana ha sido el primer producto comercial de
la clonación de genes y su éxito ha sido debido al pequeño
tamaño de la molécula que hizo posible la síntesis química
de un gen.
Para llevar a cabo la producción de insulina humana recombinante, se sintetizaron químicamente las cadenas de
ADN con las secuencias correspondientes a las cadenas de
glicocola y fenilalanina, siendo necesarias 63 nucleótidos
para la primera y 90 para la segunda más un triplete para
señalar el fin de la traducción. Además. Para facilitar la
separación de los productos sintetizados, se añadió a cada
gen el triplete correspondiente a la metionina.
Figura
Producción de in-
sulina recombinante.
189
Capítulo 3
A la par sucedió con los requerimientos de
los medios de producción que deben incluir
consideraciones económicas además de las
microbiológicas. Se produjeron en los aspectos tecnológicos, evoluciones necesarias, ya
que de las cubas clásicas de fermentación
construidas de materiales diversos y con
poca instrumentación se pasó a biorreactores de acero inoxidable muy instrumentados.
La evolución de los procesos en los reactores y la interacción microorganismo- medio
que en los mismos requirió aportes fundamentales de la Bioquímica y Fisiología
Microbiana, como el conocimiento de las
rutas metabólicas, cinética enzimática, mecanismos de Biorreactores de membrana
regulación y estudios acerca de la influencia del medio (Producto del desarrollo de la biotecnoambiente sobre la productividad del proceso. Con ello logía)
a la Tecnología se incorporaron conocimientos fundamentales de fenómenos de transporte como transferencia de materia, calor y cantidad de movimiento y
criterios de cambio de escala. Como consecuencia de
la contribución de otras disciplinas básicas como la
Química, se fueron incorporando también conceptos
de termodinámica y estequiometría que se integraron
con los de la cinética enzimática para ser aplicados al
crecimiento microbiano y a la formación de productos.
Todos esos conceptos de la Microbiología, Química,
Bioquímica y Tecnología, constituyeron las bases de la
Microbiología Industrial actual.
En ella se utilizan los términos fermentación y fermentaciones industriales, para caracterizar a los procesos o tecnologías basados en el uso de microorganismos.
La “fermentación”, que deriva del latín fermentar (hervir), inicialmente reservado a la actividad
microbiana anaerobia, se fue aplicando asimismo a procesos aerobios y finalmente también
a aquéllos que utilizan células animales y vegetales.
Los procesos de la Microbiología Industrial o las fermentaciones industriales, o los procesos
de fermentación, son o pueden considerarse como sinónimos.
190
Capítulo 3
1.1.2 Identificación de microorganismos
Los criterios utilizados, en la elección de microorganismos deberán tener en
cuenta ciertos criterios generales como son:
• La cepa debe estar libre de contaminantes, incluidos fagos.
• Sus requerimientos nutricionales deberían ser satisfechos a partir de medios de cultivo de costo reducido.
• Debe ser de fácil conservación por largos períodos de tiempo, sin pérdida
de sus características particulares.
• Debería llevar a cabo el proceso fermentativo completo en un tiempo
corto.
En un proceso si el objetivo es un producto, éste debería ser de alto rendimiento
y de fácil extracción del medio de cultivo. Los microorganismos que se utilizan
en un proceso, pueden ser obtenidos por aislamiento a partir de fuentes
naturales o de una colección de cultivos. En la industria, en general, cada
firma posee su propia colección de organismos, muchos de los cuales han
sido mejorados a través de técnicas clásicas de mutación o de ingeniería
genética. En cambio, estas cepas sólo son empleadas por la industria que las
posee, debido al gran valor comercial de las mismas, por lo que hay casos
donde se dispone de organismos modificados genéticamente para llevar a
cabo reacciones específicas de biosíntesis, degradación o biocatálisis, los
cuales están protegidos por patentes. Esto significa que un gran porcentaje
de organismos aislados o modificados no son disponibles para uso general en
laboratorios.
A nivel mundial hay
un gran número de colecciones depositarias de
cultivos. Entre la diversidad de colecciones se destacan: “American Type
Culture Collection”, USA, la cual mantiene bacterias, levaduras, algas,
actinomycetes, mohos, protozoos, virus y líneas celulares; “Colletion
Nationale de Cultures de Microorganismes” del Institut Pasteur, Francia;
“Northern Regional Research Laboratory” (NRRL), de Peoria, USA, y “National
Collection of Type Cultures”, Londres, Inglaterra.
191
Capítulo 3
1.1.3 Manejo de cepas microbianas
Al aislar un organismo de sus fuentes naturales como agua, suelo, plantas y
desechos, la elección del material de partida puede hacerse teniendo en cuenta
que el organismo exprese en ese ambiente las propiedades que son de interés.
En el caso de suelos tratados con pesticidas se podrían encontrar organismos
adaptados a la degradación de estos productos químicos, o en larvas de insectos muertos y agentes causales de la muerte. Cuando se elige la fuente de
aislamiento, las posibilidades de éxito dependen de la técnica elegida para el
mismo; en este caso las alternativas son: a) aislamiento directo, o b) enriquecimiento del cultivo con o sin pretratamiento de la muestra.
Cuando se realiza el muestreo y selección (screening) para el aislamiento de
una cepa de interés, la misma deberá ser caracterizada. En este se debe tener
en cuenta que la composición química del material a partir del cual se va a
realizar el aislamiento comienza a variar desde el momento en que es tomada
la muestra; por lo tanto, ésta se debe procesar rápidamente, tratando de evitar
alteraciones que afecten a la población de interés.
a) Aislamiento directo: en este caso
es preferible que el medio que se utiliza permita la máxima expresión del
material genético del organismo. En el
caso un organismo con acción antimicrobiana, se puede crecer al potencial
productor, en una caja de petri en
presencia del o los organismos contra los cuales se requiere la acción
antimicrobiana, observándose la producción del inhibidor por las zonas Aislamiento vegetativo de cepas
de inhibición de crecimiento. Para la
detección de productores de factores de crecimiento tales como aminoácidos y nucleótidos se utiliza la estimulación del desarrollo de
bacterias auxótrofas por un lisado del organismo, pudiéndose llevar
a cabo en medios sólidos, en donde es una “réplica” de la caja por
ensayar. Al obtener el crecimiento en la primera caja, se replica a
una segunda, antes de “matar” las colonias con luz. U.V., por ejemplo.
Esta caja es luego cargada con agar conteniendo una suspensión del
organismo auxótrofo al producto buscado. Después de un período de
incubación se observa crecimiento en forma de halo alrededor de las
192
Capítulo 3
colonias productoras, lo que permite
el aislamiento de este organismo de
la placa réplica.
b) Enriquecimiento del cultivo: consiste en incrementar en una población
mixta el número de organismos de
interés en relación con el resto, donde se busca favorecer el crecimiento
de un tipo dado de microorganismos
mediante condiciones de cultivo adecuadas al mismo, o de condiciones
Aislamiento con esporas
inapropiadas para el desarrollo de
los otros. Con el empleo de sustratos específicos o ciertos inhibidores.
Para mantener la fuerza selectiva del medio, el cual se modifica por el
crecimiento del organismo buscado, se realizan subcultivos periódicos en
medio fresco. Conlleva a que el organismo de interés sea el dominante de
la población, lo cual facilita su posterior aislamiento en medio sólido, considerando en este caso el efecto del medio sobre la velocidad específica
de crecimiento (µ). Para este procedimiento la selección de un organismo
depende del valor de (µ) comparado con los de los otros organismos. El
dominante de la población será el que posea el mayor valor de (µ) para las
condiciones de cultivo empleadas. Sin embargo, no necesariamente será
más útil un organismo de (µ) más alto; puede ser deseable uno con mayor
afinidad por el sustrato.
La problemática de selección puede ser superada empleando el sistema
de cultivo continuo, donde la fuerza de selección se mantiene en un nivel
constante y el organismo dominante será seleccionado por su afinidad por
el sustrato, más que por su (µ) máxima.
193
Capítulo 3
Actividad 1
a) Hacer una Figura que muestre un modelo de competición entre dos organismos capaces de crecer en un
cultivo continuo enriquecido.
Práctica
b) Indica tres aspectos importantes que se deban tomar en cuenta para la conservación de cepas de uso
industrial: ___________________________________________
____________________________________________________
____________________________________________________
____________________________________________________
____________________________________________________
____________________________________________________
____________________________________________________
____________________________________.
C
C
c) ¿Cómo pueden conocerse las características de un
cultivo para aplicación industrial?
____________________________________________________
____________________________________________________
27,06
/ M 100 / Y 100 / N 27,84
____________________________________________________
____________________________________________________
19,61
/ M 10,98 / Y 19,61 / N 0
____________________________________________________
_______________________.
C 44,71 / M 41,96 / Y 100 / N 16,86
194
C 69,02 / M 53,73 / Y 34,51 / N 10,2
Capítulo 3
Unidad 2 Desarrollo de las fermentaciones
2.1 RAP Identifica los requerimientos y procesos para el desarrollo
de las fermentaciones en la industria
La preparación de medios para el desarrollo de fermentación es una etapa fundamental para asegurar la productividad de los mismos. Los componentes de los medios
constituyen los efectores externos de naturaleza química
que desempeñan un rol esencial en los procesos, ya que
deben cumplir con los requerimientos del crecimiento y
de formación de productos y además suministrar energía
para la síntesis de metabolitos y para el mantenimiento
Preparación de medios de cultivo
celular. Los microorganismos suelen variar considerablemente respecto de los nutrientes que pueden necesitar; es posible efectuar la
distinción de las siguientes categorías de componentes:
a) Macronutrientes, agregados en cantidades de gramos por litro, que están representados por las fuentes de C, N, S, P, K y Mg
b) Micronutrientes o elementos trazas representados por las sales de Fe, Mn, Mo, Ca,
Zn y Co que se agregan a los medios en cantidades de miligramos o microgramos
por litro y
c) Factores de crecimiento, que están constituidos generalmente por componentes
orgánicos suministrados en baja concentración y que no son sintetizados ni metabolizados por las células, sino incorporados a estructuras celulares y de función
metabólica específica, como vitaminas, algunos aminoácidos, ácidos grasos no
saturados, etc.
Los medios pueden clasificarse, considerando la naturaleza química de los componentes, en:
1) Medios sintéticos o medios químicamente definidos, y
2) Medios complejos en cuya composición intervienen sustancias de origen animal
o vegetal como peptonas, extracto de levadura, macerado de maíz, harina de soja,
etc. que aportan las sustancias fundamentales ya mencionadas, pero que son químicamente indefinidas y de composición variable.
195
Capítulo 3
En el estudio de los medios de cultivo es conveniente considerar en primer
lugar el diseño para tratar a continuación la formulación y optimización de los
mismos.
2.1.1 Diseño
Sistema de alimentación por lote
Tiene como finalidad, en un medio de fermentación la elección de
los componentes necesarios para lograr el crecimiento y la formación de productos correspondientes al proceso por desarrollar. Se
deben tener en cuenta todos aquellos aspectos relacionados con
el microorganismo, el proceso y los sustratos para ser empleados
como son los requerimientos nutricionales del microorganismo
y algunos específicos del proceso, la disponibilidad real de los
componentes y consideraciones sobre las materias primas. También importantes son los que se refieren a todos los procesos y
operaciones previas y posteriores a la etapa de fermentación y al
conocimiento de los mecanismos bioquímicos que regulan la formación de algunos productos, como es el caso de la importancia
del anión P04.
2.1.2 Requerimientos nutricionales
Están determinados por el tipo de metabolismo celular, ya sea autotrófico, que
corresponde a los microorganismos que obtienen el carbono del C02 como las
algas y algunas bacterias, y los heterotróficos que necesitan compuestos orgánicos como fuente de carbono. Otro factor esencial son las condiciones del
cultivo, si es aerobio o anaerobio. El 02 es uno de los oxidantes más comunes
en el metabolismo energético. En la ausencia del 02, el N03 o S04 son utilizados
como aceptores de electrones por algunas bacterias. Las bacterias metanogénicas son auxótrofos anaerobios que utilizan H2 para reducir el C02 a CH4 y
obtener energía. Algunas protistas obtienen su energía, en condiciones anaerobias por reacción de óxido-reducción realizadas sobre compuestos orgánicos.
Las fuentes de carbono cumplen también el rol de ser fuente de energía.
Otro, está constituido por las fuentes de nitrógeno que pueden ser de naturaleza
inorgánica u orgánica. El nitrógeno es utilizado para la biosíntesis de proteínas,
ácidos nucleicos y polímeros de la pared celular. Para la síntesis de proteína se
requieren en general L-aminoácidos, aunque también son necesarios algunos
aminoácidos de la serie D como D-alanina y D-aspártico para su
196
Capítulo 3
incorporación a la pared de la células. En algunos casos se requieren también
péptidos de histidina.
En el caso de macronutrientes como el P y el S son suministrados en forma de
HP04 y S04 (o aminoácidos azufrados). El fósforo se incorpora en ácidos nucleicos,
y polímeros celulares. El S es asimilado para la síntesis de aminoácidos azufrados,
y además se necesita para la biotina, coenzima A, tiamina y otros componentes.
Por otro, lado el del K y Mg son también esenciales. Una parte importante del primero está unida al RNA, de manera que los requerimientos de K aumentan con los
factores que influyen en el aumento del RNA de las células, como la velocidad de
crecimiento. El ión K actúa como coenzima y probablemente actúa como catión en
la estructura aniónica de varios componentes celulares. El ión Mg es esencial para
la estabilidad de los ribosomas y actúa como cofactor en numerosas reacciones del
metabolismo. Tanto el K como el Mg se incorporan a los medios en forma de sales
como fosfato y sulfato.
Con respecto a los micronutrientes se distinguen 2 categorías:
Elementos esenciales para el crecimiento
Elementos esenciales para el
crecimiento
Ca
Mn
Fe
Co
Cu
Zn
Oligoelementos esenciales para el crecimiento
Ba,
Na
Al
Si
Cl
V
Cr
Ni,
As
Se
Mo
Sn
I
En ocasiones es difícil demostrar un requerimiento de un micronutriente porque generalmente
está presente en suficiente cantidad como impureza de los componentes principales. Los
requerimientos de estos compuestos pueden aumentar varias veces cuando el cultivo ha
estado sujeto a “stress”, como por ejemplo, por aumento de temperatura por encima de un
valor óptimo.
De factores de crecimiento los requerimientos comprenden ciertos aminoácidos y vitaminas
del grupo B como tiamina, riboflavina, ácido pantotético, niacina, etc., que representan para
muchas bacterias y levaduras factores esenciales en los medios sin los cuales no se produce
crecimiento celular. La mayor parte de las vitaminas son constituyentes de coenzimas. Otros
factores de crecimiento son las purinas, poliaminas, putrescinas, etc.
197
Capítulo 3
Streptomyces Aureofaciens
En algunos procesos existe la necesidad de efectuar otros agregados, aparte de los nutrientes
requeridos por los microorganismos y que representan los requerimientos específicos del proceso
considerado. En el caso de los precursores que
constituyen la base de una molécula que debe ser
sintetizada por el microorganismo, como el ácido
fenil acético para la penicilina. Otro ejemplo es
Bordetella Pertussis
el agregado de ciclo dextrinas en procesos de
producción de Bordetella pertussis que puede actuar como complejante de inhibidores de
crecimiento celular.
El agregado de cloruros o bromuros en el caso de algunos
Producción de estreptomicina a partir
antibióticos como cloro y bromotetraciclinas, tetraciclidas
de Streptomyces griseus con agregado
producidas por el Streptomyces aureofaciens, responde
de mánanos y barbitúricos cultivada en
también a requerimientos específicos para inhibir la sínteuna caja de Petri
sis de productos no deseados, como ocurre también con
el agregado de mananos y barbitúricos en la producción
de estreptomicina por S. griseus. El agregado de sulfato,
en el proceso de fermentación alcohólica, que favorece la
formación de glicerol, es otro ejemplo de un requerimiento
específico. El diseño adecuado tiene que ver con las características bioquímicas propias y evolución de los parámetros
de cada proceso. Por ejemplo, un proceso caracterizado por
un descenso continuo de pH, debido al uso de una sal de
amonio como fuente de nitrógeno, obliga a considerar en su diseño algún agregado que no
corresponda a una exigencia nutricional, como es el caso del control de pH del mismo. Son
efectuados por agregados al medio de agentes “buffer”
como mezclas de fosfatos o de carbonato de calcio o como Streptomyces Aureofaciens
más generalmente se hace, con agregados periódicos de
soluciones alcalinas que pueden efectuarse en forma más
conveniente mediante un control automático de pH. En un
medio específico el diseño para la producción de ácido
cítrico debe considerar la influencia negativa que para el
proceso tiene un exceso de hierro en su composición; por
lo tanto, dicho medio debe diseñarse de manera tal que su
preparación (a partir de diversas materias primas) considere una eliminación total del hierro y posterior agregado
del mismo en cantidades controladas.
198
Capítulo 3
2.1.3 Disponibilidad de los componentes
Independientemente de su presencia en el medio de cultivo, los nutrientes
deben estar disponibles para ser usados por la célula.
Es necesario mencionar la disponibilidad correspondiente a iones metálicos cuya concentración es modificada por quelación, ya que muchos
constituyentes del medio y productos del metabolismo actúan como agentes complejantes o precipitantes, por ejemplo aminoácidos, hidroxiácidos,
hidróxidos, y los aniones P04 y C03
Con el objeto de controlar su concentración y prevenir
la precipitación de los iones metálicos, es necesario o
esencial quelar el ion mediante algún agente quelante
agregado, como el EDTA (Ácido Etilendiaminotetraacético).
En medios complejos de uso industrial la situación es
aún más complicada, ya que existe una gran variedad
de sustancias orgánicas, las cuales pueden quelar,
secuestrar o absorber iones metálicos reduciendo la
concentración iónica disponible. Por ejemplo: aminoácidos, proteínas, ácidos orgánicos, polifenoles, polifosfatos y materiales coloidales. En el caso de material
insoluble presente en el medio de cultivo va a tener
una determinada capacidad de unión a elementos metálicos disminuyendo su concentración efectiva, como
ocurre también con los aminoácidos y proteínas que
Agente Quelante EDTA y los Aminopolitienen los grupos reactivos R-COO - , RHN- , RS- , O,
carboxilatos en la fermentación
que son los más importantes. La dinámica de formación del complejo está determinada por la constante
de equilibrio de formación del complejo metal- ligando, y por la velocidad
a la cual el equilibrio es obtenido. La constante de equilibrio para la formación del complejo del ión metálico (M) con el ligando (L) se expresa
de la siguiente forma:
[M L]
_________
K=
[M] [L]
199
Capítulo 3
Entonces las cargas del catión y ligando están omitidas. El valor de K es
prácticamente independiente de la naturaleza del ligando, que depende particularmente del ion metálico. Se puede hacer una lista de términos de valores
decrecientes de la constante de equilibrio como sigue:
Fe+3 > Pb+2 > Cu+2+ > Ni+2 > Co+3 > Zn+2 > Co+2 > Cd+2 > Fe+2 > Mn+2
> Mg+2> Ca+2 > Sr+2 > Ba+2> Na+1> K+1> y de la cual se puede deducir, por
ejemplo, que el ion Cu+2 estará fundamentalmente como complejo mientras que
Ca+2, Na+1 y K+1 estarán en forma de iones metálicos libres.
Por otro lado la velocidad a la cual se alcanza el equilibrio tiene también una
serie de orden decreciente de velocidades de acuerdo al ion:
Sr+2 > Ca+2 > Zn+2 >Mn+2 > Fe+2> Co+2> Mg+2> Ni+2.
De ambas consideraciones surge por ejemplo que cuando se alcanza el equilibrio
el ion Ca +2 estará casi siempre libre para ser utilizado y si está complejado
se hará rápidamente disponible; en cambio, el Mg+2 estará generalmente libre,
pero si está complejado se hará disponible muy lentamente. En la misma forma
se puede deducir que el Co+2 estará fundamentalmente en forma complejada
siendo disponible además a muy baja velocidad. Por esa razón ese elemento es
potencialmente limitante.
Concluyendo, es importante tener en cuenta la naturaleza de los compuestos
orgánicos que tienen capacidad para actuar como ligandos y sobre todo el ion
metálico considerado, ya que la concentración libre de éste es lo que interesa.
2.1.4 Materias primas fundamentales
De los componentes empleados en las industrias de fermentación, es importante
considerar diferentes aspectos como el costo de los mismos, la disponibilidad
y la estabilidad en su composición química. Si tenemos en cuenta que el costo
de los nutrientes representa entre al 10 y el 60% del costo total de mucho
productos obtenidos por fermentación, se hace prioritario disminuir el costo
de los medios. Las materias primas más importantes corresponden a fuentes
de carbono y de nitrógeno.
Las fuentes de carbono pueden ser: 1) Hidratos de carbono como glucosa o
dextrosa, sacarosa, lactosa, almidón, dextrina; 2) Alcoholes como el glicerol y
manitol; y 3) Hidrocarburos como hexadecano, octadecano y otros.
200
Capítulo 3
Son muy importantes también por su
disponibilidad y costo reducido otras materias
primas que contienen hidratos de carbono como
granos, melazas, celulosas, suero de queso, etc.
También se pueden emplear otros subproductos
o efluentes de industrias que por su contenido
en fuentes de carbono son interesantes
para algunos procesos como las vinazas de
destilería, alpechín y residuos sulfíticos, que son
sin embargo solamente útiles para procesos de
producción de biomasa destinados al consumo
animal, ya que si bien contienen hidratos de
carbono y otras fuentes de carbono asimilables
por los microorganismos, también contienen
muchas impurezas que impiden su utilización
en otros procesos por las dificultades y costo
elevado que presentan las operaciones de
separación y purificación de los productos.
extracción acuosa y concentración posterior
variando su tipo de acuerdo con la calidad
de carne, tiempo de extracción y temperatura
de la misma.
3) Extracto de levadura, que es disponible
en forma de pasta o polvo, y puede ser
obtenida mediante autólisis o plasmólisis de
la levadura, es básicamente una mezcla de
aminoácidos, péptidos, vitaminas solubles en
H2O y carbohidratos.
4) Extracto de malta, que es el extracto
soluble en H2O de la malta de la cebada y
5) “Cornsteep”, el agua de maceración de la
industria del maíz tiene mucha importancia
por su utilización como componente esencial
de los medios para la producción de varios
antibióticos y enzimas.
Las fuentes de nitrógeno de naturaleza inorgánica
más comunes como el amoníaco o las sales de También es importante la correcta elección de
amonio. Las orgánicas están representadas por una determinada fuente cuando se presentan
varios productos, como:
varias alternativas posibles, considerándose
los costos, la disponibilidad y el problema de
1) Hidrolizados de proteínas (Peptonas) impurezas que puede acompañar a las distintas
que son obtenidas por hidrólisis ácida o materias primas utilizadas.
enzimática de distintas fuentes proteicas
como carne de diferentes órganos y animales, 2.1.5Formulación
pescado, caseína, gelatina, harina de soja,
algodón, girasol, etc.. Mediante ajuste de la Ésta tiene que ver con los aspectos cuantitativos
relación enzima-sustrato y variando tiempo de los medios, es decir, debe establecer las
de hidrólisis es posible variar el tamaño concentraciones de cada componente para ser
de la cadena de polipéptidos. Aparte de utilizadas. Una aproximación con respecto a las
su función como fuente nitrogenada, las cantidades por utilizar de las diversas fuentes
peptonas aportan algunas vitaminas y sales lo da el conocimiento de la composición de
inorgánicas como fosfatos y suministran biomasa del microorganismo al ser empleado.
también algunos micronutrientes como Ca, Una composición elemental y típica de la biomasa
Zn, Fe y Cu.
es (en porciento de peso seco): Carbono,
2) Extracto de carne, que se obtiene por
201
Capítulo 3
46-48; Nitrógeno, 7-12; Fósforo, 1-3; Azufre, 0.5-1.0; Mg, 0.5-1%. Es decir,
que si queremos formular un medio para producir una determinada cantidad de biomasa debemos promover las distintas fuentes que aseguren
como mínimo las cantidades de elementos que deben ser suministrados.
Por el conocimiento de la estequiometría de crecimiento y de formación
del producto, es posible formular adecuadamente un medio. En general
puedes escribir para cualquier proceso de fermentación:
Fuente de C + fuente de N + 0 2 + minerales + nutrientes específicos
biomasa + productos + C02 + H20.
De la misma forma se pueden establecer balances de materia para otras
reacciones que incluyan productos y deducir de las mismas la cantidad de
biomasa y productos que se pueden obtener a partir de una determinada
cantidad de fuentes de carbono y de nitrógeno. Las otras fuentes de elementos menores y factores no son necesarias de incluir en las ecuaciones.
Con
este
criterio
podemos
establecer
entonces que para obtener una determinada
concentración de biomasa, por ejemplo 30
gl -1 , debemos formular el medio como
mínimo con 60 gl -1 de fuentes de carbono
asimilable, que es en el caso anterior la
sacarosa. Con respecto a las fuentes de
nitrógeno, ésta debe estar en concentración
tal, como para satisfacer la ecuación anterior,
que es 0.61 moles de NH3 o sea 10.37 g de
amoníaco, lo que representa 8.54 g de N2.
Ya tenemos por lo tanto, la cantidad de la
otra fuente fundamental para ser agregada. El
conocimiento de la composición centesimal de
otros componentes menores puede establecer
así las cantidades por agregar.
vitaminas del grupo B como la biotina, tiamina,
ácido pantoténico, etc. Esas vitaminas deben
estar por lo tanto presentes en el medio. Como
el proceso de producción de levadura es un
proceso industrial que interesa desarrollar con
costos de producción mínimos, es conveniente
estudiar las fuentes de carbono, nitrógeno y
de vitaminas y minerales más económicos y
disponibles que podamos encontrar. Surge así
la elección lógica de las melazas de caña de
azúcar o de remolacha que reúnen la mayor
parte de las condiciones. Del conocimiento
del efecto Crabtree y para evitar la formación
de alcohol y maximizar la producción de
biomasa surge la necesidad de implementar
una alimentación programada empleando
melaza como sustrato limitante, de lo cual
En este sentido, sabemos por otra parte que resulta la elección de un sistema de lotes
la levadura necesita para crecer algunas alimentado para la producción.
202
Capítulo 3
Al conocer los coeficientes de rendimiento para la formación de biomasa y
producto y los valores de la energía de mantenimiento será posible establecer
también los requerimientos de las fuentes de carbono necesarios para formular
un medio.
2.1.6Optimización
Pueden ocurrir situaciones en las cuales sea imperativo la optimización de los
medios de cultivo. Entre ellas podemos mencionar las siguientes:
1) No existencia de información respecto a coeficientes de rendimiento de
macro y microelementos para el cultivo del microorganismo determinado.
2) Existencia de limitaciones nutricionales ocultas, especialmente de microelementos y factores de crecimiento.
3) Uso de medios de cultivo conteniendo elementos en exceso respecto de
los requerimientos nutricionales del microorganismo en cuestión, que pueden causar inhibición del crecimiento.
4) Ensayo de sustancias estimulantes, activadoras e inhibidoras del crecimiento y formación del producto.
5) Empleo de fuentes nutricionales no convencionales.
La metodología más elemental consiste en realizar experimentos, en los cuales
se varía la concentración del componente por ensayar, manteniéndose constante las concentraciones de los demás ingredientes. Para organismos aerobios
generalmente se utiliza como sistema de cultivo erlenmeyers agitados. En este
caso, se analiza el efecto de la variable escogida sobre la velocidad de crecimiento y la concentración de biomasa obtenida.
Si bien el procedimiento anterior es simple, es evidente que hace falta una
gran, cantidad de trabajo preliminar, ya que el operador no conoce de antemano que nutriente es el limitante del crecimiento. Cuando son varios los posibles
nutrientes limitantes el método resulta poco práctico. Por otra parte, puede
ocurrir que la respuesta obtenida al variar la concentración de un componente
de los niveles de los otros, produzca interacción entre componentes. Se puede
mejorar mucho la optimización en un lote empleando técnicas estadísticas o
203
Capítulo 3
utilizando sistemas continuos con pulsos de componentes.
Utilizando cultivos continuos es posible obtener un cultivo limitado
por un sólo factor o sustrato a lo largo de todo el experimento,
pudiéndose conocer por lo tanto el efecto que su variación ejerce
sobre el cultivo al mantenerse los demás componentes constantes.
2.1.7Esterilización
Esterilizador tipo Jané
Es conveniente, al tratar este tema, dar una definición clara del
término y de otros relacionados, ya que a veces suelen producirse
confusiones. Esterilización significa la eliminación de toda forma de
vida de un medio o material, lo que se lleva a cabo generalmente
por medios físicos, por ejemplo, filtración, o por muerte de los
organismos por calor, productos químicos u otra vía.
Esta definición excluye por lo tanto
cualquier técnica que resulte solamente
en un daño a los microorganismos o
atenuación de la actividad de cualquier
tipo. La palabra desinfección se aplica a la
remoción o destrucción por cualquier vía
de organismos vivos que pueden causar
daño particular o infección. No significa
por lo tanto la destrucción de todos
los microorganismos, sino solamente
de aquellos que pueden producir un
resultado no deseado.
Autoclave para esterilizar alimentos y
otros productos
204
Un antiséptico es un desinfectante, o sea
un agente químico usado para destruir
microorganismos dañinos. Se utiliza en
general para agentes al ser aplicados en
animales o humanos.
Asepsia es la exclusión continuada de
microorganismos contaminantes. Así por ejemplo, el cultivo de
microorganismos en el laboratorio es llevado a cabo asépticamente
como en muchas fermentaciones industriales. El medio de cultivo
es esterilizado para remover toda forma de vida y luego inoculado
con el cultivo requerido. Se dice entonces que el sistema se
mantiene en condiciones asépticas.
Capítulo 3
Pasteurización es el término aplicado al proceso que se
utiliza para la destrucción de algunos de los microorganismos
posiblemente presentes en materiales sensibles al calor
como la leche y cerveza. Consiste en calentar la leche,
por ejemplo a 62 °C, mantenerla a esta temperatura 30
minutos y después enfriarla lo más rápidamente posible.
Esta técnica no es de ninguna manera un procedimiento
de esterilización. Es solamente un método para destruir
organismos patógenos y al mismo tiempo disminuir el
nivel de aquellos organismos que más pueden deteriorar
la leche.
Pasteurizador en acero inoxidable
Pasteurizador de placas para la
industria de lácteos
Fundamentalmente para efectuar la esterilización en Microbiología Industrial es para evitar la competición por los
nutrientes en medios de cultivo y permitir así que el cultivo
de microorganismos específicos que se utilizan en un proceso de fermentación de los rendimientos esperados en
biomasa y/o metabolitos específicos.
205
Capítulo 3
Métodos de esterilización
Los métodos de esterilización pueden ser de 3 tipos:
a) Por destrucción total de microorganismos
b) Por muerte o inactivación; y
c) Por eliminación con medios físicos.
El proceso violento llamado destrucción total implica
calentamiento apreciable del material, como ocurre con
la aplicación de una llama, que es lo que hacemos en el
laboratorio cuando flameamos un ansa de platino o las
bocas de tubo de ensayo o erlenmeyers. Otra manera
de destruir contaminantes es con el uso de poderosos
agentes oxidantes. Por supuesto ésta metodología, aunque
es efectiva, está muy restringida en su empleo.
La muerte o inactivación implica la eliminación de
microorganismos sin que exista necesariamente
desintegración de las células. Se puede efectuar por
calentamiento, seco o húmedo, por radiaciones o por
agentes químicos. El calor húmedo, generalmente en forma
de vapor bajo presión, es muy útil y de gran valor en la
esterilización en el laboratorio, que se efectúa en autoclave,
o en la industria
206
Capítulo 3
Actividad 2
a)
Formular un medio para la producción
de biomasa de levadura de panificación. Considera la formación de 100
g de biomasa a partir de 200 g de
sacarosa.
Práctica
b)
¿Cómo se lleva a cabo la esterilización
de gases líquidos?
C 27,06 / M 100 / Y 100 / N 27,84
C 19,61 / M 10,98 / Y 19,61 / N 0
C 44,71 / M 41,96 / Y 100 / N 16,86
C 69,02 / M 53,73 / Y 34,51 / N 10,2
207
Capítulo 3
208
Capítulo 3
Unidad 3 Productos producidos por fermentación
3.1 RAP Conoce los productos producidos en la
industria a través de los procesos de fermentación
3.1.1 Diversidad de productos y su obtención
La gama de productos formados por los distintos tipos de microorganismos
es sumamente amplia, desde moléculas muy simples como el etanol hasta
las muy complejas, como pueden serlo una enzima o un antígeno.
Se pueden entonces clasificar los productos como:
1. Productos de bajo peso molecular. Estos incluyen a alcoholes, ácidos
carboxílicos, aminoácidos, nucleótidos, antibióticos, etc.
2. Productos de alto peso molecular, los que a su vez pueden dividirse en:
2.1. Componentes estructurales: Polisacáridos, proteínas, antígenos, etc.
2.2. Enzimas: Pudiendo ser éstas intra o extracelulares.
La industria química “compite con los microorganismos” tan sólo en
la obtención de algunos productos de bajo peso molecular, como por
ejemplo, el etanol o el butanol, siendo los demás de dominio exclusivo
de los microorganismos y, por otra parte, la única fuente disponible para
el hombre.
Cualquiera que sea el producto que se desee obtener, son varios los
aspectos que deben considerarse. Estos según Pirt, pueden resumirse
como:
I. Selección de una cepa microbiana apropiada.
II. Determinación de los valores óptimos de temperatura, pH, presión
osmótica.
209
Capítulo 3
En procesos aerobios, además, es de fundamental importancia conocer el
requerimiento de oxígeno a fin de poder satisfacerlo.
III. Determinación y optimización de los requerimientos nutricionales y de
la concentración de biomasa.
IV. Modificación del genoma tendiente para incrementar la formación del
producto deseado.
Figura 1. Diversos productos que se obtienen por fermentación.
210
Capítulo 3
La formación de biomasa y de un
producto son procesos contrapuestos
aunque el producto es una consecuencia
de la actividad de los microorganismos;
luego la presencia de éstos también
es importante.
Los productos de bajo peso molecular,
se pueden clasificar según la función
que cumplan dentro del metabolismo.
Se pueden distinguir así tres grupos:
I. Productos finales del metabolismo
energético. Son ejemplos de este
Favorecer el metabolismo energético, especialmente el de los
grupo el etanol, ácido láctico, acético,
ácidos grasos a nivel del ciclo de Krebs
butírico, butanol, y otros compuestos
asociados a procesos anaerobios. Su
formación es consecuencia directa de la degradación de la fuente de
carbono para obtener energía.
II. Productos intermedios de metabolismo primario. Pertenecen a este grupo
los aminoácidos, los nucleótidos, las vitaminas, los ácidos orgánicos, y
pueden incluirse también biopolímeros como enzimas.
III. Productos de metabolismo secundario. Pertenecen a este grupo los
antibióticos, las toxinas, los alcaloides y las giberelinas
La obtención de los productos finales del metabolismo energético consiste
en contar con una concentración celular elevada sometida a condiciones
tales que el mantenimiento sea grande, lo cual puede lograrse, aumentando
la tonicidad del medio y también modificando la temperatura. Existe otra
alternativa que consiste en limitar el cultivo en nitrógeno, de modo tal que
las células se vean impedidas de duplicarse al no poder sintetizar más
componentes estructurales, y la fuente de carbono se derive, principalmente
vía mantenimiento, hacia la formación del producto. Por ejemplo la
obtención del etanol por levadura puede dividirse en dos etapas: en la
primera el proceso es aerobio y el medio de cultivo contiene una relación
de fuente de carbono a fuente de nitrógeno apropiada para obtener un
buen crecimiento. La segunda etapa se realiza en condiciones anaerobias
y en un medio con escasa concentración de fuente de nitrógeno y elevada
concentración de fuente de carbono, la cual es convertida prácticamente
en un 90% en etanol y C02. En este caso la tolerancia de la levadura al
211
Capítulo 3
etanol es un aspecto importante por considerar.
Los procesos de obtención de los productos intermedios de metabolismo
primario son aerobios y la formación de estos productos ocurre
principalmente en organismos que han sido sometidos a mutaciones o
que se los hace crecer en medios deficientes. En cualquier caso, lo que
se pretende es lograr una regulación anormal del metabolismo tal, que la
fuente de carbono y energía se derive hacia la formación del producto
deseado. Por ejemplo, para la obtención de lisina se emplean cepas
de Corynebacteriuin glutamicum que carecen de la enzima Homoserina
deshidrogenasa, de este modo resulta ser auxotrofo para metionina y
Treonina. Además la enzima deshidroxipicolinato sintetasa no es inhibida
por lisina. Ésta conjuntamente con la treonina ejerce inhibición concentrada
sobre la Aspartatoquinasa de modo tal que aún en este mutante no se
acumulará lisina si en el medio de cultivo hay treonina libre.
La estrategia para obtener lisina consiste en realizar el cultivo en
condiciones tales que la concentración de treonina libre sea mínima, lo
cual se consigue alimentando el cultivo con este aminoácido y tratando
de mantener su concentración en valores muy pequeños. Así se evita la
inhibición concertada, con lo cual la lisina, al no ejercer retroinhibición
sobre la dihidroxipicolinato sintetasa, se acumula en el medio de cultivo.
En general, y a diferencia de los productos pertenecientes al primer grupo,
no existe una relación directa entre la generación de energía y la síntesis
de los productos de este grupo. Volviendo al ejemplo de la lisina, por
cada mol formado se forman cuatro de NADH y se consume uno de ATP,
por lo que la formación de lisina está asociada en una formación neta de
ATP si se tiene en cuenta el poder reductor acumulado.
La cinética de formación de estos productos es más compleja que los
del grupo I, y no existe hasta el momento ninguna expresión simple que
abarque a todos.
En los productos de metabolismo secundario, históricamente se han
considerado a los metabolitos secundarios como aquellos que no son
indispensables para las funciones vitales del microorganismo, a diferencia de
los metabolitos primarios, aunque tal afirmación se encuentre actualmente
en revisión. Cualquiera que sea el caso, existen algunas características que
diferencian a este grupo del anterior.
212
Capítulo 3
Frecuentemente los precursores específicos para la biosíntesis de estos
productos son obtenidos por modificación de metabolitos primarios. Así
muchos antibióticos contienen en su molécula aminoácidos infrecuentes
como D-aminoácidos, N-metil aminoácidos, B-aminoácidos o iminoácidos;
o azúcares modificados, bajo la forma de dimetil aminoazúcares.
Por otra parte, estos precursores suelen ser limitantes de la biosíntesis.
Por ejemplo la adición al medio de cultivo de ácido fenil acético estimula
la producción de Bencil penicilina, los ácidos a-aminobutírico y a,ydiaminobutírico son limitantes de la biosíntesis de colistina. En estos
casos, la supresión de los mecanismos de regulación de la síntesis de los
precursores puede resultar en un incremento en la producción.
La característica de algunas enzimas del metabolismo secundario no
poseen alta especificidad por el sustrato. Un ejemplo bien conocido es el
de la penicilina aciltransferasa del Penicillican chrysogenum, que cataliza
el intercambio del resto a-aminoadipil de la penicilina N (amino adipil
penicilina), por restos acídicos hidrofóbicos (ver Figura. 14). La enzima
es específica para uno de los sustratos, el ácido 6-amino-penicilánico,
mientras que es relativamente inespecífica para el precursor de la cadena
lateral, el cual debe poseer el grupo -CH2- COOH terminal para ser
incorporado.
Por último, la mayoría de los productos de este grupo comparten la
propiedad de formarse cuando los microorganismos crecen a bajos valores
de velocidad. Se cree que una de las causas sería el fenómeno conocido
como represión catabólica ya comentado, por el cual estaría reprimida la
biosíntesis de las enzimas asociadas al metabolismo secundario cuando el
crecimiento ocurre a valores de velocidad altos, mientras que dejaría de
reprimirse a valores de velocidad bajos.
Por años, se utilizó lactosa como fuente carbonada para la obtención de
penicilina porque daba mejores rendimientos que la glucosa. La diferencia
radicaba en que la lactosa era metabolizada lentamente por el hongo, y
la glucosa rápidamente.
Ésta última como fuente carbonada, pero suministrándola lentamente al
cultivo a fin de regular u a valores compatibles con la síntesis de penicilina.
En caso de los
productos del grupo III comparten con el anterior la
necesidad de un adecuado suministro de oxígeno para su formación.
Cuando este requisito no es satisfecho los rendimientos disminuyen.
213
Capítulo 3
Actividad es 3 y 4
Haz un esquema de la biosíntesis de la lisina, empleando cepas de Corynebacteriuin glutamicum
Práctica
C 27,06 / M 100 / Y 100 / N 27,84
C 19,61 / M 10,98 / Y 19,61 / N 0
C 44,71 / M 41,96 / Y 100 / N 16,86
214
C 69,02 / M 53,73 / Y 34,51 / N 10,2
Capítulo 3
Indica algunas fórmulas genéricas de las penicilinas que se usan más
frecuentemente en el mercado.
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215
Capítulo 3
Actividad 5
Indica ¿cómo es el proceso de obtención de la penicilina a partir del Penicillican
chrysogenum?
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Práctica
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C 27,06 / M 100 / Y 100 / N 27,84
C 19,61 / M 10,98 / Y 19,61 / N 0
C 44,71 / M 41,96 / Y 100 / N 16,86
216
C 69,02 / M 53,73 / Y 34,51 / N 10,2
Capítulo 3
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217
Capítulo 3
Práctica 1
Equipo y material
- 1 litro de leche
- 3 cucharadas de yogur (entero
o descremado)
- 6 cucharadas de azúcar
- Termómetro
- Tiras para medir el pH.
C 27,06 / M 100 / Y 100 / N 27,84
C 19,61 / M 10,98 / Y 19,61 / N 0
Procedimiento
1. Se colocan en un recipiente la leche con el azúcar.
C 44,71 / M 41,96 / Y2.100
/ N 16,86
Medir el pH y anotar.
C
C
3. Calentar (sin llegar a hervir) durante 5 minutos. Luego,
enfriar
69,02 / M 53,73 / Ydejar
34,51
/ Nhasta
10,2los 45°C aproximadamente y agregar
el resto de los ingredientes (yogur, gotas de vainilla).
Mezclar bien y colocar en un termo.
100 / M 90,98 / Y 32,55
/N
22,35
4. Dejar
reposar
durante 7 a 8 horas.
. Cumplidas las horas establecidas, se obtendrán 10
vasos de yogur.
6. Medir nuevamente el pH
7. Colocar de inmediato en la heladera.
La sesión tendrá una duración de cuatro horas, y se deberá tomar nota de todos los datos que se consideren
importantes e interesantes.
218
Capítulo 3
Cuestionario de la práctica
1) ¿Cuál será el objetivo de utilizar una cucharada de yogur en la elaboración casera de este producto? ¿Con qué etapa de la elaboración industrial se
podría comparar?
2) ¿Qué función cumplirá el azúcar adicionado a la leche?
3) ¿Qué diferencias se observan de pH durante la experiencia? ¿A qué se
deben?
4) ¿Por qué en esta experiencia no se realiza la etapa de calentamiento a
90°C, pero sí se incuba a 45°C?
219
Capítulo 3
220
Capítulo 3
Unidad 4 Organismos mutantes
4.1 RAP Conoce la variedad y posibilidades de las mutaciones
de los organismos y su utilidad en la industria
En general los organismos aislados de la naturaleza productores de metabolitos de interés industrial producen a los mismos en niveles muy bajos;
por lo tanto, se hace necesario incrementar estos rendimientos para lograr
una mayor rentabilidad de los procesos.
Una forma de mejorar el rendimiento es mediante la optimización del medio de cultivo y de las condiciones de operación, pero esto está limitado
por la capacidad de síntesis máxima del producto deseado que tiene el
organismo. La otra posibilidad es el mejoramiento genético de la cepa.
En un organismo la productividad potencial es controlada por su genoma,
pudiendo el mismo ser modificado para incrementar los rendimientos. La
forma de reexaminar un organismo modificado; son las condiciones del
cultivo para lograr nuevamente la máxima productividad. Entonces los programas de desarrollo involucran una continua modificación genética del
microorganismo, seguida por una readaptación del medio de cultivo a los
nuevos requerimientos, mejoras de las condiciones de operación y también
de los procesos de extracción y purificación.
La obtención de cepas modificadas genéticamente se puede realizar por:
1) Selección natural de variantes,
2) Mutación inducida, y
3) Recombinación genética.
221
Capítulo 3
4.1.1 Selección natural
Siempre se debe tener en cuenta que en cada división
celular hay una pequeña probabilidad de que ocurra
un cambio genético, por lo cual no es sorprendente
que en una gran masa celular la población sea heterogénea. Esta distribución puede presentar problemas
de rendimientos debido a que en general las variantes
tienen menores niveles de producción que la población
parental. Estas variaciones definitivas (mutaciones) se
deben distinguir de las variaciones fenotípicas que dependen de las condiciones ambientales y que tienen
lugar en todas las células de la población que expresan la misma modificación fisiológica, dentro de las variaciones permitidas por su genotipo. En las mutaciones
espontáneas el elemento responsable de la mutación
no es conocido, pero igual que las inducidas (el factor
mutagénico se conoce) son estables y hereditarias y
tienen una frecuencia estadísticamente medible (tasa
de mutación).
La frecuencia de éstas últimas varía entre 10 -6 a 10
-9 mutaciones por genoma y por generación. Por lo
tanto si se considera un valor de 10 -7 se deberá estudiar un gran número de organismos (> 10 7 ) en la
búsqueda del tipo deseado.
En la selección de variantes naturales, una práctica
que todavía es utilizada se refiere a la observación
de las características morfológicas de las colonias, las
cuales, en manos de un operador avezado, se asocian
con mayor o menor productividad, lo que permite seleccionar y posteriormente estudiar los clones aislados.
Estas investigaciones involucran una etapa de crecimiento seguida por ensayos de evaluación del producto. Siendo más adecuado realizar las experiencias en
Erlenmeyers de hasta 500 ml, ya que si bien demanda
una considerable mano de obra, los resultados de en-
222
Capítulo 3
sayos en tubos o pequeños frascos son menos confiables.
A veces es posible el diseño de un procedimiento simple de “screening”
selectivo para un tipo particular de mutantes. Por ejemplo, células no mutadas que mueren en un plaqueo por selección de mutantes resistentes
a drogas, metales, etc. En estas condiciones se aíslan mutantes con un
esfuerzo mínimo aún de poblaciones donde la tasa de mutación es menor
a 1’000,000.
Cuando se comparan los aumentos en los rendimientos de cepas obtenidas por mutaciones naturales como las que resultan del empleo de un
agente tal como la luz ultravioleta, se observa, en general, que con agentes como el mencionado, los incrementos en productividad son superiores
y con una mayor tasa de mutación.
Las designaciones de las diversas partes que aparecen
en la ilustración muestran la
mutación del microorganismo, obtenida y adaptada por
el Grupo de Nanomáquinas
Protónicas (Protonic NanoMachine Group) de la Universidad de Osaka.
223
Capítulo 3
4.1.2 Mutación inducida
Transición inducida por
etilmetanosulfonato.
Este procedimiento es mediante
el empleo de un agente determinado que implica dos etapas, el
tratamiento de la población con el
mutágeno elegido y luego el aislamiento de los mutantes para su
posterior ensayo y selección. Empíricamente el empleo de diferentes
agentes resulta en el aislamiento
de distintos “espectros” de mutantes. La elección de un agente mutagénico depende en general
de consideraciones prácticas. En algunos de los casos es más
conveniente el empleo de más de uno en lugar del uso masivo
de uno solo. La técnica por emplear puede producir una alta
tasa de mutación o puede favorecer la separación de un número reducido de tipos deseables de un gran número de productores mediocres. Hasta donde sea posible el aislamiento del
mutante debería utilizar la característica mejorada del mismo
como factor de selección. El incremento de su productividad
podría ser el resultado de una modificación en los mecanismos
de control que limitan el nivel de producción y/o de una variación en los precursores que llevan al producto. Por lo que
el conocimiento de las rutas y mecanismos de control de la
biosíntesis de un producto facilitan la estrategia por seguir en
el aislamiento. En los programas de búsqueda y selección, es
importante tener una alta proporción de mutantes entre la población sobreviviente al tratamiento, debido a que sólo estos
individuos son los estudiados. Con el incremento de la dosis del
mutágeno en general se incrementa esta proporción, aunque
para cada mutágeno y cada organismo hay una dosis óptima.
Los agentes mutagénicos pueden ser agrupados en:
1) Físicos, como la luz ultravioleta, que es un mutágeno muy
conveniente. La longitud de onda puede variar de 200 a 300
nm y el tiempo de exposición entre 0.5 y 20 minutos, dependiendo de la sensibilidad del organismo y tratando de lograr
un porcentaje de muerte entre el 90 y 99.9%. Otros agentes
como rayos X y rayos V son actualmente poco utilizados.
224
Capítulo 3
4.1.3 Mutantes con niveles mejorados de metabolitos primarios
Representación esquemática de la síntesis de los meta-
Metabolitos primarios son aquellos esenciales para la vida de un microorganismo como
por ejemplo, aminoácidos, nucleótidos, vitaminas, ácidos orgánicos. Antes de considerar la selección de este tipo de mutantes,
es necesario conocer los mecanismos de
control involucrados en la biosíntesis de estos metabolitos. Las concentraciones de los
mismos están reguladas por sistemas de
control por retroalimentación “feed back”.
Los dos principales sistemas involucrados
son inhibición y represión “feed back”.
bolitos principales producidos por S. cerevisiae duran-
En el sistema de la inhibición, el producto
final de una vía metabólica inhibe la actividad de una enzima (normalmente la primera) de su vía de formación, cuando se ha
sobrepasado un valor máximo de concentración intracelular de dicho producto (caso de
biosíntesis de aminoácidos). La primera enzima de la vía es de tipo “alostérica”, lo que
significa que en este caso el producto final se une a ella en el centro regulador (no
compite con el sustrato por el centro activo, como en la llamada inhibición competitiva),
afectando la unión de la enzima al sustrato. Es un control fino y casi instantáneo.
te la fermentación alcohólica
En el sistema de la represión es aquel donde el producto final de una vía metabólica previene la
síntesis de una enzima o de todas las que catalizan la vía mencionada. Esto ocurre en el nivel
de ácido desoxirribonucleico (ADN), impidiendo la transcripción del gen a ácido ribonucleico
mensajero (ARNm). Este mecanismo es de acción más lenta que el anterior, ya que permite
actuar a las enzimas preformadas.
Los mecanismos de regulación son más complejos en caso de vías biosintéticas ramificadas
donde los productos de cada brazo son raramente requeridos por el organismo en igual proporción. Los procesos de control de estos son los siguientes:
a) isoenzimas
b) concertado o multivalente
c) cooperativo
d) acumulativo
e) secuencial.
225
Capítulo 3
debido a que los esporos germinados por su mayor
tamaño son retenidos en el filtro.
Los mutantes auxotróficos se utilizan para producir
grandes cantidades de muchas sustancias de interés,
los mismos no son adecuados para la obtención de
productos que controlan independientemente su síntesis. Un caso típico es el que figura a continuación,
donde se sintetiza un producto P.
Las letras minúsculas indican las enzimas que intervienen en el proceso. En este caso si P es el producto
requerido, no es apropiado tener un auxótrofo. La solución es modificar el organismo de tal forma que la
primera enzima (a) no reconozca la presencia de niveles inhibidores de P. El aislamiento de tales mutantes
se puede alcanzar a partir de mutantes resistentes a
metabolitos análogos y/o de revertantes.
Cuando metabolitos análogos (compuestos similares a
otros en su estructura) han ampliado el rango de inhibidores, se obtienen mutantes resistentes.
En el aislamiento de este tipo de mutantes se puede
emplear la técnica de gradiente en placa, en la cual
existe una variación en la concentración del análogo
en un sentido de la placa, presentando la misma, zonas de escaso crecimiento por altos niveles del análogo tóxico desde donde es posible aislar los mutantes
resistentes, para posteriormente ser estudiados en relación con la producción de un producto P.
Existe posibilidad de mejorar los rendimientos de este
tipo de productos es el empleo de revertantes. En este
caso, un mutante auxotrófico para P (no produce la
enzima “a”) es sometido a una segunda mutación con
el objeto de obtener revertantes que elaboran el producto final en mayores niveles (la enzima “a” producida
no reconoce en control de P).
226
Capítulo 3
Mutantes resistentes a análogos de aminoácidos han sido empleados en
procesos de mejoramiento de cepas, para la obtención de antibióticos.
Uno de los mejores ejemplos de mutantes modificados en la permeabilidad es el caso de la fermentación de ácido glutámico. Se ha aislado
un mutante de Corynebacterium glutamicum, cuya permeabilidad puede
ser modificada por el nivel de biotina. O sea la permeabilidad celular es
controlada por la composición del medio de cultivo; en esta forma el
organismo puede excretar glutamato (50 g) con bajas concentraciones de
biotina (5 µg). Esto sugiere la posibilidad de modificar genéticamente la
permeabilidad celular para incrementar la productividad.
4.1.4 Mutantes productores de enzimas de interés industrial
Se toman en cuenta las enzimas degradativas, cuya producción puede ser controlada por inducción, represión
“feed back” y/o represión catabólica.
Cuando pretenden alterar los mecanismos de inductor
y aún en presencia de represores, a esto le llamamos
técnica de mutación. Éstas pueden tener lugar en un
gen regulador, eliminando la producción de un represor
activo, o si se producen en el operador, se podría evitar
la unión del represor. Cuando se producen enzimas inducibles en ausencia de inductor se denominan mutantes
constitutivos. Los mismos pueden ser aislados a partir de
un cultivo continuo en el cual el sustrato inductor esté en
concentraciones limitantes, lo cual favorece el desarrollo
de los mutantes constitutivos sobre la población inducible; empleando inductores débiles o utilizando ciclos con
y sin inductor, tratando de favorecer el enriquecimiento
en la población del mutante constitutivo, ya que al transferir a un medio con inductor, el tipo inducible requiere
un tiempo de inducción que no lo requiere el constitutivo.
Para la selección de mutantes resistentes a la represión
catabólica pueden aprovecharse las posibilidades del sistema continuo empleando un medio de cultivo con el
sustrato de la enzima y el represor catabólico. En estas
condiciones, el organismo capaz de emplear ambos sus
227
Capítulo 3
tratos tendría una ventaja competitiva y podría ser seleccionado a una determinada velocidad de dilución.
4.1.5 Mutantes con mejores rendimientos de metabolitos secundarios
Las sustancias como los metabolitos secundarios no imprescindibles para las
funciones vitales, como por ejemplo alcaloides, toxinas, antibióticos, giberelinas, etc. La relación entre metabolito primario y secundario presenta todavía
numerosos interrogantes en relación con los mecanismos que controlan la
síntesis de estos últimos. En ciertas fermentaciones de antibióticos la velocidad
de crecimiento regula la formación de enzimas biosintéticas. En el caso de la
gramicidina S (GS), las GS sintetasas se forman en la última parte de la fase de
crecimiento exponencial. Las enzimas, después de alcanzar un pico en sus actividades específicas, desaparecen rápidamente al entrar la población en fase
estacionaria. Los estudios de este producto en cultivo continuo permitieron
establecer una
La glucosa y la fuente de nitrógeno (en especial amonio) si es rápidamente
metabolizada ejerce represión catabólica. Un ejemplo es la producción de cafalosporinas por Streptomyces clavuligerus, la cual es suprimida por amonio.
Debido a que la producción de estos metabolitos es afectada por mecanismos
de control genéticamente determinados, las mutaciones pueden tener efectos
importantes en el mejoramiento de cepas. Los programas iniciales en la industria de antibióticos inducían mutaciones sobre células o esporos mediante
el empleo de agentes físicos y químicos. Si uno repasa el caso típico de la
penicilina en el cual las primeras cepas de Penicill um chrysogenum producían
alrededor de 20 unidades por ml ,(20 U /ml), se observa que las técnicas de
mutación clásica han permitido obtener mutantes adecuados para la aplicación
posterior de técnicas más recientes como la fusión de protoplastos y las de
clonaje de genes.
En general, en un programa de mejoramiento, en que los saltos en la producción
al inicio del programa son importantes, después la selección de mutantes super
productores se vuelve cada vez más difícil. Con referencia a los estudios de
“screening” en placas, un factor importante es la composición del medio sólido
para lograr que la cepa pueda expresar toda su capacidad productora. En algunos casos las condiciones de limitaciones de nutrientes, que favorecen el
228
Capítulo 3
comienzo de la producción de antibióticos en medio líquido no son alcanzadas en medio sólido; sin embargo, esto se puede corregir suprimiendo
la principal fuente de carbono y reduciendo, por ejemplo, el contenido de
agua de macerado de maíz, como en el caso de penicilina.
Con base en la experiencia adquirida en el curso de los trabajos de
mutagénesis-selección, establecer una correlación entre los caracteres
fisiológicos o bioquímicos y la producción del microorganismo, en este
sentido pueden a veces intervenir en la selección en medios sólidos criterios morfológicos, pigmentación de colonias, resistencia al antibiótico
producido, etc.
4.1.6 Recombinación genética
Para la amejora de una cepa industrial empleando técnicas de mutagénesis selección conduce a la creación de líneas divergentes. Una forma más
lógica en tal programa de mejoramiento sería reagrupar las potencialidades de distintas variantes con el objeto de seleccionar la mejor combinación de genes responsables de codificar la producción de determinado
metabolito.
Los trabajos de Hopwood (1977) muestran que es posible lograr la recombinación genética, definiendo por tal a cualquier proceso que genere
nuevas combinaciones de genes los cuales estaban originalmente en individuos diferentes. Todos los procesos no meióticos en células vegetativas
que llevan a recombinación son llamados parasexuales y aparecen, tanto
en organismos procariotes como eucariotes.
Pueden intercambiar los virus material genético entre cepas heterogénicas
después de una infección mixta en el mismo huésped. El fenómeno de
recombinación en bacterias se observa en: 1) conjugación, en donde la
transferencia de material genético se realiza a través de pilis, teniendo
algunas características de un proceso sexual; 2) transducción, en el que
la transferencia de ADN de una célula a otra se realiza mediante una
partícula viral que actúa como vector; y 3) transformación, donde la recombinación puede ocurrir después de la inserción experimental de un
ADN aislado, a una bacteria receptora.
El material genético entre diferentes especies puede intercambiarse también alcanzando la fusión celular. En este caso, lo primero es la preparación de protoplastos, los cuales son células que han perdido su pared
celular externa y son limitadas solamente por su membrana, sometiendo
una suspensión celular a la acción de enzimas degradativas de la pared
229
Capítulo 3
(lisozima) en un medio isotónico, para minimizar la ruptura por efectos
osmóticos. Los protoplastos de los cultivos que se desea fusionar, son
mezclados y fusionados en presencia de un agente inductor (polietilenglicol 50%) y de dimetil sulfóxido en algunos casos, luego de lo cual se
siembran rápidamente en un medio completo para regenerar las células.
La incubación de protoplastos resulta en regeneración de la pared celular
y reversión a una célula de morfología normal, lo cual es una propiedad
crítica, ya que después de la fusión se desea recuperar un organismo, el
cual pueda ser cultivado normalmente en pequeña y gran escala. La fusión
celular es seguida por fusión nuclear.
La técnica de fusión celular se emplea en la obtención de hibridomas
que son células que se obtienen por fusión de linfocitos con células de
mieloma (cáncer de piel) de ratón u otro animal. Cada célula de hibridoma sintetiza una sola especie molecular de anticuerpo. El cultivo de este
tipo de células produce anticuerpos monoclonales, los cuales tienen una
enorme importancia en reactivos de diagnóstico, en la purificación de moléculas por su alta afinidad específica y como vectores de drogas u otros
reactivos para combatir tumores.
4.1.7 Obtención de nuevas cepas por ingeniería genética
La unión entre las técnicas bioquímicas (1970) para manipular el ADN in vitro
con las técnicas genéticas para transferir el ADN de una célula a otra, es la
nueva metodología resultante conocida con el nombre de ingeniería genética
que ha revolucionado el campo específico de la Biotecnología.
Por medio del procedimiento de clonado de ADN, genes de cualquier
tipo pueden ser tomados de su ambiente natural, analizados, alterados y
reinsertados en el mismo tipo de organismo o en otro diferente. Así que la
producción de solventes, productos químicos, hormonas, antígenos, enzimas
y otras sustancias de interés farmacológico puede realizarse en grandes
cantidades, a través del clonado de genes específicos en organismos que
pueden ser desarrollados en escala industrial. En una fermentación, su éxito
se da con base en el incremento del rendimiento de un producto; aumentar
su velocidad de formación, eliminar productos indeseables o la inhibición
por un producto final, se puede alcanzar, al menos en principio, mediante
el empleo de técnicas genéticas y estrategias que involucran metodología
de ADN recombinante in vitro. Esta metodología ha contribuído además al
conocimiento de las funciones del ADN, a la organización de los genes, a la
regulación de la expresión y a la estructura primaria de proteínas.
230
Capítulo 3
El principal aspecto del clonado es la propagación de un fragmento determinado
de ADN en una línea celular en crecimiento. Este fragmento, para poder
propagarse, debe ser unido a una molécula transportadora o vector, el cual
sí es capaz de multiplicarse en el huésped.
El clonado de genes ha sido gracias a una serie de descubrimientos
fundamentales. Como la puesta en evidencia de enzimas denominadas
endonucleasas de restricción, las cuales reconocen y cortan el ADN en sitios
bien definidos, generando fragmentos de distintos tamaños, determinados por
la distancia que separa cada sitio de restricción ubicado al azar sobre el
genoma.
Entonces es necesario hablar de distintos tipos de enzimas de restricción. Las
de tipo II, catalizan la ruptura de dobles hebras en sitios donde reconocen
secuencias de 4 o 6 bases de longitud. Se ha encontrado que los sitios de
reconocimiento se leen igual en ambas hebras de ADN. En algunos casos la
ruptura del ADN se produce en sitios opuestos de las dos hebras rindiendo
fragmentos romos (Hae III), mientras que en otras ocasiones la ruptura se
produce en forma de escalones, dejando extremos “cohesivos” (Eco RI). En
todos los casos la enzima hidroliza enlaces fosfo-diester en el lado 3’ dejando
extremos libres 3’ -OH y 5’ -fosfatos. Los extremos romos resultantes de
un corte pueden transformarse en cohesivos añadiendo a los extremos 3’,
nucleótidos (poli “A” a uno y poli “T” al otro) por acción de una transferasa
terminal.
Clononado de genes a través
de enzimas endonucleasas
restricción
231
de
Capítulo 3
Actividad es 6, 7 y 8
Hacer un esquema empleando dos técnicas de
selección al azar, de mutantes obtenidos después de un tratamiento.
Práctica
C 27,06 / M 100 / Y 100 / N 27,84
C 19,61 / M 10,98 / Y 19,61 / N 0
C 44,71 / M 41,96 / Y 100 / N 16,86
232
C 69,02 / M 53,73 / Y 34,51 / N 10,2
Capítulo 3
Uno de los avances fundamentales en la Ingeniería Genética fue el descubrimiento de
enzimas que pueden unir extremos libres de
hebras de ADN.
¿Cómo pueden ser ligadas moléculas separadas de ADN de doble hebra?
¿Qué se requiere para la transferencia y expresión de un ADN “extraño” en una célula
huésped?
233
Capítulo 3
234
Capítulo 3
Unidad 5 Métodos de conservación y preservación de cepas microbianas
5.1 RAP Conoce y maneja los métodos de conservación y
preservación de cepas microbianas
Los métodos de conservación y preservación de microorganismos, se llevan a
cabo por la importancia que tienen estos microorganismos para la sociedad;
se expone la importancia de los microorganismos para la sociedad, los objetivos de un buen método de preservación y los criterios por considerar para
la elección de la(s) técnica(s) más apropiada(s).
5.1.1 Métodos de elección o de conservación a largo, mediano y
corto plazo
Desde la antigüedad los microorganismos han sido empleados como materiales esenciales de trabajo en la obtención de medicamentos (antibióticos,
vitaminas y aminoácidos), elaboración de alimentos (pan, queso, leche, bebidas y licores) y fabricación de solventes y reactivos, entre otras aplicaciones.
El aumento en el uso de estos materiales biológicos en la biotecnología y la
protección medioambiental han fortalecido la necesidad de mantener los cultivos microbianos, de manera que las propiedades que los hacen importantes
permanezcan estables.
No es tarea fácil la preservación de cepas microbianas, ya que deben garantizar la viabilidad, pureza y estabilidad genética de los cultivos, características
que coinciden con los objetivos de un buen método de conservación. El conocimiento de las peculiaridades de estas técnicas de preservación existentes
para su correcta aplicación, así como el seguimiento de las propiedades de
las cepas, propician su empleo como inóculo confiable en la industria, la docencia y la investigación.
Muy a menudo la elección de la técnica más adecuada para conservar cultivos microbianos resulta difícil, pues deben tomarse en consideración los criterios de viabilidad y pureza de las cepas, cambios poblacionales y genéticos,
número
235
Capítulo 3
y valor de los cultivos, costo, suministro y transporte de cepas, así como
la frecuencia del uso de los cultivos.
El método que se elija debe garantizar la supervivencia de al menos el
70 % de las células por un período considerable de tiempo, de forma tal
que la población sobreviviente se asemeje a la original como sea posible,
conserve las propiedades de importancia de los cultivos y minimice la
ocurrencia de los eventos genéticos. De igual manera debe reducir al
mínimo el riesgo de contaminación y permitir que la pureza del cultivo
permanezca inalterable.
En relación con el número y valor de los cultivos, debe considerarse
el tiempo para ser empledo por los curadores en la preservación
inicial, manipulación y control periódico de las cepas, el espacio de
almacenamiento disponible y su importancia, al ser empleadas en su
mayoría como materiales de referencia en el aseguramiento de la calidad
microbiológica. Es recomendable entonces la selección de al menos 2
métodos de conservación que brinden seguridad y reduzcan los riesgos
de pérdida durante el almacenamiento.
En cuanto al costo de la conservación de cepas se incluyen los costos de personal,
equipos y su mantenimiento, materiales y facilidades generales (almacenamiento
y poder de abastecimiento). A esto se le suma la distribución, para la cual
se necesitarán réplicas conservadas y empaquetadas convenientemente que
permitan la llegada al lugar de destino en las mejores condiciones. Los
microorganismos son enviados por varios medios: correo aéreo, postal o a través
de las manos, de un laboratorio a otro dentro de un mismo país y con frecuencia
a través de las fronteras o continentes. Su distribución y manipulación está
regulada en el ámbito internacional y nacional,
y para su transportación es necesario el uso
del “triple” empaque para asegurar que todo
el personal involucrado en este proceso esté
protegido de la exposición a cualquier agente
contenido en el envase. Algunos cultivos son
empleados como cepas controles, cepas de
ensayo, cepas de producción industrial
236
Colocación de cajas Petri dentro de la estufa la cual se mantiene a temperatura constante
para el control de cepas donde
se ubican cepas de ensayo y
cepas de producción industrial.
Capítulo 3
y pueden ser utilizadas frecuentemente en un laboratorio. En estos casos,
la facilidad del recobrado y el riesgo de contaminación de los cultivos
necesitan ser considerados.
Se encuentran disponibles variadas técnicas para la conservación de
microorganismos y para eso debe considerarse lo recomendado por la
Federación Mundial de Colecciones de Cultivos (WFCC, siglas en inglés), en
sus guías generales, la cual enuncia que por seguridad y para minimizar
la probabilidad de pérdida de las cepas, cada una debe ser mantenida
por al menos 2 procedimientos diferentes. En general, existen 3 categorías
en las que se agrupan los métodos de preservación, según el tiempo en
que permanecen viables las células conservadas, que son los métodos de
conservación a largo, mediano y corto plazos.
Una de las categorías es la congelación (a –70 °C y –196 °C) y la
liofilización como técnicas que minimizan al máximo el riesgo de cambio
genético en las células y las mantienen viables por 10 años o más,
ventajas que han condicionado su extensa utilización para conservar
disímiles materiales biológicos (cultivos de hongos, bacterias y levaduras,
algas, suero, células sanguíneas, entre otros) y que sean reconocidas
como técnicas de elección. Su costo es alto por los equipos que emplean
estos métodos, dificulta su implementación en muchas instituciones, las
que en ocasiones hacen uso del servicio de mantenimiento y conservación
mediante estos, los cuales brindan colecciones de cultivos reconocidas.
Las de mediano plazo, son las técnicas con las que se logran mantener
la viabilidad de los cultivos entre 2 y 5 años. En este grupo se destacan:
la desecación en diferentes soportes (arena, sílica gel, perlas de vidrio)
donde la paralización del crecimiento se produce por eliminación del agua
disponible), el almacenamiento en tierra, parafina líquida y la suspensión
en agua estéril (destilada o de mar), métodos bien documentados en
especial para los hongos.
En el caso de la resiembra periódica, ésta permite la supervivencia de
los cultivos en cortos períodos de tiempo, por eso se reconoce como
un método de conservación a corto plazo. En ésta transfiere el cultivo
del medio seco a uno fresco proporcionándole las condiciones óptimas
de crecimiento, lo que condiciona el elevado riesgo de contaminación y
variabilidad de las características de las cepas, las cuales constituyen sus
principales desventajas.
237
Capítulo 3
5.1.2 Métodos alternativos
Se utilizan cuando no se pueden emplear los métodos de elección, bien por
carecer de los equipos necesarios o porque la cepa microbiana no resiste los
tratamientos de la conservación por estos métodos. Se recomienda tener en
cuenta que nunca se debe usar un único método alternativo, sino que es mejor
conservar el microorganismo empleando varios de estos métodos.
a). Conservación por transferencia periódica.
Se guarda la cepa microbiana en forma de cultivo activo en
el medio de cultivo en el que ha crecido. Sin embargo, estas
células no pueden permanecer indefinidamente en el mismo
tubo, porque al seguir activas excretan productos tóxicos del
metabolismo que se acumulan, provocando el envejecimiento
y muerte celulares, por lo que es necesario transferirlas a otro
tubo con medio de cultivo fresco. No es el mejor método
para conseguir la estabilidad genética, puesto que al estar
las células creciendo hay una alternancia de generaciones,
y al cabo del tiempo las células que se están guardando
serán descendientes lejanas de las células iniciales y es
posible que ya no conserven algunas de sus características.
Si se va a utilizar este método es aconsejable retardar el
envejecimiento y alargar los periodos entre dos resiembras.
Se puede conseguir de varias maneras como por ejemplo:
disminuyendo la cantidad de inóculo; rebajando la proporción
de algunos nutrientes en el medio de cultivo; inoculando en
picadura los microorganismos que son anaerobios facultativos,
ya que el crecimiento en presencia de oxígeno es más rápido
y origina productos generalmente tóxicos; y almacenando los
cultivos a 4ºC - 8ºC. A veces también se suele recubrir el
crecimiento con una capa de aceite mineral estéril. Con esto
se consigue también evitar en la medida de lo posible la
desecación del medio de cultivo, que podría ser tóxico para
las células al aumentar su concentración. Hay que tener en
cuenta que los microorganismos muy aerobios, como por
ejemplo los hongos filamentosos, no se pueden guardar en
tubos completamente cerrados. Por último, otro inconveniente
que tiene la transferencia periódica es
238
Capítulo 3
que la contaminación de los cultivos resulta más fácil
al tener que manejar los tubos a lo largo del tiempo
y también por la posibilidad de entrada de ácaros en
los mismos.
b). Conservación por suspensión en agua destilada o
en agua de mar estéril.
Es un método alternativo y que da altos porcentajes
de viabilidad en diversos tipos de microorganismos,
tanto hongos filamentosos como levaduras y algunas
bacterias. Aquí se suspenden en agua estéril unas
cuantas células del cultivo que se quiere conservar. Se
prepara en criotubos donde la concentración celular no
debe ser superior a 104 - 105 células/ml en el caso
de bacterias y levaduras. Para los hongos filamentosos
que no esporulan, se pueden poner en suspensión
trocitos de agar con el crecimiento del hongo. En el
caso de microorganismos marinos, la suspensión se
hace en agua de mar diluida.
Los resultados obtenidos en la conservación de
microorganismos por este método muestran altos
porcentajes de viabilidad en períodos a veces superiores
a 5 años. La estabilidad para caracteres morfológicos
y fisiológicos es buena, pero no se ha comprobado
para caracteres específicos como la virulencia, el poder
fermentativo, etc.
239
Capítulo 3
Práctica 2
Determinar la influencia de la actividad del agua, pH y temperatura en el crecimiento de aspergillus penicillioides y a. Terreus aislados de la carne seca y
salada de atún listado (katsuwonus pelamis).
Para la realización de esta práctica se utilizan dos especies de hongos pertenecientes al género Aspergillus, identificados como A.penicillioides y A.terreus,
ambos mohos se escogieron por su predominancia y efecto de deterioro en la
carne seco-salada del atún listado (Katsuwonus pelamis), Para su aislamiento
se emplean como medio de cultivo el agar MEA (Malt Estract Agar, Merck) con
20% de sacarosa y NaCl (5%) y Potato Dextrosa Agar (PDA, Merck) acidificado
con 2 gotas de ácido tartárico al 10%. A todos los medios se les determina la
aw, empleándose un medidor del punto de rocío (Decagon, cx-2) previamente
calibrado con una batería de soluciones salinas saturadas.
de los
CIdentificación
27,06 / M 100
/ Y hongos
100 / N 27,84
Se efectúa a partir de cultivos puros, utilizándose como
C 19,61 / M 10,98 / Y 19,61 / N 0
medios Agar Czapek, Agar DG 18 (Dichloran 18% Glicerol
Agar, para especies xerofílicas) y PDA acidificado. Se realizan montajes
Para la
identificaC húmedos
44,71 / yMmicrocultivos.
41,96 / Y 100
/N
16,86
ción hasta el nivel de especie se deben considerar en forma
minuciosa las características macroscópicas de cada uno
C 69,02 / M 53,73 / Y 34,51 / N 10,2
de los hongos.
C 100 / M 90,98 / Y 32,55 / N 22,35
Conservación de las cepas aisladas
Las cepas de mohos aisladas se pueden resembrar en tubos de ensayos
con el medio PDA inclinado con adición de 20% de sacarosa y NaCl al 5%.
Se deben incubar a 25°/± 1°C hasta la
aparición de colonias bien formadas y
se conservan en refrigeración a 5°C ±
1°C hasta su posterior utilización.
240
Capítulo 3
En las siguientes figuras se tiene en A)
se tiene la colonia de aspergillus penicillioides, y en B) se tiene la morfología microscópica típica mostrando la
cabeza conidial columnar uniseriada
las demás figuras muestran cómo se
desarrolla el aspergillus penicillioides
en medios de cultivo en cajas Petri.
Aspergillus Penicillioides
241
Capítulo 3
5.1.3 Métodos restringidos
No son los más empleados, pero a los que es necesario recurrir para
conservar grupos de microorganismos muy determinados que no resisten
bien la liofilización o la congelación, como por ejemplo los
géneros bacterianos Spirillum, Rhodospirillum, etc. Los
cuatro métodos que vamos a citar se basan en la
paralización del crecimiento por eliminación del
agua disponible para las células.
a).-Desecación en papel de filtro.
Se usa un papel bastante absorbente
(Whatmann nº 3) que se impregna con una
solución muy densa de células y se deja
secar al aire (en condiciones estériles). Hay
posibilidad de desecarlos por el procedimiento
que se llama desecación líquida (L-Dry) porque
se utiliza para ello el liofilizador, pero sin que
haya habido congelación previa de las células.
El vacío producido por el liofilizador deseca las
células, pero hay que evitar que un vacío excesivo
provoque evaporación brusca con ebullición o que la
temperatura disminuya demasiado, ocasionando la congelación
incontrolada de las células.
b).-Desecación en suelo, arena, sílica - gel, etc.
Se añaden las células a estos sustratos que las protegerán al desecar.
Los microorganismos productores de esporas se pueden conservar durante
bastante tiempo por este método.
c).-Desecación en bolitas de alginato.
. Las células se encuentran en una matriz de alginato y la eliminación
del agua se hace por tratamiento con soluciones hipertónicas sucesivas y
posterior desecación al aire hasta que se pierde un 70% de su contenido en
agua, lo cual resulta ser bastante eficaz. Estas bolitas de alginato se pueden
conservar en tubos cerrados herméticamente y a temperaturas de entre 4ºC
y 18ºC, pudiéndose guardar incluso a –80ºC debido al bajo contenido en
agua de las células y la protección que suministra el soporte de alginato.
Se está utilizando incluso para la conservación de algas y células vegetales.
242
Capítulo 3
d).-Desecación en cloruro de sodio de cristal grueso para halobacterias.
Para su conservación por este método se mezclan las células con sal y
se dejan desecar espontáneamente. Debido a la higroscopicidad de la sal,
la desecación no es total, pero las células dejan de multiplicarse por ser
insuficiente el nivel de agua disponible.
5.1.4 Consideraciones generales en la conservación de cepas
Cualquiera que haya sido el método empleado en la conservación de las
cepas microbianas, cuando éstas se recuperan para hacer nuevos lotes
para su conservación o para trabajar con ellas, se recomienda no utilizar
directamente las células que se han estado guardando, porque éstas
vienen de una situación de estrés más o menos fuerte (sobre todo cuando
se han conservado por liofilización) y por lo tanto no son adecuadas para
ningún tipo de prueba. Primero habría que revitalizarlas o rejuvenecerlas
sembrándolas en un medio no selectivo, es decir, un medio que asegure
lo más posible el crecimiento, y a partir de este primer crecimiento ya
se puede trabajar con ellas, cultivándolas en medios selectivos cuando
sea necesario. Igualmente hemos de tener presente que, dada la enorme
diversidad microbiana, cada microorganismo soportará determinados
métodos de conservación mejor que otros, o será necesario tomar
precauciones especiales en su conservación. Como ya dijimos al comienzo,
no existe un método general de conservación de los microorganismos,
aunque no resulta difícil determinar el más aconsejable en cada caso. La
mayoría de microorganismos de interés sanitario pueden conservarse a
largo plazo con los métodos generales de congelación y/o liofilización, y
para períodos cortos pueden mantenerse vivos por alguno de los métodos
alternativos si se hace en las condiciones adecuadas y bien controlados
por un microbiólogo.
Por último, es frecuente encontrar que una técnica de preservación
resulte más efectiva para un grupo microbiano que para otro, lo que
indica que además de considerar los aspectos anteriores es necesario
revisar la literatura disponible sobre los microorganismos en cuestión y las
alternativas de mantenimiento utilizadas, y adecuarlas a la situación real
de la organización. Podemos entonces resaltar que no existe una técnica
universal para conservar adecuadamente todos los microorganismos.
243
Capítulo 3
Práctica 3
Comparación de dos métodos de conservación de cepas
Para llevar a cabo esta práctica se utilizarán cepas de las familias de Enterobacteriaceae y
Pseudomonadaceae para ser conservadas por los métodos de semistock en papel filtro y el método
stock de criopreservación. La eficacia de los métodos de preservación se realiza mediante la
evaluación de la viabilidad a las 24 horas de conservación y se calcula el porcentaje de recuperación.
En conclusión, la preservación en papel filtro y criopreservación son métodos adecuados; ya que el
73.7% de los microorganismos de la familia Enterobacteriaceae y el 82.3% de los microorganismos
de la familia Pseudomonadaceae, presentaron un porcentaje de recuperación mayor al 50%.
Materiales y métodos
Primera etapa
asépticamente durante treinta minutos; posteSelección de los Microorganismos:
riormente se dispensan 0.5ml de la suspensión en
Las cepas microbianas se seleccionan de ban5 ml de caldo BHI y se incubaron a 37°C por 24 h.
co de cepas C
y genes,
el mé-/ N 27,84
En el caso de las cepas conservadas a -70°C, los
27,06conservadas
/ M 100 /por
Y 100
todo de criopreservación a -70°C, y a 4°C en viales se descongelan lentamente y se mantienen
condiciones de liofilización y papel filtro.
en baño de hielo, para tomar 0.1ml del cultivo e
19,61
/ M 10,98 / Y 19,61 inocularlo
/ N 0 en 5 ml de Caldo BHI, y luego se incuba
IdentificaciónCde
los microorganismos:
En esta primera etapa se efectúa una idena 37°C por 24 h.
tificación de los microorganismos del banco,
C 44,71 / M 41,96 / Y 100 / N 16,86
los cuales se estratifican según el método y
la temperatura de conservación. Debido a la
C 69,02
/M
/ Y 34,51
gran cantidad
de cepas
de 53,73
Escherichia
coli, / N 10,2
este género se debe separar de la familia Enterobacteriaceae para facilitar el análisis de
C 100 / M 90,98 / Y 32,55 / N 22,35
los resultados.
Segunda etapa
Muestra un camino con
Recuperación de los microorganismos:
Se lleva a cabo una recuperación de los microorganismos, teniendo en cuenta el esquema
propuesto por Espitia y Díaz. Para la recuperación de los microorganismos conservados a
4°C, los viales fueron rehidratados con 1.5 ml
de un caldo BHI (Brain Heat Infusión Oxoid Ò)
sus
244
ramificaciones
para
llegar a un destino Esquema de Espitia y Díaz (vías
pecuarias).
Capítulo 3
Tercera etapa
Con el fin de observar las características
macro y microscópicas, los cultivos se
siembran en Agar BHI, e incubados a
37°C por 24h. Para descartar posibles
contaminaciones se realizan repiques
sucesivos de la colonia característica.
Al cultivo puro se le debe realizar,
para la caracterización morfológica y
bioquímica, la prueba de la coloración
de Gram, pruebas bioquímicas y siembra
en Agar Mac Conkey (MERCK ®) en
el caso de las enterobacterias; y en
agar Cetrimide (Pseudomonas Cetrimide
Agar USP, OXOID ®), en el caso de
Pseudomonas.
Finalmente, se realizan repiques del
cultivo puro en Agar LB (Lurian Bertain:
triptona 10g/l, extracto de levadura
5g/l, NaCl 10g/l), para su posterior
conservación.
Cuarta etapa
Determinación
de
los
microorganismos por conservar:
Luego
de
aislados
los
microorganismos,
los
que
se
encuentran a 4°C y a -70°C, se
les determina la cantidad de
microorganismos
por
conservar.
En seguida, se clasifican las cepas
según los métodos de conservación
más adecuados y se establece la
conservación por el método Stock
de Criopreservación a -70°C y por
el método Semistock en papel filtro.
Quinta etapa
Conservación de los microorganismos:
La conservación por el método Semistock en papel filtro
se realiza, basada en el protocolo propuesto por Kirsop.
Este método mantiene la viabilidad de los microorganismos
trabajados (Enterobacterias y Pseudomonas) en un intervalo.
Para esta prueba se toman 4 viales de 2 ml por cada cepa
por conservar que corresponden a la viabilidad de 24 horas,
2 meses, 6 meses y un año; y se le adicionan a cada uno
15 discos de papel filtro Whatman N°4 de 5 mm, los cuales
se deben esterilizar a 121°C por 15 minutos.
Se lleva a cabo un cultivo en caldo BHI incubado a 37°C en
agitación a 200 rpm y con una densidad óptica de 0.4-0.5
leído en un espectrofotómetro (Spectronic 2000) a 600nm.
Se toman 0.1ml de cada uno de los cultivos y se agregan
a los viales, previamente preparados realizando una buena
homogenización y se almacenan a 4°C. La criopreservación
a .70°C se selecciona como método stock, debido a que a
diferencia de la liofilización, éste es un proceso rápido, con
baja contaminación, poco laborioso, económico y mantiene las
propiedades genéticas de los microorganismos que contienen
plásmidos. El proceso se realiza según lo propuesto por Frank
P. Se preparan cinco viales por cada cepa que corresponden
a la viabilidad de 24 horas, 6 meses, 1 año, 2 años y 5 años,
en los cuales se dispensa 0.8 ml de medio de preservación
recomendado por MacFaddin y Gherna
(Caldo Tripticasa
de Soya 3g, Glucosa 0.5g, Leche descremada en polvo 2g,
Agente crioprotector (Glicerol 10 ml), Agua destilada 990
ml; esterilizado a 10 libras de presión por 10 min); con
modificación en el agente crioprotector para E.coli, usando
Dimetilsulfóxido (DMSO), según lo recomendado por Sharp.
245
Capítulo 3
Posteriormente, de cada una de las cepas se realiza un
cultivo en caldo BHI incubado a 37°C con agitación de
200 rpm, hasta alcanzar una densidad óptica de 0.8 a 600
nm, leído en un espectrofotómetro (Spectronic 200); de este
cultivo se toman 0.8 ml que se suspenden en 0.8 ml del
medio de preservación previamente preparado en los viales,
realizándose luego una homogenización por vortex durante
10 seg. Finalmente, los viales se refrigeran a 4°C por 15
minutos para un periodo de equilibración e inmediatamente
congelados a -70°C.
Sexta etapa
Eficacia del método de conservación:
Con el objetivo de evaluar la eficacia
del método de conservación se debe
realizar un recuento inicial de cultivo
y un recuento a las 24 horas de conservación, con los cuales se calcula el
porcentaje.
En la siguiente figura se indica el porcentaje de recuperación y pérdida de los
microorganismos que están conservados a 4°C en papel filtro y liofilización.
Para la realización de esta práctica se requiere un acondicionamiento especial de los laboratorios
del plantel, disponer del Nitrógeno líquido y de equipo relativamente especializado. Si el plantel
no cuenta con estas condiciones, se puede acudir a alguna empresa de producción de cepas los
cuales en general son anuentes a ser visitados y a permitir que se realicen prácticas de conservación de cepas.
Microorganismos que se encontraban conservados 4°C y a –70°C.
246
Capítulo 3
Actividad es 9 y 10
Indica los métodos más importantes para la conservación de cepas microbianas.
Práctica
Indica los tres objetivos principales para una correcta conservación de cepas
de interés industrial.
C 27,06 / M 100 / Y 100 / N 27,84
C 19,61 / M 10,98 / Y 19,61 / N 0
C 44,71 / M 41,96 / Y 100 / N 16,86
C 69,02 / M 53,73 / Y 34,51 / N 10,2
247
Capítulo 3
248
Capítulo 3
Unidad 6 Cinética de fermentación
6.1 RAP Identifica en procesos fermentativos los inóculos,
levaduras y enzima que aceleran estos procesos
La cinética de los procesos fermentativos es gobernada por diversos factores,
tales como la naturaleza de los inóculos, levaduras y la presencia de enzimas
que aceleran las fermentaciones.
Los inóculos se utilizan actualmente en el procesado de alimentos para
inducir diversos cambios en sus propiedades, tales como la modificación de
la textura, la conservación, el desarrollo de aromas o la mejora nutricional.
La utilización de estos cultivos debe tener en cuenta estos efectos, cumpliendo
a su vez con la exigencia de la automatización del proceso, calidad del
producto y reproducibilidad. Lo que lleva consigo la producción de cultivos
con una actividad definida en términos de viabilidad, eficacia y vida útil.
Las principales aplicaciones de los inóculos se encuentran en las industrias
de panadería y lechería, aunque también existen levaduras destinadas a la
fermentación de bebidas alcohólicas y a la producción de alcohol industrial.
El proceso de producción de estas últimas es similar al efectuado en la
manufactura de levaduras de panadería, que además se utilizan con frecuencia
en las fermentaciones alcohólicas.
Las levaduras Saccharomyce crevisiae, utilizadas en la elaboración del pan
degradan los azúcares a una mezcla de alcohol y de dióxido de carbono
gaseoso que queda retenido en la masa. Con la excreción de compuestos
como cisteína y glutatión que rompen los puentes disulfuro intramoleculares
y con la producción de gas, las levaduras actúan modificando química y
mecánicamente el gluten, que es la proteína mayoritaria del trigo.
249
Capítulo 3
6.1.1 Fermentaciones con levaduras
Aproximadamente el 96% de la fermentación del etanol se
lleva a cabo mediante cepas de Saccharomyce crevisiae o
especies relacionadas; entre éstas S. Uvarum el etanol se
produce en la ruta Embden Meyerhof Parnas en la que el piruvato producido durante la glicosilizacion se convierte en
Acetaldehído y etanol la reacción global es la siguiente:
Glucosa + 2 ADP 2 Etanol + 2 CO2 + 2ATP
El rendimiento teórico de un gramo de glucosa es de 0.51
gr. de etanol y 0.49 gr. de CO2; sin embargo, en la práctica
aproximadamente el 10% de la glucosa se transforma en
biomasa y el rendimiento de etanol y CO2 alcanzan el 90%
del valor teórico.
La levadura incluye en su envoltura de la célula una
membrana plástica, un espacio periplásmico y una pared
celular constituida principalmente por polisacáridos y una
pequeña cantidad de péptidos.
La pared tiene una estructura semirígida permeable al
soluto que proporciona a las levaduras una considerable fuerza de compresión y de tensión. Los grupos
carbóxilos de los péptidos de la pared celular confieren a las levaduras utilizadas en la elaboración de
cerveza una capacidad de floculación importante, lo
que permite la separación sólido-líquido; después de la
fermentación se cree que la floculación se debe a la
formación de puentes salinos entre los iones calcio y
estos grupos carbóxilos de la pared celular.
La importación de la densidad celular es que nos ayuda a
lograr óptimos resultados en la fermentación, ya que nos
ayuda a predecir la cinética de crecimiento y por medio de
esto puedes determinar en cuanto tiempo podrás obtener
los metabolitos deseados.
250
Capítulo 3
6.1.2 Factores que afectan la velocidad de fermentación
Es bien conocido que existe un cierto número de factores que determinan si
una reacción se producirá o no, si será lenta o rápida, o si absorberá o liberará calor. Hay sin embargo otros factores que determinan la velocidad de la
reacción; estos son:
Temperatura:
Cuando temperatura aumenta, lógicamente, la energía cinética de las moléculas reaccionantes, con lo que habrá un mayor número de moléculas
con una energía igual o superior a la de activación. Esto se describe normalmente mediante una regla según la cual cada aumento en 10° C de
temperatura hace que se duplique la velocidad de la reacción. Sin embargo,
esto no quiere decir que la energía cinética de las moléculas se haya hecho el doble. Por supuesto, cuando se disminuye la temperatura ocurre lo
inverso.
Concentración y presión:
El aumento de la concentración de uno de los reactantes quiere decir que
habrá más moléculas presentes y que en esta forma aumentará el número
de colisiones. Por tanto, también se elevará el número de interacciones
favorables por unidad de tiempo.
Otra manera de enfocar el problema es considerando que aunque permanece
igual la proporción de moléculas que tienen la energía de activación requerida,
por existir más moléculas presentes al aumentar la concentración, hay un mayor número de ellas capaces de reaccionar.
Catálisis
En ciertos casos, como en el de las proteínas, pueden incrementar la velocidad
de las reacciones. Estos se le conocen con el nombre de catalizadores, y en el
caso de las proteínas se llaman enzimas. (Los compuestos que hacen disminuir
las velocidades de reacción se llaman inhibidores). Los catalizadores son capaces de alguna manera de reducir la energía de activación a un nivel inferior al
de la reacción no catalizada. Al ser incrementado el número de colisiones favorables entre las moléculas reaccionantes, es decir, favorecen la geometría
251
Capítulo 3
de colisión, en tal forma que sea mayor el número de choques efectivos. Ello se
convierte en una mayor facilidad de reacción con una menor energía de activación. Ambas reacciones, catalizadas o no, proceden al mismo tiempo.
Se creyó que el catalizador no intervenía en la reacción, pero ahora se sabe que
juega un papel importante y que en algunos casos resulta químicamente alterado
en la reacción, aunque no obstante se regenera antes de que la reacción se haya
completado. En la mayoría de los casos no se conoce el mecanismo de acción.
Por lo que hay reacciones como la de descomposición del ácido fórmico en agua
y monóxido de carbono, que están catalizadas por un ácido y que han sido estudiadas con cierto detalle.
Muy lentamente el ácido fórmico se descompondrá por sí mismo, pero si se añade ácido sulfúrico la solución burbujea violentamente gracias al gas desalojado.
La reacción transcurre en tres etapas. Primeramente se dona un protón desde el
ácido a la molécula del ácido fórmico dejando, en el caso del sulfúrico, un ión
sulfato de hidrógeno:
El ácido fórmico protonado es inestable y se rompe para formar agua y una molécula de HCO.
La molécula intermedia HCO es inestable y pierde un protón para formar monóxido de carbono. El protón es a continuación devuelto a la molécula de sulfato de
hidrógeno para originar el catalizador ácido sulfúrico original.
H+ + HS04 - H2SO4
Se puede observar que el catalizador sufrió un cambio químico al comienzo de la
reacción. Donó un protón al ácido fórmico, aunque éste fue devuelto de nuevo al
ión sulfato hidrógeno al final de la reacción.
En cada una de las etapas de la reacción tendrán su propia energía de activación,
pero ninguna será superior a la energía de activación de la reacción no catalizada.
Con las enzimas quimotripsina, lisozima (enzima presente en las lágrimas, clara de
huevo, y producida por algunos virus) y papaína, se sabe algo de su mecanismo
de acción, gracias a investigaciones recientes llevadas a cabo por bioquímicos y
cristalógrafos. Basándose en la actividad de las enzimas se pueden emplear test
sensibles para estudiar tejidos dañados, por ejemplo, para determinar la presencia
de sangre en laboratorios médicos forenses.
252
Capítulo 3
Catalizadores
El mecanismo que hace cambiar de una reacción química es el catalizador. En
presencia de éste la reacción avanza a través de etapas sucesivas más rápidas
y la constante de velocidad adquiere un valor más alto. En la ecuación de
Arrhenius se llega a la conclusión que la presencia de un catalizador tiene que
traer como resultado una reducción en la energía de activación porque de otra
manera no podría explicarse cómo puede aumentar el valor de la constante
de velocidad en comparación con la de la reacción no catalizada ya que en
la ecuación de Arrhenius a temperatura constante A, R y T son constantes,
de modo que la única forma de hacer que K aumente es que disminuya Ea.
Desde el punto de vista de la ecuación de Arrhenius, el efecto que produce un
catalizador consiste en reducir la energía de activación a la vez que aumenta,
tanto la fracción activada de moléculas como la velocidad de la reacción.
K = A exp (Ea/RT)
Sin embargo, los catalizadores afectan a la velocidad de una reacción, no
tienen influencia alguna sobre la posición de equilibrio de la reacción. Esto es
explicable si tenemos en cuenta que los catalizadores ejercen su acción sobre
ambas reacciones, la directa y la inversa. Así, la velocidad de la reacción en
su conjunto estará aumentada sin que se afecte la posición del equilibrio.
En el principio general un aumento de la temperatura modificará la posición
de equilibrio, de tal manera que el efecto que produzca ese aumento será
contrarrestado por el sistema.
Catálisis enzimática
La cinética química ha sido aplicada con gran éxito en el desarrollo de rápidos y
económicos métodos de producción de muchos materiales. Pero en años recientes
los investigadores en cinética química se han ocupado con creciente interés en el
estudio de las reacciones catalizadas por enzimas que ocurren en las células vivas;
éste es uno de los campos más fascinantes de la investigación química moderna. Las enzimas son polipéptidos gigantes cuyo peso molecular llega a 20.000 o
más. Cada fragmento peptídico lleva consigo un sustituyente orgánico o grupo R.
Cuando la enzima se pliega para formar su estructura terciaria, los grupos polares
R quedan sobresaliendo como puntas dentro del medio acuoso de la célula. Se
cree que el efecto catalítico de las enzimas se debe a la manera como se hallan
dispuestos tales grupos R sobre
253
Capítulo 3
zona de la superficie de la enzima plegada. El sustrato, o
sea la molécula pequeña sobre la cual actúa la enzima, se
adhiere a la superficie de la enzima por medio de enlaces
de hidrógeno que lo ligan a los grupos R.
La diferencia entre catalizadores y enzimas es la siguiente:
Catalizador: es un metal o elemento que actúa como
acelerador de una reacción química sin modificarse en el
transcurso de la misma. Son cuerpos que por su presencia
hacen variar la velocidad de una reacción. Mientras que las
Enzimas son proteínas que actúan como catalizadores.
Enzimas
Entre los diversos tipos de proteínas, las enzimas son las
que cumplen una función más específica: modifican la velocidad de las reacciones que se producen en un ser vivo,
en la gran mayoría de los casos, acelerándolas. De esta
manera estamos definiendo las enzimas como proteínas
que actúan como catalizadores.
Las enzimas facilitan el curso de las reacciones disminuyendo la energía de activación de modo tal que se pueden
producir simultáneamente y en un tiempo brevísimo la gran
cantidad de reacciones que posibilitan la vida.
Al cumplir su función, las enzimas no son alteradas por
las reacciones que promueven. La especificidad de una
enzima le permite distinguir con gran selectividad entre
diferentes sustancias y aún entre isómeros ópticos.
Algunas enzimas son proteínas simples constituidas
sólo por aminoácidos. Las hidrolasas, en general son
proteínas simples. Muchas están formadas por asociación de varias unidades o cadenas polipeptídicas.
Hay enzimas que sólo pueden realizar su función catalítica
en asociación con otra molécula no proteica, de tamaño
254
Capítulo 3
relativamente pequeño, a la cual se le denomina coenzima. La coenzima puede
estar firmemente unida a la enzima por uniones covalentes u otro tipo de enlace
fuerte, formando un complejo que no se separa fácilmente.
Entonces el catalizador es un cuerpo que puede producir aceleración o retardo
de una reacción química por presencia de una sustancia que permanece aparentemente intacta sin destruirse ni inactivarse en el proceso.
Algunas reacciones se aceleran bajo la influencia ejercida por algunas sustancias que al término del proceso resultan inalteradas. Estas sustancias se
denominan catalizadores y el efecto que producen es la catálisis.
Cuando actúan como catalizador negativo disminuyendo la velocidad del proceso, reciben el nombre de inhibidores.
1 No se altera la composición de los catalizadores en las reacciones químicas en que intervienen.
2. Pequeñas cantidades de catalizadores bastan para acelerar el proceso
de grandes cantidades de sustancias reaccionantes.
3. Los catalizadores sólo pueden modificar, disminuir o aumentar la velocidad de reacción, pero son incapaces de provocar una reacción.
4. Los catalizadores son específicos de la reacción de que se trate.
255
Capítulo 3
Actividad 11
Describe la metodología que permite contar bacterias en
cámara de Neubauer.
Práctica
Cámara de Neubauer
C 27,06 / M 100 / Y 100 / N 27,84
C 19,61 / M 10,98 / Y 19,61 / N 0
C 44,71 / M 41,96 / Y 100 / N 16,86
256
C 69,02 / M 53,73 / Y 34,51 / N 10,2
•Cámaras de recuento
DIN 12847
•Cajita individual con 2
cubre. Objetos de 0,4
mm.
Capítulo 3
Práctica 4
Estudio de la cinética de la fermentación in vitro y del residuo
no fermentado de un forraje consumido por vacas lecheras.
En la presente Práctica se utiliza la técnica in vitro de producción periódica de biogás, con el objeto
de estudiar la producción de este biogás y la fermentación de la materia seca, en muestras provenientes de un forraje disponible a ras de suelo consumido por vacas lecheras.
C 27,06 / M 100 / Y 100 / N 27,84
La práctica se lleva a cabo en un biodigestor piloto, como lo muestra la
siguiente figura, en la cual se lleva a
cabo la fermentación anaeróbica del
sustrato, produciendo biogás que se
recolecta en recipientes herméticos de
plástico.
C 19,61 / M 10,98 / Y 19,61 / N 0
Biodigestor piloto para la
C 44,71 / M 41,96 / Y 100 / N 16,86 producción de biogas
C 69,02 / M 53,73 / Y 34,51 / N 10,2
C 100
/M
90,98
/ Y 32,55
/ N de
22,35
El experimento
se lleva
a cabo
tomando
muestras
forraje compuesta principalmente de gramíneas perennes (Lolium perenne), bajo un sistema de pastoreo continuo controlado, consumido por
vacas lecheras. La muestra se obtiene cortando y colectando el forraje inmediatamente adyacente
a aquel forraje consumido por el animal en pastoreo. Este proceso de selección del forraje se realiza
siguiendo a las vacas en los lugares de pastoreo. Las muestras compuestas deben secarse a 60° C
en una estufa con circulación de aire por 48 horas, y luego se muelen en un molino de cuchillos con
una criba de 1 mm. Las determinaciones se realizan en la materia seca (MS), proteína cruda (PC) y
cenizas totales (CT) (A.O.A.C. 1980), fibra detergente neutro (FDN) y fibra detergente ácido (FDA), y
celulasa neutro detergente (CND), para determinar la energía metabolizable (EM).
257
Capítulo 3
Dos ovinos canulados ruminalmente pueden ser usados para suplir de líquido ruminal. Los animales
deben recibir una ración de heno de pradera permanente y un concentrado comercial (220 g PC/kg
MS y 13,2 MJ / kg MS) en una proporción aproximada de 3:1. Las raciones se calculan para lograr
un consumo diario de 1.0 a 1.5 veces el nivel de mantenimiento. A los alimentos se les deben dar
dos raciones iguales durante el día y disponer de libre acceso al agua.
La técnica de producción de biogás se realiza usando 1 g de sustrato (± 0.002 g) (base seca) por
tratamiento y en triplicado. Cada muestra se fermenta en forma independiente.
Preparación de las botellas: El medio se hierve y luego
se enfría permitiendo la gasificación con CO2. Se coloca
en botellas con capacidad de 125 ml, bajo continua gasificación con CO2. Una vez llenas, éstas deben sellarse con
tapas de goma y luego almacenarlas a 4° C por 60 horas.
Posteriormente, los sustratos a incubar se deben transferir
a las botellas que contengan el medio. Se les permite la
gasificación con CO2 y deben sellarse nuevamente con
tapón de goma, y ponerlas a incubar a 4° C por 10 horas,
para posteriormente pasar a temperatura de incubación
de 39° C.
La inoculación. El fluido ruminal se obtiene de dos ovejas
usando una bomba aspiradora y guardado en termos a
temperatura de 39° C. El líquido ruminal se filtra a través
de 4 capas de muselina y se almacena bajo una atmósfera
de CO2.
258
Capítulo 3
Inoculación de las botellas. Mientras el inóculo está
siendo preparado, las botellas cerradas se ajustan a la
presión atmosférica. Posteriormente, se inyectan 10 ml de
inóculo a cada botella mediante una jeringa. Luego las
botellas deben agitarse y devueltas a la estufa de incubación a 39° C, momento en que se considera el comienzo
del experimento (tiempo cero = 0). Las lecturas se llevan a
cabo a los siguientes tiempos, después del tiempo cero: 3,
6, 9, 12, 15, 21, 27, 33, 39, 48, 60, 72 y 96 h.
259
Capítulo 3
260
Capítulo 3
Unidad 7 Fermentadores industriales y procesos microbiológicos
7.1 RAP Conoce los fermentadores industriales, su función,
métodos y procesos implicados en los procesos microbiológicos
Fermentador industrial en acero inoxidable multifuncional para la
industria cervecera
7.1.1 Fermentadores y tipos de fermentaciones
Huelga decir que la fermentación es un proceso mediante el cual ocurren reacciones químicas debido a la presencia de microorganismos o enzimas de éstas. En
los procesos industriales, las fermentaciones se llevan a cabo en un reactor que
se conoce como fermentador. De la forma más general, se puede decir que un
fermentador, es aquél lugar donde ocurre la fermentación. Esta definición provee
para considerar un fermentador tanto aquel que está equipado con modernos
sistemas computadorizados de control de parámetros (tales como el pH y la temperatura), como un envase simple de yougurt donde se fermente este producto.
Los fermentadores pueden utilizarse en uno de tres modos comunes de operación.
El más común es el fermentador por lotes (batch), en el cual una
261
Capítulo 3
cantidad fija de materia prima se prepara y se introduce en el fermentador.
El fermentador se inocula
con el microorganismo seleccionado y el proceso de
fermentación ocurre durante un período de tiempo
específico.
Luego de terminada la fermentación, el
producto fermentado se extrae del mismo finalizando
el proceso.
Las fermentaciones por lotes se pueden
realizar generalmente en una de dos formas: con agitación y sin agitación.
por lotes
alimentación
alimentación y
por lotes
producción continua
Figura 5. Modos de fermentación.
262
El segundo modo de operación es conocido en inglés como
“fed-batch”. En estas fermentaciones se introduce parte
de la materia prima por procesarse al principio del proceso.
Se inocula la misma con el microorganismo seleccionado
comenzando el proceso de la fermentación. Posteriormente y utilizando un criterio preestablecido para la razón
de alimentación, el resto de la materia prima se añade
durante el tiempo de la fermentación. Dentro de esta
modalidad de fermentación existen dos tipos principales:
la incremental y la de volumen fijo. En la incremental, la
concentración de sustrato de la alimentación es igual o
mayor a la concentración que había en el fermentador al
comienzo del proceso. El volumen del medio dentro del
fermentador aumenta significativamente durante el proceso de alimentación y de ahí el nombre de fermentación
“incremental”. En las fermentaciones “fed-batch” de volumen fijo, la concentración de sustrato en la alimentación
es tan alta que no hay que añadir grandes cantidades de
ésta, lo que resulta que no ocurran cambios significativos
Capítulo 3
de volumen. En la fermentación “fed-batch” de volumen fijo, moléculas de
sustrato van ocupando los espacios vacios disponibles entre las moléculas de
soluto en la mezcla que se fermenta.
El tercer modo de fermentaciones es el modo continuo. En este modo
de operación, se opera el fermentador con una razón de alimentación de
sustrato de igual magnitud a la razón de extracción de producto, por lo
cual el volumen de operación del reactor se mantiene constante.
Esto
permite operar el fermentador por prolongados períodos de tiempo sin
la necesidad de preparar inóculos continuamente y eliminando repetidos
períodos de propagación de masa celular que consumen gran cantidad
de tiempo.
Existen fermentadores especialmente diseñados para operar de forma
continua, como lo son el fermentador de torre (tower fermentor) y el de
células inmovilidas. El fermentador de torre (ilustrado en la Figura No )
es un tubo que se extiende longitudinalmente hacia arriba y posee diámetros diferentes en algunas partes del cilindro.
El microorganismo por
utilizarse en este tipo de fermentadores debe ser capaz de sedimentar rápidamente. La alimentación en este tipo de fermentadores se realiza por
la parte inferior y el producto se extrae del tope del mismo. La diferencia en diámetros y una razón de alimentación adecuada permiten que el
microorganismo sedimente manteniéndose en la parte inferior del mismo.
Figura 6: Algunos tipos de fermentadores continuos.
El fermentador de células inmovilizadas es uno usualmente en forma tubular (ver la Figura No superior
derecha) con una matriz porosa en su interior, la cual
es tratada químicamente para que las células del microorganismo seleccionado se adhieran a las paredes
de los poros. Luego de permitir el crecimiento de las
células de microorganismo dentro de la matriz, la alimentación se introduce al reactor y la misma mantiene
contacto con las células de microorganismo mientras
ésta pasa a través de los poros.
La velocidad de la
alimentación debe ser adecuada para que el sustrato
mantenga suficientemente tiempo de contacto con las
células adheridas y reaccione totalmente.
263
Capítulo 3
Sistemas de control de temperatura, pH y otros parámetros
Los fermentadores pueden estar equipados con diversos mecanismos de
control que permiten mantener las condiciones adecuadas para que las
enzimas de los microorganismos operen en condiciones óptimas.
Los
parámetros comunes que usualmente se controlan en los fermentadores
son la temperatura, el pH y la razón de oxígeno disuelto. A continuación
se ilustra un sistema de control de temperatura típico de un fermentador.
Figura 7. Fermentador con control de temperatura
264
Capítulo 3
El fermentador está rodeado de una chaqueta que junto a un sistema de
mezclado permite una distribución de temperaturas similar en todas las
partes del líquido fermentándose. En este sistema, un sensor se utiliza
para medir la temperatura dentro del fermentador. La señal eléctrica es
recibida por una unidad de control que determina si la temperatura está
dentro de un rango adecuado o si la misma está más alta o más baja de
lo previsto. Dentro de unos parámetros establecidos para la desviación,
el controlador activará la válvula de vapor en caso de requerirse aumentar
la temperatura; si se requiere una disminución de temperatura, se activará
la válvula que permite el paso de agua fría; por último, en el caso en que
la temperatura se encuentre dentro del rango aceptable, tanto la válvula
de vapor como la de agua fría permanecerán cerradas.
De igual forma se ilustra a continuación un sistema de control de pH.
Observa que un sensor se utiliza para establecer la medida de pH.
La
señal eléctrica del sensor es recibida por el controlador que determina la
acción por seguir, según el valor de pH y el rango de operación de esta
variable de control. Si el pH es más bajo que el permitido en la lógica de
control, el controlador activará la bomba de base introduciendo un medio
alcalino que permita subir el pH. En el caso de que el pH sea más alto
de lo establecido en el criterio de control, se activará la bomba de ácido
y el pH bajará. En el caso de que el pH esté dentro del rango permitido,
ambas bombas permanecerán desactivadas.
Figura 8.
Fermentador con control de
pH.
265
Capítulo 3
Similar a lo establecido anteriormente funcionan otros sistemas de control.
Por ejemplo, en ocasiones es necesario que el fermentador tenga algún tipo
de sistema que controle la formación de espuma (antifoam control system).
Estos sistemas pueden ser mecánicos o pueden añadir algún compuesto químico (antiespumante) que disminuya la tensión superficial del medio en que
se fermenta, evitando la acumulación de espuma.
En el caso en que una fermentación sea aeróbica, se requiere un sistema de
control para el oxígeno disuelto. Los sistemas de control de oxígeno disuelto
tienen un sensor y un controlador al igual que otros sistemas de control. En
estos casos se establece una cantidad mínima de oxígeno disuelto, en la cual
se activarán elementos de control para aumentar la cantidad de oxígeno presente en el medio. Estos elementos pueden ser compresores o válvulas de
aire. También los sistemas de control de oxígeno disuelto pueden aumentar
la velocidad de agitación, causando turbulencia, lo que ayuda a exponer más
área de superficie del líquido al aire y así aumentar la transferencia de oxígeno
al medio.
Figura 9: Fermentador con control de oxígeno disuelto.
266
Capítulo 3
7.1.2 Etapas para llevar a cabo el diseño de un fermentador
1. Control de la entrada y salida
de microorganismos, nutrientes y
productos de la fermentación.
2. Control de los intercambios de
gases y energía.
3. Proporcionar un ambiente óptimo para el crecimiento del microorganismo o para el desarrollo del
proceso fermentativo.
4. Optimización del rendimiento del producto respecto al costo
energético y de los sustratos de
fermentación.
5. Facilitar la recuperación de los
productos de la fermentación (ya
sea en forma de biomasa o en el
medio de cultivo).
6. Los fermentadores industriales están generalmente diseñados
para procesos concretos.
Consideraciones especiales en el diseño y selección de un fermentador
Las siguientes consideraciones son de suma importancia al seleccionar o
diseñar fermentadores para procesos controlados:
1. El envase o contenedor en donde se realizará la fermentación debe
ser capaz de ser operado asépticamente durante el tiempo en que
la operación se realice.
Esto es de vital importancia en procesos
continuos.
2. La aeración (o ausencia de ésta) y la agitación deben realizarse
de forma que se cumplan con los requerimientos metabólicos del
microorganismo utilizado. El mezclado debe hacerse en tal forma que
los nutrientes estén uniformemente distribuidos en el fermentador sin
que esto conlleve daño físico al microorganismo.
El aire debe estar
filtrado para evitar la entrada de microorganismos en el polvo.
3. El consumo de energía debe ser tan bajo como sea posible.
4. Un sistema de control de temperatura debe ser provisto prácticamente
en todas las operaciones controladas.
La temperatura es un factor
sumamente importante en todos los procesos de fermentación.
5. Un sistema de control de pH debe ser provisto en la gran mayoría de
las operaciones. En muchos casos, solo se requiere de un ajuste inicial
267
Capítulo 3
de pH. Sin embargo, en medios que no tengan efectos amortiguantes,
el control de pH es muy importante, en especial si pequeñas variaciones
de pH afectan adversamente al microorganismo.
6. El fermentador debe proveer algún tipo de sistema para un muestreo
eficiente y que no promueva la contaminación del proceso.
7. Las perdidas por evaporación deben ser mínimas.
8. El diseño del envase (o tanque) debe considerar un fácil manejo para
las operaciones de limpieza y mantenimiento. Las paredes del envase
(o tanque) deben ser pulidas, es decir, no deben tener porosidad que
dificulte la limpieza y sanitización.
9. Los materiales de construcción deben ser resistentes a los compuestos
que se generen durante el proceso y a la materia prima, sales, ácidos
o bases que se añadan.
7.1.3 Diseño
alimentarias
y
elección
del
sustrato
de
fermentaciones
1. Alimentos fermentados.
- Sustrato tradicional.
- Sustrato tradicional con correcciones (adición o purificación) para:
- Favorecer o garantizar el desarrollo de los microorganismos deseables.
- Mejorar o garantizar la calidad del producto, o crear nuevos productos
alimenticios.
268
Capítulo 3
2. Aditivos y enzimas.
- Proporcionar todos los elementos y la energía necesarios para el
crecimiento del microorganismo y la formación del producto.
- Evitar la presencia de sustancias inhibidoras del crecimiento o de la
síntesis del producto (incluidos algunos nutrientes).
- Extender en el tiempo la fase productiva de crecimiento (p.ej., cultivo
continuo).
- Favorecer la recuperación del producto al final del proceso.
- Evitar la formación de espuma.
- Reducir costos mediante el uso de subproductos (bagazo, suero de
quesería,...).
* El medio debe estar adaptado a cada fase del proceso (mantenimiento
de la cepa, preinóculo, escalado, producción,...).
Desarrollo del proceso de panificación mediante enzimas
269
Capítulo 3
Actividades 12 y 13
Haz una descripción de los criterios más importantes para el diseño de
un fermentador:
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Práctica
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C 27,06 / M 100 / Y 100 / N 27,84
C 19,61 / M 10,98 / Y 19,61 / N 0
C 44,71 / M 41,96 / Y 100 / N 16,86
270
C 69,02 / M 53,73 / Y 34,51 / N 10,2
Capítulo 3
¿De qué están provistos principalmente los fermentadores industriales?
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271
Capítulo 3
Actividad 14
¿En qué consisten los biorreactores de enzimas o células inmovilizadas?
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Práctica
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C 27,06 / M 100 / Y 100 / N 27,84
C 19,61 / M 10,98 / Y 19,61 / N 0
C 44,71 / M 41,96 / Y 100 / N 16,86
272
C 69,02 / M 53,73 / Y 34,51 / N 10,2
Capítulo 3
Práctica 5
Exaltación de las propiedades aromáticas del mosto mediante el
uso de especies de levadura no-saccharomyces y sacharomyces
La meta de esta Práctica es verificar la hipótesis siguiente: la inoculación de una cepa
de levadura “exótica” y una cepa de levadura
Saccharomyces deben engendrar directamente
una mayor complejidad e intensidad en el perfil
sensorial de los vinos. Para validar esta hipótesis, se escoge estudiar la levadura “exótica”
de la especie Torulaspora delbrueckii, conocida
por ser una levadura inicialmente presente en
ciertos mostos que no presentan ningún defecto
organoléptico conocido.
Levadura saccharomyces
Las diversas inoculaciones deben realizarse en un mosto
de la variedad
grado
CMacabeo
27,06 /con
M un
100
/ Yalcohólico
100 / Npotencial
27,84
de 12.5 % v/v. La temperatura de fermentación debe ser
de 20°C. Las co-inoculaciones se examinan combinando
C 19,61de/laMespecie
10,98Torulaspora
/ Y 19,61delbrueckii
/N0
una cepa de levadura
con una cepa de la especie Saccharomyces cerevisiae
C 44,71 / M 41,96 / Y 100 / N 16,86
A densidad de 1060 kg/m³ se le adiciona nutrientes
específicos de levadura para inhibir el efecto de compeC 69,02en/ M
53,73
Y 34,51 / NEn10,2
tencia interespecífica
el caso
de /coinoculación.
la
inoculación secuencial, la adición de nutrientes se debe
dividir en dos momentos diferentes: a densidad 1070 y a Levadura saccharomyces
C 100 / M 90,98 / Y 32,55 / N 22,35
densidad 1060.
Realiza dos ensayos basados en la coinoculación y la inoculación secuencial de las levaduras Saccharomyces y no Saccharomyces. En el caso de la coinoculación, ambas levaduras se inoculan
en el mismo momento, aunque en diferentes proporciones, 60 y 70 % de Torulospora delbrueckii;
compara los resultados con la misma fermentación realizada en pureza con solo Saccharomyces.
Mientras que en la inoculación secuencia, primero se adiciona al mosto la levadura no Saccharomyces y la Saccharomyces se inocula con una pérdida de 20 puntos de densidad, comparando
de nuevo los resultados con la fermentación en pureza de Saccharomyces.
273
Capítulo 3
Resultados de la co-inoculación de Saccharomyces/no-Saccharomyces:
Los análisis estándar del vino están resumidos en la Tabla 1, donde se puede
observar una caída significativa de la acidez volátil en los vinos sometidos a
co-inoculación.
Figura 10. Cinéticas de fermentación en
coinoculación.
Tabla 1. Análisis estándar de los vinos
Una vez acabada la fermentación, se deben analizar las concentraciones de los
principales ésteres que resulten de la fermentación de las levaduras: acetato de
isoamilo, hexanoato de etilo, octanato de etilo, decanato de etilo, butanato de
etilo y acetato de hexilo en los vinos obtenidos con los dos tipos de inoculación
y en el vino producido con sólo Saccharomyces cerevisiae (Figura No. 11). Para
determinar el número de unidades de olor de cada uno de los ésteres, se utiliza
el sistema del número de unidades de olor (NUO) .
NOU para cada éster = Concentración de cada éster / el valor de su umbral de percepción.
274
Capítulo 3
Figura 11. Perfiles del aroma químico de los
vinos, obtenidos mediante el análisis de
seis ésteres.
Una vez acabada la fermentación, se deben analizar las concentraciones de los
c Los otros ésteres no son modificados de forma perceptible comparados con
los de la fermentación sólo con Saccharomyces.
Para confirmar el perfil aromático obtenido con el análisis químico, los vinos
son sometidos a análisis organoléptico por un jurado de catadores entrenados en análisis sensorial. El jurado estuvo deliberadamente compuesto por 20
catadores no profesionales, que son por consiguiente más representativos de
consumidores normales de vino.
En todos los casos, el impacto de la nota amílica (acetato de isoamilo) resulta
ser extremadamente pronunciado, cubriendo la presencia de otros ésteres,
tanto en los vinos producidos con sólo Saccharomyces cerevisiae como en los
producidos con las cepas exóticas. Por lo tanto, el jurado no puede detectar
diferencias significativas entre los vinos que resultaron de las co-inoculaciones
y los vinos producidos con la fermentación de una sola cepa pura de levadura
Saccharomyces cerevisiae.
Los primeros resultados demuestran que la inoculación de diferentes especies
fue percibida como una manera de aumentar la intensidad de ciertas notas
aromáticas que ya eran predominantes, con riesgo de acentuar el desequilibrio
y por lo tanto, de debilitar la complejidad aromática de los vinos. El riesgo en
este caso, es el aumento potencial de acetato de isoamilo, que podría desequilibrar el aroma del vino si la concentración alcanzase niveles demasiado altos.
Así, la hipótesis que consiste en considerar que la co-inoculación con una cepa
“exótica” y una cepa de Saccharomyces engendra directamente complejidad e
intensidad en los perfiles sensoriales de los vinos, se podría confirmar en esta
práctica.
275
Capítulo 3
Actualmente se está evaluando esta experimentación con un enfoque diferente,
que aporta mayores limitaciones en términos de control, pero que sin embargo
tiene la posibilidad de dar lugar a vinos más armoniosos e intensos aromáticamente. Este enfoque consiste en reproducir la ecología del ambiente de la
fermentación alcohólica fomentando lo siguiente:
• El desarrollo de levaduras exóticas durante el primer tercio de la fermentación,
momento crucial para el equilibrio y la intensidad de los aromas en el vino.
• El desarrollo de levaduras Saccharomyces para garantizar una fermentación
más segura.
Tal inoculación secuencial evita crear competiciones entre las características
sensoriales y la cinética de fermentación de cada especie de levadura.
Resultados de la inoculación
secuencial de levaduras Saccharomyces/no-Saccharomyces
Bajo condiciones de fermentación
idénticas a las aplicadas en las experimentaciones de co-inoculación
y usando igualmente un mosto de
la variedad Macabeo, con un grado alcohólico potencial de 13.6%
vol., se debe reproducir la sucesión
de poblaciones de levadura exótica
y de Saccharomyces, como se observa en numerosos estudios sobre
ecología de las levaduras en sistemas fermentativos (Figura. 12). Los Figura 12. Cinética de fermentación en inoculación secuencial.
análisis estándar de los vinos producidos están resumidos en la Tabla 2, donde se han concentrados
datos típicos semejantes a los que
deben obtenerse en el desarrollo de
esta práctica.
276
Capítulo 3
Figura 13. Perfil aromático de los vinos del ensayo en comparación a datos medios
de vinos blancos comunes de la variedad Macabeo producidos en la zona.
277
Capítulo 3
Para visualizar mejor el efecto de la inoculación secuencial sobre los ésteres
(Figura No. 13), la concentración de cada uno de los ésteres presentes en el
vino producido con inoculaciones secuenciales se divide por la respectiva concentración del éster presente en el vino testigo (Figura No. 14).
El perfil aromático que resulta del desarrollo secuencial de Torulaspora delbrueckii y después de Saccharomyces muestra claramente una intensificación
uniforme de las concentraciones de los ésteres: cuatro de los seis ésteres
analizados presentan concentraciones superiores respecto a las obtenidas en
el vino producido con una fermentación de una cepa pura de Saccharomyces;
solamente en el caso del acetato de isoamilo, cuya elevada concentración
dominaba el perfil aromático del vino testigo (Figura No. 13), disminuyó su
concentración con la inoculación secuencial.
Figura 14. Efecto de la inoculación secuencial sobre la concentración de seis ésteres.
278
Capítulo 3
Los vinos que se elaboren deben someterse al jurado de catadores mediante
un análisis sensorial con una prueba de diferenciación y un análisis descriptivo. Se observan diferencias estadísticamente significativas, con un umbral
del 5%, entre los vinos producidos con inoculación secuencial (realizada con
la levadura Torulaspora delbrueckii y después con la levadura Saccharomyces
cerevisiae) y el vino testigo (producido con una cepa pura de Saccharomyces).
Al jurado se le debe pedir entonces realizar un análisis descriptivo. Los perfiles
sensoriales obtenidos muestran una intensificación de ciertos descriptores,
como “floral”, “fruta en almíbar” y “galleta de jengibre”, ayudados por un dulzor
más intenso en el paladar. Notas más comunes, como “manzana”, “plátano” o
incluso “picante” o “animal” (Figura No. 15) fueron menos presentes.
Figura 15. Comparación de perfiles sensoriales.
279
Capítulo 3
Conclusiones
En esta práctica deben analizarse los resultados que
se obtengan para
demuestrar que la sucesión de
predominancia de la población de levadura de la
especie Torulaspora delbrueckii y después de levadura
del género Saccharomyces permite un aumento
homogéneo del nivel de ésteres, compuestos esenciales
en los aromas fermentativos de los vinos.
Un estudio parecido al propuesto en esta práctica con
la cepa Torulaspora delbrueckii se realizó con una
cepa de levadura de la especie Cándida stellata. Se
obtuvieron resultados idénticos, reforzando la decisión
de desarrollar un instrumento innovador que reproduzca
la ecología del ambiente fermentativo espontáneo.
Además, para armonizar e intensificar la complejidad
aromática de los vinos, sería preferible la opción de una
inoculación secuencial con la levadura “exótica” y después
la levadura Saccharomyces, más que una inoculación
interespecífica combinada.
Esta práctica puede ser desarrollada en alguna instalación
piloto de la industria vinícola o cervecera para los casos en
que la institución no disponga del equipamiento necesario.
280
Capítulo 3
Termina la Unidad
281
Capítulo 3
282
Capítulo 3
Unidad 8 Procesos biológicos y su control de calidad
8.1 RAP Conoce los fermentadores industriales, su
función, métodos y procesos implicados en los procesos
microbiológicos
Las materias primas tradicionales están siendo complementadas con otras
muy abundantes basadas en recursos renovables y que hasta el presente
han sido poco o nada aprovechadas como sustratos en procesos de
fermentación, como es el caso de los residuos celulósicos, que pueden
ser materias primas de muy bajo costo para la producción de alcohol,
enzimas y otros productos. También se están ampliando los usos de
hidrocarburos como sustrato de procesos en la producción de ácido
cítrico y otros compuestos. La utilización de efluentes industriales de
varias agroindustrias como materias primas de costo cero o negativo
será sin duda ampliada en el futuro, pues ello representa además una
contribución a la eliminación parcial o total de residuos contaminantes.
Algunos pigmentos como los carotenos y las ficobilinas producidas por
algunas algas del género Dunaliella, Spirulina y Nostoc tienen también
un futuro promisorio. Se han mencionado también algunos herbicidas de
origen microbiano, que tienen igualmente perspectivas de ser desarrollados.
En varios casos la elección de la vía microbiana es obligada por razones
económicas, ya que aunque sea posible producir algunas moléculas por vía
química, desde el punto de vista económico esto no resulta rentable, como
sucede en el caso de los antibióticos, algunas vitaminas y aminoácidos.
Sin embargo, los procesos microbiológicos se presentan también como
alternativas válidas para el caso de moléculas sencillas como el etanol, el
butanol o el ácido láctico, con los cuales existe lógicamente la competencia
con los procesos que derivan de la petroquímica.
Estos casos están directamente relacionados con el costo del petróleo y
sus derivados.
283
Capítulo 3
El ejemplo del butanol es muy claro es ese sentido, ya que en los últimos
años se ha producido un renovado interés en su producción por fermentación
a partir de materias primas de bajo costo o de residuos, ya que en esta forma
se pueden desarrollar procesos que son competitivos con los derivados de la
petroquímica, cuando el valor del petróleo supera un determinado valor crítico.
En algunas transformaciones microbiológicas la alta especificidad permite la
posibilidad de efectuar reacciones que son imposibles de realizar por vía química, como ocurre en los diversos procesos de producción de compuestos
esteroidales. Este campo de aplicación se ha visto enriquecido últimamente, y
lo será sin duda mucho más en el futuro, por las grandes posibilidades que
ofrece ya la biocatálisis, que está siendo aplicada, no sólo en la fase acuosa,
sino también en presencia de solventes orgánicos para lo obtención de un gran
número de compuestos. Entre los sistemas de producción no tradicionales se
incluyen fundamentalmente los procesos en estado sólido y los que emplean
microorganismos inmovilizados.
En el primer caso es necesario el desarrollo de nuevos reactores y lograr la optimización de los mismos. Estos sistemas permiten prever la
producción comercial de nuevos productos como algunas enzimas. El uso
de reactores con microorganismos inmovilizados es otro campo de futuro
desarrollo de la Microbiología Industrial, que ya está siendo aplicado a la
producción de alcohol, algunos aminoácidos y otros compuestos.
La Microbiología Industrial ofrece también como se ha visto alternativas
interesantes y únicas para resolver problemas de contaminación ambiental, ya sea para el tratamiento convencional de residuos o para el aprovechamiento específico de algunos de ellos, por lo cual es de esperar
en el futuro nuevos avances en este campo vinculados a mejoras en el
control de los procesos en conjunto con adelantos en los conocimientos
básicos y diseño de nuevos reactores. Recientes desarrollos que están
siendo investigados y que sin duda tendrán mayor trascendencia en el
futuro en esta área están relacionados con el uso de microorganismos
para la eliminación de metales pesados y purificación de efluentes gaseosos. Finalmente las metodologías tecnológicas utilizadas en el desarrollo
de procesos de la Microbiología Industrial son ya de gran valor para otro
tipo de procesos biotecnológicos, como los que se realizan con células
animales y vegetales. En este último caso se suele emplear ya el término
fitofermentación para referirse a procesos realizados con cultivos de células en suspensión en biorreactores.
284
Capítulo 3
Dos procesos microbiológicos de fermentación revisten
importancias prácticas en la alimentación de animales
de la granja, que ocurren cuando se almacena o se
efectúan reservas de forrajes para uso posterior.
1. Ensilado: Consiste en el mejoramiento del valor nutritivo de los alimentos, sea fermentado el
alimento mismo o bien otros materiales que se
pueden emplear como aditivos para suplementar el
alimento original.
2. Mejoramiento del contenido de principios nutritivos mediante fermentación. La antigua práctica de
dar papilla a los cerdos era un proceso de fermentación continua.
En la actualidad se utilizan técnicas más sofisticadas
y mejor controladas de fermentación, entre ellas las
siguientes:
PROTEÍNAS AMINOÁCIDOS: Las levaduras que son
un producto de fermentación, presentarían las características más favorables como importante fuente de
proteínas, en comparación con todos los demás microorganismos. Además de su valor proteico, la levadura
depara otros beneficios importantes desde el punto de
vista nutricional, en particular por su contenido de vitaminas del complejo B.Muchas veces es ventajoso suplementar las raciones para el ganado con determinados
aminoácidos y con proteínas intactas. Así, es de notar
que en la actualidad se realizan fermentaciones en
escala comercial para producir lisina y ácido glutámico.
VITAMINAS: Cierto suplementos vitamínicos se obtienen mediante fermentación. Se desarrollan procesos
para sintetizar caroteno y vitamina A, Riboflavina y vitamina B12. Además, una multitud de microorganismos
elaboran vitaminas del complejo B.
285
Capítulo 3
ENZIMAS: Existen procesos microbiológicos para producir diversas enzimas
y la idea de mejorar la eficiencia digestiva de los animales agregando
enzimas apropiadas a la dieta es apasionante, pero el aparato digestivo
de los animales produce suficientes enzimas para obtener la digestión
máxima de almidones, grasas y proteínas.
En lo mencionado anteriormente, se identifican algunas contribuciones que
los procesos de fermentación han hecho a la alimentación de los animales, pero más allá de esta realizaciones existe un ámbito que ha ejercido
un gran impacto: el empleo de procesos de fermentación para convertir
en alimento para el ganado los subproductos y materiales de desechos y
al mismo tiempo, reducir la contaminación del ambiente humano.
8.1.1 Vitaminas
Las vitaminas son compuestos orgánicos requeridos
en pequeña cantidad por el organismo, pero imprescindibles para un desarrollo normal del hombre y los
animales. El estudio de las vitaminas es relativamente
nuevo, aunque las enfermedades producidas por sus
deficiencias se conocen desde hace muchos años.
Los requerimientos de vitaminas para el hombre y los
animales se deben distinguir; en éstos últimos, entre las necesidades de las vitaminas en los procesos
metabólicos y las necesidades de las vitaminas en la
alimentación. Por ejemplo, los rumiantes requieren en
sus procesos metabólicos muchas de las vitaminas del
complejo B, en cambio, no necesitan recibirlas en la
alimentación ya que las sintetizan las bacterias del rumen. El ácido ascórbico o vitamina C es requerida en
los procesos metabólicos de numerosas especies, es
esencial en la alimentación de alguna de ellas (hombre,
mono), ya que la mayor parte de las especies la sintetizan en sus organismos en cantidad suficiente.
Para los bovinos, el complejo vitamínico B y la vitamina K son sintetizada por las bacterias del rumen y la
vitamina C en los tejidos. O sea, que prácticamente,
las vitaminas A, D y en algunas casos la E podrían
286
Capítulo 3
ser las únicas con posibilidad de deficiencia, aunque si
los animales dispongan de una buena alimentación las
mismas no se producirán.
Complejos compuestos orgánicos que participan en sistemas enzimáticos esenciales para transportar energía
y regular el metabolismo corporal, se requieren en
minúsculas cantidades en una o más especies de animales para el crecimiento normal, producción, reproducción y/o salud.
Son solubles en las grasas o agua; sobre esta base, se
agrupan del siguiente modo:
Vitaminas Liposolubles: se disuelven en grasas. Ejemplo:
vitamina A, D, E y K.
Vitaminas Hidrosolubles: se disuelven en agua. Ejemplo:
B, C, etc.
287
Capítulo 3
288
Capítulo 3
Unidad 9. Producción de alcohol, ácidos orgánicos y
proteínas unicelulares.
9.1 RAP Conoce los fermentadores industriales, su función,
métodos y procesos implicados en los procesos microbiológicos
9.1.1 Producción de alcohol
La fermentación es un proceso metabólico energético que comprende la descomposición de moléculas, tales como carbohidratos, de manera anaerobia, se ha
utilizado desde tiempos antiguos en la preparación de alimentos y bebidas. El desarrollo químico ha revelado la naturaleza biológica del proceso de fermentación,
que da como producto el alcohol etílico y pequeñas cantidades de propanol, butanol, ácido acético, y ácido láctico; los alcoholes de alta concentración también se
pueden formar. El alcohol etílico está familiarizado con las bebidas alcohólicas. En
su forma no natural es usado como un solvente industrial y como materia prima
para la manufactura de acetaldehido, acetato etílico, ácido acético, dibromito de
etileno, glicol y muchos otros químicos orgánicos. El alcohol puro también puede
ser utilizado para propósitos medicinales, farmacéuticos y saborizantes.
La fermentación del alcohol etílico es realizada en forma cerrada por cualquier
carbohidrato rico en substratos. La melaza, licor producido de desechos, permanece después de la cristalización de la sacarosa y es usada ampliamente como
materia prima en la fermentación alcohólica. La melaza contiene 35-40% de sacarosa y 15-20% de azúcares invertidos (glucosa y fructuosa). La melaza contiene
21-22% de sacarosa y 50-55% de azúcares invertidos. La mayoría de las melazas
no requieren otros nutrientes adicionales para realizar la fermentación del alcohol
etílico. Sin embargo, las melazas requieren cantidades considerables de sulfato de
amonio y otras sales, como fosfatos. El contenido de nutrientes no azucarados
de 50-lids de las melazas es aproximadamente 7%, comparado con el 28-35%
encontrado en las melazas.
El alcohol etílico también puede ser producido por fermentación del almidón, suero
o licor de desechos de sulfito. La fermentación de granos requiere un pretratamiento, dado que la levadura no puede metabolizar directamente el almidón. Los
granos (usualmente el maíz) son agrupados y calentados en una lechada acuosa
para gelatinizar o solubilizar el almidón. Algunas enzimas líquidas pueden ser añadidas a bajas temperaturas. El almidón líquido es enfriado alrededor de 65°C y
tratado con amilasa de malta o de hongos para convertir el almidón en oligosa-
289
Capítulo 3
cáridos. Luego, la levadura es añadida junto con amiloglucosidasa (o glucoamilasa)
los cuales convierten los oligosacáridos en glucosa. El proceso de fermentación
y refinación posteriores son los mismos que se realizan cuando se usa melaza
como materia prima.
La producción del alcohol etílico es realizada a través de procesos eficientes y
automáticos. El proceso de manufactura no es muy complejo y es fácil de realizar.
El control de la contaminación y el mantenimiento y reparación de las maquinarias y equipos también son fáciles. Aquellas naciones con climas tropicales y
sub-tropicales, con abundante producción de azúcar y maíz, podrían invertir en el
establecimiento de esta planta de producción que puede ser orientada tanto a la
exportación como a la importación.
Descripción del proceso
1. Transporte y almacenamiento de la melaza: La melaza obtenida desde una fábrica proveedora es transportada vía transferencia de tuberías o carros de almacenamiento a la planta de procesamiento de alcohol etílico. La melaza es colocada en
un tanque de almacenamiento de concreto bajo tierra por bombeo de la melaza.
Proceso de fabricación del vino
Cuando el proceso ha comenzado, la melaza almacenada será bombeada en un
contenedor o vasija de disolución para ajustarlo a una concentración adecuada.
290
Capítulo 3
2. Preparación de la melaza: La melaza es bombeada dentro del tanque medidor a
través de un bombeo desde el tanque bajo tierra, el cual recibe el material directamente desde el tanque de almacenamiento por transferencia de tuberías. Después
que la melaza es medida exactamente, fluye hacia el tanque de disolución de la
melaza. Debido a su resistente concentración de azúcar, la melaza no soporta una
fermentación directa; por lo tanto, primero debe ser diluido a la concentración
deseada. Éste es llamado masa o templa, y presenta los carbohidratos listos para
la inoculación o vacunación de los cultivos de semillas. La melaza utilizada en este
proceso no necesita ser esterilizada o “nutriotinizada” por un proceso diseñado
especialmente, el cual será útil para eliminar el consumo de vapor y los costos
de producción de corte. Después de que la melaza es diluida a la concentración
deseada, una mezcladora automática ayudará a darle una concentración homogénea para el proceso de fermentación, antes de que sea bombeado a una serie
de fermentadores de acero.
3. Estación de cultivo de granos: La estación es equipada con un fermentador piloto en conjunto con el equipo de cultivo de granos y los instrumentos de cultivo
diseñados especialmente. Este proceso es realizado bajo una exacta supervisión de
laboratorio, incluyendo la selección de la inoculación de los granos de levadura, la
adición de nutrientes, el ajuste del pH, el control de temperatura, y finalmente, la
limpieza y esterilización de la máquina de cultivo de levadura para la realización
del siguiente lote.
4. Suministro de agua procesada: El equipo suministrador de agua procesada y
el equipo incrementador de presión son proporcionados. El agua utilizada en el
proceso podría ser tratada como agua drenada de calidad o suministrado por un
pozo de 90-100 metros de profundidad.
5. Estación de fermentación: Los fermentadores se conectan por tuberías para una
operación de fermentación continua. Esta estación debe tener un control automático de temperatura, velocidad de flujo, operación de templado y operación de
alimentación. Usualmente el ciclo de fermentación dura de 2-3 días. Dado que el
alcohol etílico es formado por levadura desde monosacárido, es necesario descomponer la sacarosa en d-glucosa y l-fructuosa.
291
Capítulo 3
Las enzimas producidas por la levadura cambian los monosacáridos en alcohol y
dióxido de carbono. Después que ha sucedido la reacción, el alcohol etílico presente en los fermentadores puede ser separado por destilación. El contenido de
alcohol de la masa es de 7-12% de su volumen, es bombeada hasta la sección de
destilación del alcohol. Después de pasar a través de varios intercambiadores de
temperatura, el residuo en la base del destilador transporta proteínas, residuos de
azúcar y otras impurezas que pueden ser extraídas y usadas como componentes
para alimento animal.
6. Estación de destilación y rectificación: El caldo conteniendo alcohol etílico, agua,
aldehido, ácido acético, etc., pasa a través de un intercambiador de temperatura hacia
un condensador parcial para mantener el alcohol en la columna y para proporcionar
un reflujo para las placas superiores. Los productos más volátiles, los cuales todavía
pueden contener rastros de aldehído y alcohol, son condensados completamente y
transportados detrás de la parte superior del destilador de aldehido. Cerca de la parte
superior de la columna, el 95-96% del alcohol es absorbido a través del condensador
para su almacenamiento.
9.1.2. Producción de ácidos orgánicos
Los ácidos orgánicos encuentran amplio uso como aditivos en la industria de
alimentos y también como aditivos químicos en piensos. Todos los ácidos del
ciclo de los ácidos tricarboxílicos pueden ser producidos microbiológicamente
con un alto rendimiento. Algunos ácidos que derivan indirectamente del ciclo
de Krebs, como el ácido itacónico (se obtiene a partir del ácido isocítrico),
también pueden producirse de la misma manera. Así mismo se obtienen otros
ácidos orgánicos que derivan directamente de la glucosa (p.ej. el ácido glucónico) o que se forman como productos finales a partir del piruvato o del etanol
(p.ej. el ácido láctico o el ácido acético).
Excepto en la producción del ácido cítrico, que se produce enteramente por
procesos microbianos, existe frecuentemente una gran competición entre los
procesos químicos y los biológicos. En algunos ácidos como el láctico y acético, se utilizan indistintamente los métodos químicos o microbiológicos para
su preparación. Para otros ácidos (cetoglutárico, málico) se han desarrollado
procesos de fermentación que no se utilizan comercialmente, bien debido a la
insuficiente demanda del ácido o por razones económicas.
292
Capítulo 3
Ácido cítrico
La principal fuente de ácido cítrico, antes de que se desarrollaran los procesos
microbianos, fueron los cítricos procedentes de Italia (los limones contienen
7%-9% de ácido cítrico). Actualmente, más del 99% de la producción mundial
de ácido cítrico se produce microbiológicamente. El 70% se utiliza en la industria de alimentos y bebidas, ya que el sabor de los jugos de frutas, extractos de
jugos de frutas, caramelos, helados y mermeladas se aumenta o se preserva por
adición de ácido cítrico. El 20% se destina a productos farmacéuticos como el
citrato de hierro y ácido cítrico que se usan como conservantes de la sangre
almacenada así como en tabletas, pomadas y preparaciones cosméticas. En la
industria química (10% restante) el ácido cítrico se utiliza como agente antiespumante, como reblandecedor y para el tratamiento de textiles. En la industria
metalúrgica los metales puros se producen como citratos metálicos.
En la actualidad, para la producción comercial de ácido cítrico, sólo se utilizan
mutantes de Aspergillus niger. La esencia de la obtención del ácido cítrico
conlleva limitar las cantidades de trazas de metales, como el manganeso y el
hierro (cofactor de la aconitasa), para evitar el sobre crecimiento de Aspergillus
niger. El medio suele tratarse con resinas de intercambio iónico para asegurar
concentraciones bajas y controladas de los metales disponibles. La obtención
del ácido cítrico, que en un principio se realizaba mediante el crecimiento en
una superficie estática, ahora se lleva a cabo en fermentadores aeróbicos con
agitación. Generalmente se utilizan como materia prima las melazas en altas
concentraciones (15-18%). El ácido cítrico es un producto metabólico primario
y se forma en el ciclo de los ácidos tricarboxílicos. La glucosa es la principal
fuente de carbono utilizada para la producción de ácido cítrico. En la trofofase,
parte de la glucosa añadida se utiliza para la producción de micelio y se convierte, a través de la respiración, en CO2. En la idiofase, el resto de glucosa se
convierte en ácidos orgánicos existiendo una pérdida mínima por respiración.
Durante la idiofase y cuando el nivel de sustrato es alto, se expresan todas las
enzimas del ciclo de Krebs excepto la α-cetoglutarato deshidrogenasa. La actividad citrato sintasa aumenta por un factor de 10, mientras que las actividades
de las enzimas que catalizan el ácido cítrico, aconitasa e isocitrato deshidro-
293
Capítulo 3
genasa, se reducen drásticamente en comparación con su actividad durante
la trofofase. Esto da lugar a una acumulación y excreción de ácido cítrico por
el microorganismo sobrecargado. El rendimiento teórico es de 112g de ácido
cítrico anhidro por 100g de sacarosa. Sin embargo, tales rendimientos no se
obtienen en la práctica debido a las pérdidas durante la trofofase. Generalmente se consigue un 60% sobre el rendimiento teórico.
Ácido glucónico
En la producción de ácido glucónico sólo participa una
única enzima microbiana, la glucosa oxidasa, que se encuentra en Aspergillus niger. Este hongo crece en condiciones óptimas en el líquido de maceración del maíz, pero
cuando el crecimiento se ve limitado por el nitrógeno, las
células en reposo transforman la glucosa restante en ácido glucónico. El gluconato sódico se utiliza como agente
secuestrante en muchos detergentes.
Ácido acético
La producción de ácido acético a partir de líquidos alcohólicos ha sido conocida desde hace tanto tiempo como
la producción de vino (unos 10.000 años). Los romanos y
los griegos, que utilizaban el vinagre diluido como bebida
refrescante, producían vinagre dejando el vino abierto al
aire. El vinagre se produjo sólo para consumo local hasta
la Edad Media. Los primeros vinagres fabricados industrialmente eran producidos en vasijas planas abiertas.
Eran procesos lentos en los que flotaba una película de
bacterias sobre la superficie del vino. En el siglo XIX se
modificaron los procesos en superficie hacia procesos más
rápidos. Uno de estos, el proceso del generador de goteo,
se utiliza todavía en la actualidad.
En este proceso el biorreactor de madera tiene un volumen
de 60 m³ y está lleno de virutas de haya. El material de
partida se rocía sobre la superficie y se deja gotear a través
de las virutas (que contienen bacterias) hasta el fondo del
294
Capítulo 3
recipiente donde la solución parcialmente convertida es
enfriada y bombeada de vuelta a la parte superior. A medida que el alcohol pasa a través de las virutas, las bacterias
acéticas (Acetobacter y Gluconobacter) oxidan parte del
alcohol a ácido acético. Este proceso se repite hasta que
se obtiene el vinagre con la fuerza que se quiera. Al ser
un proceso aeróbico se debe suministrar abundante aire
a través de la cámara. Además, la temperatura se debe
mantener entre 15°C y 34ºC que es el rango óptimo de crecimiento de Acetobacter. Del alcohol que se añade, el 8890% se convierte en ácido acético. El resto del alcohol se
utiliza en el metabolismo primario o escapa con los gases
de salida. El tiempo necesario para producir ácido acético
del 12% mediante este proceso es de unos tres días.
9.1.3 Producción de proteína unicelular
El término proteína unicelular (PUC) se emplea para referirse a microorganismos
tales como bacterias, levaduras, algas y hongos filamentosos, que son empleados
para alimentación humana o animal, principalmente por su alto contenido en
proteínas. El hombre ha consumido microorganismos presentes en alimentos
fermentados desde hace siglos y más recientemente empleo para consumo
animal microorganismos derivados de la producción de cerveza y de bebidas
alcohólicas.
Pero el alto costo de su producción sólo es competitivo en ciertas
circunstancias
respecto de las proteínas de origen vegetal. Los
microorganismos crecen rápidamente, lo cual es una de las razones más
importantes para su interés en su producción industrial.
Bacterias de los géneros Methilomonas, Pseudomonas, Bacillus y Aerobacter
tuvieron en los 60 gran interés debido a su alta velocidad de duplicación
y alto contenido proteico; pero el incremento del costo de los sustratos
(metano, metanol, hidrocarburos...) han limitado su aplicación.
Sin embargo ciertas especies de levaduras, como Cándida utilis,
Saccharomyces cerevisiae y Kluyveromycees fragilis (k.marxianus) han sido
aceptadas para alimentación humana y producidas continuamente desde
la Segunda Guerra Mundial.
295
Capítulo 3
Los hongos filamentosos y las algas tienen la desventaja de crecer más
lentamente. En la actualidad se producen comercialmente los hongos
Gliocladium deliquescens, Paecilomyces varioti y Fusarium graminearum y
las algas Spirulina y Chlorella. En el caso de las algas, su producción es
similar a la de la agricultura convencional.
En cuanto al sustrato, aunque la atención inicial se centró en hidrocarburos
y derivados del petróleo, recientemente se ha derivado hacia recursos
renovables como residuos agrícolas y subproductos industriales. En muchos
casos los sustratos requieren de un pretratamiento fisico, químico o
enzimático previo a la fermentación. Los residuos agrícolas forestales, por
ejemplo, deben ser hidrolizados a azúcares simples o sometidos a una
deslignificación parcial para que puedan ser fácilmente accesibles a los
microorganismos.
Los principales sustratos utilizados son alcanos, alcoholes y
carbohidratos:
La Cándida utilis se obtuvo en ambas guerras mundiales como suplemento
proteico por fermentación de caldos de sulfito desecho de plantas de
celulosa y por crecimiento en melazas en Jamaica. Después también en
USA y Finlandia como levadura forrajera; pero debido a la superabundancia
de proteínas vegetales, estos procesos se convirtieron en antieconómicos.
En Finlandia (1974) se desarrolló el proceso Pekilo para la producción de
proteínas de organismos unicelulares fúngicos para alimentación animal,
haciendo crecer Paecilomyces varioti y utilizando como sustrato caldos
de sulfito.
La celulosa de fuentes naturales y restos de madera como material
de partida para la producción de PUC frecuentemente necesita de un
pretratamiento térmico o químico combinado con la hidrólisis enzimática.
El suero de leche entera o el desproteizado son una fuente de carbohidratos
que crea problemas de eliminación, de variaciones estacionales de
suministro y elevado contenido en agua. Aunque la mayoría de los
organismos no utilizan lactosa como fuente de carbono, las levaduras
Kluyveromyces fragilis crecen fácilmente en este carbohidrato, por lo que
se han construido plantas utilizándolo para la producción de PUC.
El proceso Symba diseñado en Suecia para producir PUC utiliza dos cepas
296
Capítulo 3
de levaduras: Saccharomycopsis fibuligera, que produce enzimas para la
degradación del almidón y permite el cocrecimiento de Cándida utilis, fue
diseñado para aprovechar los deshechos del procesado de patata.
La glucosa de calidad alimentaria fue el sustrato elegido por RHM ( Rank
Hovis McDougall para producir PUC utilizando Fusarium graminearum.
El proceso original de BP (British Petroleum) para producir PUC mediante
la fermentación de alcanos que aunque el costo del sustrato ( ceras
contenidas en el gas-oil) era bajo, hubo de cerrar debido a los inconvenientes
de eliminar de las levaduras producidas los carcinógenos y el mal olor
mediante un exhaustivo proceso de extracción y además existía cierta
tendencia a la contaminación microbiana. Otra planta construida en
Cerdeña en asociación de BP y ANIC que empleaba n-parafinas nunca fue
autorizada a operar comercialmente.
ICI
escogió metanol como sustrato para la producción de PUC para
consumo animal, usando Methilophilus methylotrophus; pero también hubo
de cerrar con el aumento del precio del metanol.
ICI se asoció con RHM para usar el proceso Fusarium RHM en la gran
planta de fermentación de ICI.
Pure Culture Products utilizó etanol como sustrato y Cándida para producir
proteínas de calidad alimentaria, hasta que dejó también de ser rentable.
297
Capítulo 3
Actividad es 15, 16 y 17
ACTIVIDAD 15Indica la maquinaria y equipo para la producción de alcohol.
Práctica
ACTIVIDAD 16-¿Dónde se recomienda que se ubique la planta de producción de
alcohol?
C 27,06 / M 100 / Y 100 / N 27,84
C 19,61 / M 10,98 / Y 19,61 / N 0
C 44,71 / M 41,96 / Y 100 / N 16,86
298
C 69,02 / M 53,73 / Y 34,51 / N 10,2
Capítulo 3
ACTIVIDAD 17¿Cómo se selecciona un microorganismo para la producción de
proteína unicelular?
299
Capítulo 3
300
Capítulo 3
Unidad 10 Producción industrial de enzimas, antibióticos
y productos lácteos fermentados
10.1 RAP Conoce los procesos de obtención de enzimas,
antibióticos y productos lácteos en la industria
10.1.1 Producción industrial de enzimas
La producción de enzimas para uso industrial tuvo sus orígenes en
Dinamarca y Japón, a finales del siglo XIX, cuando se produjeron las
primeras preparaciones de renina a partir del estómago de becerros
y de amilasa de origen fúngico. Las enzimas son productos de las
células y por lo tanto, pueden obtenerse a partir de tejidos animales,
tejidos vegetales o mediante procesos de fermentación empleando
microorganismos seleccionados. Las plantas han sido la fuente tradicional
de ciertas enzimas. A partir del latex producido por la papaya, algunas
proteasa aisladas desde la higuera y la piña. La cebada malteada también
ha sido fuente importante de enzimas vegetales. La industria cervecera ha
empleado tradicionalmente este material crudo por su actividad proteásica
y amilásica. En cuanto a las enzimas de origen animal, se han obtenido
pocas, por ejemplo, lipasa pancreática y tripsina, debido principalmente
a la disponibilidad limitada de material adecuado y a la posibilidad
de reemplazarlas por enzimas similares derivadas de microorganismos.
Debido a que las aplicaciones industriales de las enzimas requieren que
éstas sean producidas a gran escala y bajo costo, el empleo de algunas
enzimas de origen vegetal y animal ha ido decayendo, en favor de las
enzimas de origen microbiano.
Una de las primeras enzimas producidas industrialmente fue la amilasa
fúngica takadiastasa, empleada en USA como agente farmacéutico (para
los desórdenes intestinales) en 1894. El proceso patentado de Otto Roehm
“procesos de lavandería para todos y cualquier tipo de tejidos mediante
adición de enzima tríptica” se anunciaba en 1915. En 1969, el 80% de
todos los detergentes de lavandería contenían enzimas, fundamentalmente
proteasas. Junto a éstas se empezaron a utilizar en la industria de los
detergentes enzimas adicionales como lipasas, amilasas, pectinasas y
oxidorreductasas. En 1971 y debido a la existencia de alergias entre los
trabajadores de la industria de producción, así como entre los consumidores,
se redujo drásticamente el uso de proteasas en detergentes. Solamente
cuando se desarrollaron técnicas especiales, como la microencapsulación,
pudieron ser producidas preparaciones de proteasas carentes de riesgo
301
Capítulo 3
para los trabajadores y los consumidores. Actualmente en Europa el
95% de los detergentes de lavandería contienen proteasas (subtilisinas).
Mientras que en México sólo el 40% de los detergentes contienen el
40% proteasas.
En la actualidad se producen comercialmente las siguientes enzimas:
1. Enzimas utilizados en la industria como amilasas, proteasas, catalasas,
isomerasas y penicilina acilasas.
2. Enzimas utilizadas con propósitos analíticos como la glucosa oxidasa,
galactosa oxidasa, alcohol deshidrogenasa, hexoquinasa, muraminidasa y
colesterol oxidasa.
3. Enzimas utilizadas en medicina como la asparraginasa, proteasas, lipasas
y estreptoquinasa.
Estas tres áreas de aplicación requieren niveles variables de calidad y
cantidad. Con base en toneladas, las más importantes son las enzimas
industriales que se producen en fermentadores de 120 m³, mientras que
en las enzimas producidas para propósitos analíticos o médicos se utilizan
fermentadores de planta piloto. Todas las enzimas producidas en grandes
cantidades, salvo la glucosa isomerasa y la invertasa, son extracelulares.
Las enzimas pueden ser intracelulares o extracelulares. Pocas enzimas
intracelulares son producidas a gran escala y las ventas de estas enzimas
representan sólo un pequeño porcentaje del total de ventas. Sin embargo, la
producción de enzimas intracelulares es de gran interés por varias razones.
Con los avances en las técnicas de inmovilización, el uso de enzimas y
células inmovilizadas está en aumento. Por ejemplo, se han establecido
procesos comerciales para la producción de jarabes de fructosa usando
glucosa isomerasa. Enzimas Extracelulares los microorganismos producen
una amplia variedad de enzimas potencialmente útiles, muchas de las
cuales son excretadas al medio. La mayoría de las enzimas extracelulares
son producidas por organismos pertenecientes a dos géneros: Bacillus y
Aspergillus. y que en su mayoría son del tipo hidrolítico.
302
Capítulo 3
Estabilidad de las enzimas
La frágil naturaleza proteica de las enzimas, que conlleva a una estabilidad
limitada de su estructura y funcionalidad, constituye un aspecto importante en
un contexto tecnológico. Se considera que una enzima es apropiada para una
aplicación comercial, si su estabilidad es suficiente para dicha aplicación.
Las enzimas se obtienen por fermentación en cultivos semisólidos, sumergidos, extracción de tejidos, ya sea en plantas o animales bajo condiciones
controladas. Unas 20 compañías de Europa, Japón y Estados Unidos realizan
la producción de enzimas; pero el mercado es dominado por 3 de ellas: Novo
Nordisk (Dinamarca) con el 50% de las ventas a nivel mundial, seguida por Gist
Brocades (Neatherlands) y Rhom and Haas (Alemania).
El mercado de las enzimas ha tenido gran crecimiento desde los años 70 y
éste ha sido paralelo con el desarrollo de un gran número de aplicaciones en
la industria alimentaria.
En América latina existen empresas productoras de enzimas en México, Brasil,
Argentina y Uruguay, muchas de las cuales son subsidiarias de empresas transnacionales, como es el caso de Pfizer en México y Brasil y Novo en Brasil. En
Colombia no hay producción de enzimas a escala industrial, siendo importadas
de diversos países de Europa, también de Japón, Estados Unidos , Canadá y
México. La importación de enzimas en Colombia se hace en su mayor parte
a través de representantes o casas comerciales; pero algunas industrias de
cervecería, molinería y lácteos hacen importación directa de las enzimas que
requieren.
303
Capítulo 3
Carbohidrasas
Las amilasas se encuentran ampliamente distribuidas en la naturaleza, son
las enzimas responsables de la degradación del almidón, hidrolizan los
enlaces glucosídicos α-1-4. Las amilasas se pueden dividir en tres grupos:
α-amilasas: rompen al azar los enlaces en el interior del sustrato
(endoamiladas);
β-amilasas: hidrolizan ordenadamente en unidades de maltosa a partir de
los extremos no reductores del sustrato (exoamilasas) y
glucoamilasas: liberan unidades de glucosa a partir de los extremos no
reductores del sustrato.
Las b -amilasas están presentes en la mayoría de las plantas superiores,
están ausentes en los mamíferos y su existencia en microorganismos es
dudosa. Se han cristalizado β amilasas a partir de trigo, malta de cebada,
patata dulce y soya. La enzima hidroliza únicamente enlaces glicosídicos
α-1-4, con inversión en la configuración del C 1 en el glicosido, de la
forma α a la forma β.
Este cambio de configuración es la razón por la cual la enzima se llama
beta amilasa.
Los pH’s de mayor actividad para las β amilasas están en el rango entre
4.5 - 7 y el límite de temperatura está alrededor de 55°C. Los grupos
sulfhídricos son esenciales para la actividad, por lo que la enzima se
inactiva por oxidación, por los metales pesados y sus sales.
Glucoamilasa (amiloglucosidasa)
El principal producto final de la acción de la glucoamilasa sobre el
almidón es glucosa, lo que la diferencia claramente de las α y β amilasas.
La enzima también produce pequeñas cantidades de oligosacáridos.
La sacarificación del almidón puede alcanzar hasta 96% de dextrosa. La
acción de la enzima causa inversión de la configuración, produciendo β
glucosa.
En el comercio se encuentran diversas preparaciones derivadas de hongos
de los grupos Aspergillus y Rhizopus. excepto por la enzima de Aspergillus
304
Capítulo 3
awamori; las glucoamilasas son inactivas sobre almidón nativo. Su actividad
es máxima entre pH 4 y 5.5, y temperatura alrededor de 55°C – 65°C. La
velocidad de reacción cae rápidamente a medida que disminuye el tamaño
de la molécula de sustrato, siendo máxima sobre almidones previamente
sometidos a licuefacción.
La producción de nuevos compuestos representa otra posibilidad interesante
de los procesos fermentativos. Un ejemplo está constituido por diversos
productos que presentan actividad farmacológica como los inhibidores
enzimáticos y los antitumorales.
Algunos inhibidores enzimáticos han sido ya aceptados en algunos
países para su empleo en medicina humana, como la bestatina, un
inmunoregulador.
Otros productos interesantes en desarrollo son los polímeros biodegradables
como el polibetahidroxibutirato, que tiene aplicaciones industriales y
medicinales.
305
Capítulo 3
Actividad 18
¿Cuáles son las enzimas pécticas?
Práctica
C 27,06 / M 100 / Y 100 / N 27,84
C 19,61 / M 10,98 / Y 19,61 / N 0
C 44,71 / M 41,96 / Y 100 / N 16,86
306
C 69,02 / M 53,73 / Y 34,51 / N 10,2
Capítulo 3
10.1.2 Métodos de obtención de antibióticos
Definición
Son sustancias químicas producidas por organismos vivientes, capaces
de inhibir en pequeñas cantidades los procesos vitales de ciertos
microorganismos, destruyendo e impidiendo su desarrollo y reproducción.
Literalmente la palabra “antibiótico” significa cualquier sustancia
antagonista de la vida, pero en medicina este término tiene un concepto
más restringido.
Para su uso en terapia humana es también necesario un elevado índice
terapeútico.
La definición de antibiótico hecha por Waksman (1951) se refería a las
sustancias producidas por microorganismos, pero en la actualidad debe
ampliarse la definición para poder incluir sustancias similares preparadas
sintéticamente o existentes en algunas plantas superiores. La mayor
parte de los antibióticos utilizados en clínicas, son producidos por
microorganismos u hongos del suelo, pero se conocen ejemplos de otro
grupo que se mencionan a continuación:
Líquenes: Muchos de los antibióticos parecen deber sus propiedades
bacteriótaticas y antifúngicas al ácido úsnico o al ácido vulpínico.
Monocotiledóneas: El ajo fresco debe su acción antibiótica a la aliína,
aminoácido que contiene azufre.
Dicotiledóneas: Son ejemplo de este grupo los siguientes: lúpulo (Fam.
Cannabinaceae) que contiene las cetonas humuleno y lupuleno; en el
Anemone pulsatilla y en muchas otras ranunculaceaes está la lactona
protoanemonina; diversos compuestos sulfurados se han encontrado
en las crucíferas; en la Drosera se encuentra la plumbagina (2-metil-5hidroxil-1,4-naftoquinona). De las compuestas se han aislado principios en
diversas especies como la bardana, el cardo y el Hieracium pilosella. Esta
última planta, “oreja de ratón” o “pelosilla”, se ha utilizado clínicamente
para el tratamiento de la fiebre de Malta. Se han ensayado respecto a la
actividad antimicrobiana muchas otras plantas y en la literatura científica
están apareciendo continuamente nuevos trabajos.
307
Capítulo 3
Historia
El primer registro científico de actividad antibiótica fue realizado por Luis
Pasteur (1877), quién comunicó que no se había desarrollado el Carbunco
en animales inyectados con un inóculo que contenían bacillus Anthracis
y otros bacillus comunes. En la figura número 16 se muestra como se
puede separar un microorganismo en forma selectiva dentro de una caja
Petri, para lo cual se utiliza un medio de cultivo selectivo.
En Tyndal (1881), en sus ensayos sobre la materia flotante en el aire,
en relación con la putrefacción e infección , establecía que en algunos
tubos que contenían una infusión nutritiva y bacterias y que se habían
contaminado también con Penicillium glaucum, las bacterias perdían su
“poder de translación y caían al fondo del tubo”. Tyndal interpretó este
fenómeno como debido a la suspensión del suministro de oxígeno a las
bacterias por las películas formadas por el moho. Diez años después del
descubrimiento de Pasteur, Emmerich (1887) descubrió accidentalmente que
un cobaya al que había inyectado inicialmente Estreptococcus erysipelatis
no padeció el cólera al inyectarle cultivos virulentos de Vibrium cholerae .
Reconoció inmediatamente el significado del descubrimiento y logró evitar
el ántrax en animales de experimentación administrando Str. Erysipelatis
previamente a la inyección de bacillus anthracis.
Figura 16. Aislamiento de un
microorganismo para la producción de
antibióticos.
308
Capítulo 3
Bouchard (1889) comunicó que el Pseudomona aeruginosa evitaba el
desarrollo del ántrax en el conejo, observación que fue ampliada por
Woodhead y Wood (1889) al descubrir que cultivos esterilizados de P.
aeruginosa; concentraron estos filtrados, desprovistos de células en un
décimo de su volumen inicial y demostraron que destruían al Corinebacterium
difteriae, stafilococcos, estreptococos, neumococos, gonococos, el vibrium
cholerae y Shigella paradysenteriae in vitro. En la actualidad se ha aislado
y purificado el principio activo de este preparado, determinándose su
estructura. El reconocimiento del fenómeno de la antibiosis había sido
establecido, pero Sir Alexander Fleming observó en 1928 la inhibición
de las bacterias por una colonia de Penicillium notatum que se habían
desarrollado como contaminante sobre una caja petri. Fleming abogó en
su publicación por el posible uso clínico de la sustancia formada en el
cultivo de Penicillium.
Con la Segunda Guerra Mundial se inició un programa a gran escala
para la producción y ensayo de la sustancia, conocida en la actualidad
como Penicilina y los recursos de la industria y de las instituciones
académicas se dedicaron al estudio de esta sustancia y a la búsqueda
de otros antibióticos. Esto tuvo como consecuencia el descubrimiento de
Streptomicina , Aureomicina, Cloromicetina y muchos otros antibióticos.
En la actualidad para la fabricación de Penicilina han reemplazado al
P. notatum cepa de alto rendimiento de Penicillium chrysogenum, que
producen además poco pigmento. Se consigue la síntesis preferente de
Bencilpenicilina por adición de ácido fenilacético al medio de fermentación.
Constitución química
En general los antibióticos son sustancias químicas diversas, complejas, de
gran peso molecular, cuya síntesis suele ser muy dificultosa, y en algunos
casos antieconómica en comparación con su obtención por los medios
biotecnológicos.
La adición de varios radicales químicos a la estructura molecular de los
antibióticos da lugar a sustancias de mayor solubilidad, de menor toxicidad
y mayor actividad, y la alteración de la molécula ha producido algunas
sustancias antibióticas presumiblemente no conocidas en la naturaleza.
309
Capítulo 3
Penicilina
Es una sustancia antibiótica producida por los
hongos Penicillium notatum y P. chrysogenum
de la familia Aspergiliaceas. Es un hongo de
color verde azulado que posee delgadas hifas
sumergidas como también aéreas tabicadas de
las cuáles arrancan conideoforos ramificados. La
penicilina fue descubierta por Alexander Fleminig
en 1929.
Métodos de obtención de la penicilina
En general el procedimiento de obtención de
los antibióticos por métodos biotecnológicos, es
parecido y consiste en cultivar en gran escala el
hongo productor del antibiótico en un medio de
cultivo a temperatura adecuada y luego extraer
la sustancia activa desarrollada en el medio por
solventes especiales y evaporar el solvente y
someterlo después a purificaciones sucesivas.
Se conocen dos métodos para la producción
natural de la penicilina: el método de superficie y
el método de sumersión o de profundidad. En el
método de superficie las esporas o cenidios de
un cultivo de penicilina se desarrollan en forma
de nata en la superficie, del medio de cultivo
sílido, húmedo colocado en frascos planos o
en bandeja; este medio puede ser, por ejemplo,
salvado de trigo.
En el método de sumersión se desarrolla
en un medio líquido consistente en una
maceración de maíz con lactosa, colocado en
tanques de fermentación en donde el medio
es constantemente agitado y aireado y a una
temperatura de 23°C – 25°C; por este método se
obtiene el mayor rendimiento.
En ambos métodos las esporas germinan en
medio nutritivo formando un micelio que excreta
310
la penicilina vertiéndola en substrato; el micelio
se separa después de un tiempo por filtración a
presión y a 5°C. La penicilina cruda obtenida se
extrae ya sea por absorción con carbón activado
o por extracción del mismo medio mediante
solventes orgánicos no miscibles en agua. Cuando
se extrae por adsorción se hace pasar el medio
filtrado a través de una columna que contiene
carbón activado que adsorbe el antibiótico y
este es luego separado del carbón por medio de
un solvente apropiado (por ejemplo acetona al
80 %) por elusión, el cual por evaporación deja al
antibiótico que se purifica, se valora y se envasa.
La extracción de algunos medicamentos se
puede llevar a cabo por medio de dos líquidos
inmiscibles haciendo que el sustrato pase de una
fase a la otra; tal es el caso de la extracción del
ácido penicilínico utilizando agua y acetato de
amilo que son inmiscibles. El proceso consiste
en ajustar primero el pH a 2 para liberar el
ácido penicilínico que es soluble en el solvente
orgánico e insoluble en agua. La penicilina se
extrae del solvente orgánico con una solución
de bicarbonato de potasio o de sodio a pH de
7.5, formándose penicilina potásica o sódica.
Esta sal de penicilina se esteriliza por filtración a
través de filtros bactereológicos, para purificarse
por cristalización fraccionada. Una vez separada
la penicilina se seca al vacío a 1 a 2 °C y se
envasa asépticamente.
Capítulo 3
Tipos de penicilina
Se conocen diferentes penicilinas, todas las cuales derivan de una estructura química fundamental común : dos anillos heterocíclicos, uno de
tiazolidina y otro de beta - lactama, unido por un encadenamiento emídico
a un radical R variable; la penicilina es un ácido orgánico, el ácido penicilínico; pero por extensión se acepta el mismo nombre para sus sales.
Por el radical carboxilo la penicilina forma sales con los metales alcalinos.
Sustituyendo diferentes radicales en la posición R se tienen las siguientes penicilinas:
1. Bencil-penicilina R = C6H5CH2- , es la Penicilina G.
2. Pentenil-penicilina R = CH3CH2CH=CHCH2- , es la Penicilina F.
3. Heptil-penicilina R = CH3(CH2)6- , es la Penicilina K.
4. p-Hidroxibencil penicilina R = HO-C6H5-CH2- , es la Penicilina X.
5. Fenoximetil-penicilina R = C6H5OCH2- , es la Penicilina V.
De estas penicilinas, la más importante es la Penicilina G o bencil penicilina
que se combina con el sodio, potasio, calcio y la procaína para formar los
compuestos:
Penicilian G sódica, G potásica, G cálcica y Peniclina G Procaína, que es de acción prolongada. La penicilina V es activa por vía oral.
Actualmente existe la d-alfa-aminobencil-penicilina que es de amplio espectro,
activa contra microorganismos gram + y gram -, y activa por vía oral.
Propiedades
La penicilina que más abunda en el comercio es la penicilina G potásica o bencil
Penicilina potásica. Se presenta como un polvo cristalino blanco inodoro, muy
soluble en agua, también en alcohol y glicerina, insoluble en éter y cloroformo.
Se destruye por acción del calor, por ácidos, álcalis y agentes oxidantes y fermentos bacterianos.
Sus soluciones se deterioran a la temperatura atmosférica, pero refrigeradas
permanecen estables por algunos días.
311
Capítulo 3
Las sales de Penicilina que se fabrican actualmente permiten conservarlas en
estado sólido sin necesidad de refrigeración.
Identificación
La actividad de la penicilina es referida en unidades biológicas. Al tratar una
solución de penicilina al 2% con HCl diluido se forma un precipitado de ácido
Penicilinico que es soluble en exceso de ácido, alcohol, éter o cloroformo.
Acción farmacológica
La Penicilina tiene efecto bacteriostático (inhibiendo el desarrollo y reproducción de los gérmenes) o bacteriolítico (provocando su destrucción), según la
dosis y tiempo de contacto.
Figura 17.
312
Acción de la Penicilina inhibiendo el desarrollo y reproducción de gérmenes patógenos.
Capítulo 3
Espectro farmacológico
La penicilina es particularmente activa contra bacterias gran positivas, en especial en infecciones producidas por estafilococos, estreptococos, neumococos,
algunos clostridium y lactobacillus; ejerce también acción contra treponema
pallidum.
Es el antibiótico más usado, especialmente en infecciones estafilocócicas,
como Ántrax, en heridas y quemaduras infectadas, en el tratamiento de infecciones neumocócicas como neumonía, pleuritis y endocarditis neumocicas, en
enfermedades estreptocócicas como infección puerperal, peritonitis. En infecciones gonocócicas como gonorrea oftálmica. Se usa también en la sifilis, en la
Verruga peruana, profilacticamente en obstetricia y antes de las intervenciones
quirúrgicas.
En general la penicilina es considerada como una droga antibiótica de poca
toxicidad, sin embargo puede producir reacciones alérgicas como dermatitis,
urticaria, etc.
La penicilinasa es una enzima bacteriana que antagoniza específicamente el
efecto antimicrobiano de la penicilina produciendo su destrucción por la apertura del anillo lactámico.
313
Capítulo 3
Práctica 6
Identificación del Cloranfenicol
El Cloranfenicol es un antibiótico aislado a partir de cultivos de Streptomyces venezuelae de una muestra de tierra llevada de Caracas. Fue
descubierto por Burkholder en 1948.
Químicamente es C11H12Cl2N2O5. p-nitrofenil-di-cloroacetamido propanodiol, cuyo peso molecular es 323.13
Es un polvo blanco o blancoamarillento, inodoro, intensamente amargo; es
poco soluble en agua, muy soluble en alcohol, propilenglicol, acetona y acetato
de etilo. Es prácticamente estable en soluciones neutras o ligeramente ácidas,
pero se destruye rápidamente en solución alcalina.
C 27,06 / M 100 / Y 100 / N 27,84
C 19,61 / M 10,98 / Y 19,61 / N 0
C 44,71 / M 41,96 / Y 100 / N 16,86
C 69,02 / M 53,73 / Y 34,51 / N 10,2
C 100 / M 90,98 / Y 32,55 / N 22,35
314
Capítulo 3
Desarrollo de la práctica:
Disuélvase 10 mg de cloranfenicol en una mezcla de
1 mg de alcohol diluido y 3 ml de solución reactivo
de CaCl2 al 10 %. Adicionar 50 mg de Zn en polvo y
calentar en baño María por 10 minutos. Descartar el
líquido transparente en un tubo de ensayo y agregar
100 mg de acetato de sodio anhidro y 11 gotas de
cloruro de benzoilo. Agítese la mezcla por 1 minuto,
agréguese 0.5 ml de solución reactivo de FeCl3 y HCl
diluido hasta producir una solución transparente, se
obtendrá un color rojo violado púrpura.
315
Capítulo 3
Los productos lácteos son aquellos del grupo de alimentos que incluyen
la leche, así como sus derivados procesados (generalmente fermentados).
Las plantas industriales que producen estos alimentos pertenecen a la
industria láctea y se caracterizan por la manipulación de un producto
altamente perecedero, como es la leche, que debe vigilarse y analizarse
correctamente durante todos los pasos de la cadena de frío hasta su
llegada al consumidor.
Los productos lácteos que se elaboran utilizan leche en la industria, utilizan leche de vaca, principalmente de la raza Holstein, aunque también se utiliza leche
de cabra o de oveja; en algunos países se llega a utilizar la leche de búfala, la
de camella y hasta la de la yegua.
Los productos lácteos se conocen desde hace varios milenios; es muy posible
que estén unidos al consumo humano desde los tiempos de las antiguas tribus
nómadas del neolítico; el ser humano logró la domesticación de cabras y ovejas probablemente hace casi unos 9.000 años en las zonas del Mediterráneo
Oriental, aunque no existen registros de consumos lácteos desde hace unos
mil años, luego de tal domesticación: hace 8.500 años puede suponerse la
insipiencia de producción láctea para consumo humano, aunque recién hace
7.000 años es que se datan importantes producciones de leche de vaca, cabra
y oveja en zonas como el noreste de Anatolia, debido a la gran disponibilidad
de leche procedente de los ganados que se desplazaban con la población. La
elaboración de ciertos lácteos como el queso se asocia en la cultura popular
con las costumbres culinarias de los pastores de ganado. Algunos autores
mencionan que el mismo puede haberse originado en la fermentación de la
leche que se almacenaba en las vasijas elaboradas con los estómagos de animales. Los productos lácteos y la leche se han desarrollado históricamente
en aquellas poblaciones, o razas humanas, que han evolucionado físicamente
para mantener en la edad adulta una mejor capacidad de digestión del principal azúcar de la leche: la lactosa. En los demás grupos humanos, la secreción
de la lactasa (una enzima esencial para esa digestión) se pierde tras la fase
de lactancia infantil, y por esta razón muchas culturas tienen una «aversión
culinaria» a la leche y sus derivados. Sólo en algunas partes de Asia o África
se consumen habitualmente productos lácteos; y su consumo más extendido
316
Capítulo 3
se centra en el norte de Europa y en las zonas del mundo
con presencia migratoria significativa de ese origen, como
Norteamérica, Argentina y Australia. Se ha estimado que
casi un 96% de los europeos del norte son capaces de
digerir la lactosa; entre un 50% y un 75% de los africanos,
indios, habitantes de Oriente Medio y europeos del este;
mientras que casi todos los nativos americanos y asiáticos
son incapaces de digerirla.
El desarrollo de los productos lácteos se considera como
uno de los principales logros de la humanidad. El problema
de la digestión de la lactosa, en algunas personas se resuelve al transformarse en un derivado lácteo mejor digerible.
Las razones evolutivas aducidas están ligadas al equilibrio
con otro nutriente esencial que, como la lactosa, ayuda a la
absorción del calcio: la vitamina D, que se puede sintetizar
por el organismo en presencia de luz solar. Los pueblos
ganaderos del norte de Europa, con un débil sol que nunca
se alza mucho sobre el horizonte, vivían la mayor parte del
año bajo cielos cubiertos y protegidos por ropa que les
tapaba casi por completo la piel, además de no acceder
fácilmente a otras fuentes de calcio (verduras, por ejemplo). Verían comprometido su desarrollo si no accedieran
al calcio aportado por la leche líquida junto con la lactosa
(la cual desempeña el papel que en otras latitudes cumple una abundante vitamina D sintetizada gracias a la luz
solar). Por el contrario, pueblos secularmente dedicados
a la ganadería, como judíos, árabes, griegos, sudaneses y
culturas del Asia Meridional, que presentan altos índices de
intolerancia a la lactosa, desarrollaron tradicionalmente la
elaboración y consumo de productos lácteos fermentados,
en vez de la leche líquida sin fermentar.
317
Capítulo 3
El siglo XX es el período donde la leche
y los lácteos sufren una fuerte expansión
en su consumo a lo largo de todo el
planeta, las mejoras en los métodos
artificiales de ordeña, alimentación y
las mejoras en selección artificial de las
especies; los avances tecnológicos en los
procesos de transporte y refrigeración,
hicieron que se produjera la paradoja de la
«sobreproducción» (paradójico, ya que se
empezaba a extraer más leche con menos
vacas). Al mismo tiempo se empezaron a
abrir serios debates acerca de lo adecuado
de sus valores nutricionales aplicados a una
dieta sana.
CARACTERÍSTICAS
Las características físicas y químicas de los lácteos se testean en muchos casos
de forma similar que en la leche, es decir, se emplean por ejemplo lactómetros
para medir la densidad específica. No obstante la elaboración de los lácteos
es diferente según el proceso que se haya realizado; por ejemplo algunos de
ellos se han sometido a fermentación láctica (un ejemplo son los yogures);
otros por el contrario, sufren un proceso mecánico de concentración de su
contenido graso (mantequillas). A veces es posible un proceso combinado de
fermentación y maduración (quesos). Estos procesos cambian la composición
y la concentración inicial de ciertos macronutrientes y micronutrientes, dependiendo del lácteo en cuestión.
Contenido proteínico
Gran parte de los lácteos provienen del procesado de la leche de la vaca que está compuesta principalmente de agua
con un contenido aproximado de 4,8% de lactosa, 3,2%
de proteínas, 3,7% de grasas y un 0,19% de contenido no
proteínico, así como un 0,7% de cenizas. Las principales
familias de proteínas en la leche son las caseínas, las proteínas de los sueros de leche y las inmunoglobulinas.
Figura 18. Estructura química de la
lactosa.
Contenido graso
La leche de vaca, cabra, oveja y de otros animales, tiene un
contenido graso de lípidos formados por glóbulos microscópicos de 1 – 4 mµ, en forma de emulsión agua – aceite.
La mayoría de los lípidos lácteos son triglicéridos (97 – 98
%), el resto son:
Fosfolípidos 0.2 – 1 %
Esteroles libres 0.2 – 0.4 % y
Trazas de ácidos grasos.
318
Capítulo 3
Aproximadamente el 62% de de la grasa de la leche tiene
un 30 % de ácidos grasos mono-insaturados (ácido oleico),
4 % de ácidos graso poli-insaturados.
Los productos lácteos contienen colesterol y está relacionado con la concentración de ácidos grasos que contengan. Por ejemplo una mantequilla con 80 % de ácidos
grasos contiene 200 mg de colesterol por cada 100 g de
producto.
Carbohidratos y otros
La lactosa es el principal carbohidrato de la leche, con un
contenido del 5 %, es un disacárido formado de galactosa
y glucosa y proporciona un 30 % del contenido energético
de la leche. La lactosa no es soluble en agua y cuando la
leche se agria se convierte en ácido láctico.
La leche también contiene minerales, como el calcio, fósforo, magnesio, potasio y otros; y vitaminas, como la D,
esenciales para la alimentación humana.
Figura 19.
Mujer elaborando mantequilla
319
Capítulo 3
LÁCTEOS CON FERMENTACIÓN
Una de las propiedades de la leche es que invita a la propia preservación:
la propia leche tiene unos cultivos lácticos que permiten convertir sus azúcares en ácidos, permitiendo de esta forma que la leche pueda preservarse
durante períodos mayores. Este proceso hace que las propiedades de la leche cambien sustancialmente dando lugar a una nueva gama de productos:
productos fermentados de la leche gracias a la acción de las bacterias de
la familia Lactobacillales (bacterias del ácido láctico). Algunas poblaciones
como los escandinavos poseen una gran tradición en el uso de productos
lácteos fermentados. Por regla general se producen en la leche tres tipos
de fermentaciones: la primera es una fermentación láctica, donde mediante
las bacterias lácticas se consumen los azúcares de la leche; la segunda
ataca los albuminoides de la leche y la tercera se denomina fermentación
butírica y ataca a las grasas.
El yogur es leche con un grado medio de fermentación al igual que las cremas
de mantequilla como la crema agria, como la créme fraiche y el Smetana, muy
popular en los países eslavos. En algunos casos las bacterias empleadas
en la fermentación de la leche corresponden a los mesófilos denominados:
Lactococcus lactis subsp. lactis/cremoris/diacetilactis y la Leuconoctoc
cremoris, que trabajan a temperaturas dentro del rango de los 20°C–30 °C
durante periodos de tiempo entre las 16 y 20 horas. Todos los productos
lácteos contienen bacterias lácticas vivas, a menos que se haya procedido a su
pasteurización tras la fermentación.
320
Capítulo 3
YOGUR
Yoğurt es el término turco para la «leche» que ha sido fermentada hasta lograr
una forma final de masa semilíquida. El yogur permaneció desconocido en
gran parte de Europa hasta que el premio Nobel concedido al inmunólogo Ilya
Metchnikov (profesor del Instituto Pasteur de París que obtuvo el Premio Nobel
de Fisiología y Medicina en 1908) conectó la longevidad de algunas etnias en
países tales como Bulgaria, Rusia o Francia con el consumo de este lácteo. El
empleo del yogur está muy extendido en algunas gastronomías del Mediterráneo Oriental, donde se emplea como ingrediente principal de algunos platos
y bebidas muy populares (ayran). En la India se consume el Lassi, que es una
especie de yogur que se toma bebido. Una leyenda europea menciona que
el yogur (y el kéfir) nace en las laderas septentrionales del monte Elbrus en el
Cáucaso.
Uno de los productos lácteos fermentados que más se ha desarrollado es
el yogur, que desde mediados del siglo pasado se han producido diversas
combinaciones de yogur con fruta, en
este caso la fermentación se produce por bacterias acidófilas como el
Streptococcus thermophilus y el Lactobacillus delbrueckii bulgaris.
Figura 20. Yogur
Para fabricar el yogur se fermenta la
leche una temperatura de 30 a 43 °C
durante 2.5 a 20 horas. La selección
del cultivo define el tiempo de fermentación y el sabor del producto final.
Cuando se le agrega fruta al yogur,
esto se hace justo antes de empacar
el producto en una proporción es del
15 % en peso.
321
Capítulo 3
QUESO
El queso es el producto lácteo de mayor antigüedad en la historia de la humanidad, es producido de la fermentación cuajada de leche de vaca, cabra,
oveja, u otros mamíferos. El proceso consiste en cuajar la leche con cuajo o
con quimosina obtenida por biosíntesis, con una ligera acidificación y agregado
de cloruro de sodio.
La composición promedio del queso es:
35 – 55 % de agua.
10 – 40 % de proteína (caseína)
4 – 5 % de sales
La acidificación de la leche en el proceso de producción de queso se hace a
través de bacterias existentes en el líquido lácteo.
Figura 21. Queso
322
Capítulo 3
Algunas variantes de quesos frescos empleados como alimento lácteo
para untar son:
Queso cottage - Se denomina así al queso no madurado, bien sea
escaldado o no, de alta humedad en su interior, que posee textura blanda
o suave, algo granular o cremosa, preparado con leche descremada
coagulada con enzimas y/o por cultivos lácticos. Un ejemplo es la ricota
de origen italiano.
Queso crema - es un queso joven y blando que se prepara al unir el
cuajo seco del requesón con una mezcla cremosa de leche. A diferencia
del queso cottage es ligeramente dulce. El cuajo seco de requesón tiene
un contenido de materia grasa inferior al 0,5 %. Sin embargo, el requesón
deberá tener un contenido graso no menor del 4%. Un ejemplo de este
tipo de queso es el quark empleado en la cocina alemana.
OTROS PRODUCTOS LÁCTEOS FERMENTADOS
Dependiendo del cultivo de bacterias empleado en la fermentación láctica
se pueden obtener diferentes productos lácteos; algunos de los más
populares en las gastronomías de los Balcanes son el kumis y el kéfir
que emplean diversos cultivos de bacterias: Lactococcus, Leuconostoc,
Lactobacillus, el acetobacter y las levaduras que les proporcionan sabores
y aromas característicos. El kéfir es técnicamente una bebida espumosa
efervescente que por regla general se elabora a partir de leche entera
tratada térmicamente a temperatura de 95ºC. Posee en su cuerpo gránulos
gelatinosos de 2-15 mm de diámetro que están compuestos por una
mezcla de microorganismos agrupados. En Suecia, uno de los productos
lácteos más populares es el filmjölk, elaborado con cultivos mesófilos de
la Lactococcus lactis y Leuconostoc mesenteroides. Algunos productos
lácteos emplean leche de animales como el caballo, por ejemplo, la cocina
mongola, en la que fermentan la leche de caballo en una bebida que
recibe el nombre de airag.
Los lácteos probióticos son productos de leche fermentada con Lactobacillus
y Bifidobacterium, ambos presentes en la leche, pero algunas veces no se
desarrollan espontáneamente y debe estimular su producción, tal es caso del
Yakult, producto de origen japonés que se consume en todo el mundo.
323
Capítulo 3
Los alimentos prebióticos (favorecen el
crecimiento o actividad de la flora intestinal
en el colon) y los simbióticos, (mezcla de los
probióticos y de los prebióticos) se consideran
alimentos lácteos. Los prebióticos introducen
cultivos exógenos en el organismo y rara vez
son digeridos en el tracto superior del intestino,
debido en parte a la ausencia de enzimas
capaces de romper los enlaces de hidrógeno
de los monosacáridos y por esta forma actúan
como fibras digestivas que se digieren en el
colon.
INNOVACIÓN DE LOS PRODUCTOS LÁCTEOS FERMENTADOS
La reconocida aceptación de los productos lácteos los posiciona como instrumentos efectivos al apoyo de la salud y bienestar del consumidor. En particular,
las leches fermentadas han ayudado a mejor la salud intestinal, y su aceptación
y popularidad continúan en ascenso. Estas constituyen una herramienta excelente para explotar su potencial y posibilidades de innovación.
Las innovaciones actuales incluyen fórmulas nutritivas en combinación de
yogur con jugo de frutas (Smoothies), fórmulas reducidas en grasa o en carbohidratos, bebidas lácteas fermentadas fortificadas con calcio, probióticos,
extractos vegetales, adición de sabores exóticos, mezclas de sabores, empaques novedosos-convenientes y estrategias de segmentación de mercado. En
el futuro inmediato es importante considerar la fortificación con proteínas y
péptidos lácteos, los cuales poseen propiedades bioactivas como los reguladores del sistema inmunológico, reguladores del metabolismo, control de peso
y apetito, control de hipertensión y la promoción de la salud dental.
El reto para la industria de alimentos será el desarrollar productos lácteos
fermentados, más allá de su calidad nutricional, sabor, conveniencia, o inocuidad. Los nuevos productos deben promover la salud y el bienestar del
consumidor.
324
Capítulo 3
Actividad 19
Hacer unta tabla que contenga los cinco siguientes
productos: lácteos fermentados: leche fermentada, leche
búlgara, leche de acidófilos, yogur y kéfir, con sus
correspondientes microorganismos que lo producen y la
descripción del producto.
Práctica
C 27,06 / M 100 / Y 100 / N 27,84
C 19,61 / M 10,98 / Y 19,61 / N 0
C 44,71 / M 41,96 / Y 100 / N 16,86
C 69,02 / M 53,73 / Y 34,51 / N 10,2
325
Capítulo 3
Actividad 20
Tomando como base las necesidades del mercado y la
presión de la industria, indica los principales criterios de
innovación en la producción de productos fermentados
lácteos.
Práctica
C 27,06 / M 100 / Y 100 / N 27,84
C 19,61 / M 10,98 / Y 19,61 / N 0
C 44,71 / M 41,96 / Y 100 / N 16,86
326
C 69,02 / M 53,73 / Y 34,51 / N 10,2
Capítulo 3
Respuestas a las actividades
Actividad 1: a)
Figura 3. Efecto de la concentración del sustrato sobre la velocidad
específica de crecimiento de dos organismos A y B.
Gráfica del Efecto de la concentración del sustrato de un método de preservación.
sobre la velocidad específica de crecimiento de
dos organismos Ay B
En cultivo continuo el valor de µm está
determinado por la concentración de sustrato y
es igual en estado estacionario a la velocidad de
dilución (D). A valores de u = D < µz se tiene que
µA > µB y por lo tanto el organismo A podrá ser
seleccionado a pesar de que µmA < µmB (µz =
valor de µ a partir del cual µB > µA).
c).
El método de preservación utilizado en
los cultivos depende de sus características de
crecimiento en diferentes medios. Los cultivos,
en general, no son estudiados sistemáticamente
debido a la imposibilidad de determinar si se ha
tenido una alteración genética. En la mayoría
de los casos sólo se observan la pigmentación,
la morfología, las reacciones fermentativas, las
propiedades microscópicas, etc.
b).
a) Preservar la pureza genética del cultivo
sin pérdida de ninguna de sus propiedades
bioquímicas; b) preservar los niveles de su
productividad inicial; y c) lograr que el cultivo
pueda ser transportado y manejado con facilidad.
Esto puede ser un factor esencial en la selección
327
Capítulo 3
a) En este caso se puede establecer la siguiente
ecuación basada en la estequiometría:
0.585 C12 H22 012 + 3.205 02 + 0.61 NH3
C3,72 H6.11O1.95N0
(Sacarosa)
.61
+
3.30
C02
+
(Biomasa) +4.29 H 20 + 387 Kcal.
En la ecuación anterior se representa la
formación de 100 g de biomasa a partir de 200
g de sacarosa. En este caso no se han indicado
los elementos menores como el P. el S, y el
Mg, por eso es que la suma da 90.46 en lugar de
100. Esta es la demostración de que toda fuente
de carbono se puede emplear para obtener
biomasa y CO2.
b) La esterilización de gases y líquidos
fundamentalmente es llevada a cabo por
filtración mediante filtros absolutos o filtros
fibrosos.
Los filtros absolutos son de materiales
cerámicos, de vidrio o de metal sinterizado con
poros tan pequeños que la penetración de los
microorganismos no es posible.
Los filtros fibrosos no son absolutos y el material
filtrante puede ser lana de vidrio, amianto y
esteres de celulosa, siendo las fibras de un
diámetro variable de 0.5 a 15 micrones.
328
Capítulo 3
Respuestas a las actividades
Regulación de la síntesis de lisina en Corynebacterium
glutamicum
329
Capítulo 3
Respuestas a las actividades
Distintas penicilinas que pueden obtenerse en función
del precursor de la cadena lateral y a partir del
Penicillican chrysogenum.
330
Capítulo 3
Actividad 5
La producción de penicilina como otros procesos biotecnológicos está dominada
por su aspecto competitivo entre los grandes laboratorios productores, que
realizan permanentes esfuerzos de mejoramiento en cada área del proceso: cepa,
fermentación y separación. El proceso a grandes rasgos implica el cultivo de
Penicillican chrysogenum en reactores de volumen creciente hasta una escala de
500.000 l, separación del micelio por filtración y extracción del antibiótico del
caldo, seguida por la cristalización o precipitación ácida del mismo.
Las distintas penicilinas son producidas a partir de P. chrysogeizuin por adición de
una apropiada cadena carboxílica en cantidad adecuada en el medio de cultivo;
pero solamente tienen valor terapéutico la penicilina G y la V. Ambas tienen un
espectro y actividad similar, pero la penicilina V es más estable a pH ácido, lo
que permite su administración por vía oral.
Actividad 6
Los procedimientos en medios líquidos son en general largos y requieren gran
cantidad de material. La ventaja es que el proceso es controlado en condiciones
relativamente comparables a las de producción en relación a agitación y aeración.
El test en placas es más rápido, permite controlar un mayor número de colonias
con menor material, pero en condiciones que no reproducen la fermentación en
medio líquido. Se trata aquí de evaluar la cantidad de antibiótico excretado por una
colonia. Una variante consiste en cubrir la placa con un celofán estéril y agregar
sobre el mismo una capa de agar conteniendo el organismo indicador, incubando
luego la placa toda la noche. De esta forma, las colonias de los mutantes son
mantenidas libres de contaminación por el organismo sensible. En este caso el
tamaño de la zona de inhibición es controlado por el espesor de la capa.
331
Capítulo 3
Respuestas a las actividades
Actividad 7
Se requiere de un vector de expresión, el cual debe ser capaz de entrar y
replicarse dentro de ella. Un vector ideal debería ser pequeño, de fácil preparación
y replicación en la célula huésped, no generar productos tóxicos para la misma,
poseer uno o más marcadores (resistencia a drogas, etc.) para facilitar una rápida
y positiva selección y contener al menos un sitio donde se pueda integrar el ADN
extraño sin destruir una función esencial (replicación).
Actividad 8
Pueden ser ligadas, ya sea por el ADN ligasa del bacteriófago T4 si los extremos
son romos, o por la acción de la ligasa de E. coli, o de T4 si son cohesivos.
Actividad 9
1.Mantenimiento n Cultivo puro. (PUREZA)
2.Que esté viva (VIABILIDAD)
3.La cepa debe guardarse genéticamente estable. (ESTABILIDAD)
Actividad 10
Método de elección o de conservación a largo plazo
– Conservación por congelación
– Conservación por liofilización
Métodos Alternativos
– Conservación por transferencia periódica
– Conservación por suspensión en agua destilada o en agua de mar
estéril
Actividad 11
Recuento en cámara de Neubauer Es una cámara que se utiliza para contar
glóbulos y está diseñada de manera de contener una cantidad fija de líquido.
Consta de un cuadrado central de 1 mm de lado dividido en 25 cuadraditos. Cada
uno de ellos está, a su vez, dividido en 16 cuadrados.
Se coloca un cubreobjetos sobre la zona cuadriculada, apoyado sobre dos hombros
laterales, de manera que cuando hay un buen contacto entre ellos, queda una
distancia de 0.1 mm entre el cubreobjetos y la cámara. Esto determina que el
líquido quede contenido en un volumen de 0.1 mm3.
332
Capítulo 3
Actividad 12
1. El tanque debe diseñarse para que funcione asépticamente durante numerosos
días, así como para las operaciones de más larga duración.
2. Se debe proporcionar un sistema adecuado de aireación y agitación para cubrir
las necesidades metabólicas de los microorganismos.
3. El consumo de energía debe ser tan bajo como sea posible.
4. Debe tener un sistema para el control del pH.
5. El fermentador debe tener un sistema para la toma de muestras.
6. Debe existir un sistema para el control de la temperatura.
7. Las pérdidas por evaporación no deben ser excesivas.
8. El diseño del tanque debe ser tal que las operaciones laborales durante el
funcionamiento, recolección, limpieza y mantenimiento sean mínimas.
9. El tanque debe ser versátil para la aplicación de diversas modalidades de
procesos.
10. Las superficies internas del tanque deben ser lisas, utilizando, donde sea
posible, soldaduras.
11. La geometría del fermentador debe ser similar a otros tanques más pequeños
o mayores de la planta o a los de la planta piloto para poder reproducir procesos
en diferentes escalas.
12. Deben emplearse los materiales más baratos que proporcionen resultados
satisfactorios.
13. Debe existir un servicio adecuado de repuestos para el fermentador.
Actividad 13
Los fermentadores más ampliamente utilizados en el nivel industrial están provistos
de mecanismos de agitación, dispersión y aireación, así como de sistemas para el
control de la temperatura, pH y formación de espuma.
Actividad 14
Consiste en pasar el medio fresco a través de un biorreactor en el que por
diversas técnicas hemos inmovilizado células (o enzimas). En el biorreactor se
producen las transformaciones bioquímicas que deseamos y recuperamos el
producto transformado tras su paso por la columna. Con este sistema se eliminan
los problemas de desequilibrio (estabilidad) del sistema continuo clásico y además
el producto resultante está libre de células. Presenta el inconveniente de que no
todos los microorganismos pueden inmovilizarse.
333
Capítulo 3
Respuestas a las actividades
Actividad 15
MAQUINARIA Y EQUIPO.
A.
Equipo de fermentación:
Fermentadores continuos.
Equipo de disolución de la melaza
Tanque de almacenamiento del caldo.
Tanque medidor del caldo.
B.
Equipo de destilación:
Columna de la masa.
Columna del aldehido.
Refrigerador del producto.
Tanque de almacenamiento de polvo.
Refrigerador.
Máquina de entrega de residuos.
Tanque medidor de alcohol.
Columna del producto.
Columna de tratamiento.
Examinador de residuos.
Columna de aceite combustible.
Separador.
Columna para el producto refrigerado.
Precalentador de la masa.
Columna para el producto refrigerado.
Columna para el refrigerador de la base.
Columna para el refrigerador.
Columna para el refrigerador.
Sistema de entrega de los desechos de gas.
Columna para el refrigerador.
C. Equipos de servicio:
Caldera de vapor.
Bombas de alcohol.
Tanque de la masa.
Bomba de agua.
Panel eléctrico.
Filtros de alcohol.
D. Equipo automático:
334
Capítulo 3
Sistema de entrega automática.
Control automático de vapor.
Registrador de temperatura.
Controlador de flujo.
Regulador automático de la masa o mezcla.
E. Equipo de laboratorio:
Medidor de pH.
Microscopio.
Medidor de viscosidad.
Medidor de sacarosa.
Fotómetro eléctrico.
Medidor de atincado.
Refractómetro.
Actividad 16
La planta de alcohol etílico podría ser ubicada cerca de un suministro de caña de
azúcar y del mercado de alcohol etílico con buenas facilidades de transportación.
La mayor parte de la planta será ubicada en área abierta, pero el cliente podría
requerir una estructura de concreto reforzada para soportar aquellos servicios
ubicados en posiciones elevadas.
Actividad 17
Se deben tener en cuenta criterios como el sustrato necesario y los posibles
suplementos del mismo, la velocidad de crecimiento, productividad y rendimiento
del sustrato, el pH y la temperatura, la aireación, morfología del crecimiento en el
fermentador, seguridad y no patogenicidad, ausencia de productos tóxicos, facilidad
de recuperación de las proteínas de organismos unicelulares, la composición
proteica, el contenido de RNA (indeseable para la utilización humana)
Los hongos tienen la capacidad de degradar un amplio rango de productos
vegetales y son fáciles de recuperar por filtración, pero son difíciles de airear en
su morfología filamentosa que optimiza la velocidad de crecimiento de los mismos.
Por su parte las bacterias crecen muy rápidamente, pero exigen de refrigeración
en el fermentador. Las bacterias y levaduras son más fáciles de airear pero más
difíciles de recuperar que los hongos, exigiendo técnicas de sedimentación y
centrifugación. Además, aunque las bacterias tienen mayor contenido proteico que
los hongos, estos tienen un nivel mayor de RNA indeseable nutricionalmente.
335
Capítulo 3
Respuestas a las actividades
Actividad 18
El término se refiere a un complejo formado por varias
enzimas, presentes en diversas proporciones, capaces de
actuar sobre pectinas y sus derivados. El grupo incluye:
1. Pectin esterasa, que actúa para desesterificar pectinas,
removiendo los grupos metoxilo y produciendo ácido
péctico.
2. Enzimas despolimerizantes que actúan principalmente
sobre pectina, ácidos pépticos y protopectina.
Actividad 19
Productos con base en fermentación de la leche.
Productos fermentados de leche
PRODUCTO
Leche
fermentada
Leche búlgara
336
MICROORGANISMOS
Streptococcus sp.
Leuconostoc sp.
Lactobacillus
bulgaricus
Leche de
acidófilos
Lactobacillus
acidophilus
Yogurt
Streptococcus
thermophilus,
Lactobacillus
bulgaricus
Kefir
Streptococcus
lactis, Lactobacillus
bulgaricus, Levaduras
DESCRIPCIÓN
Fabricada con leche total o parcialmente
descremada y pasteurizada.
Leche fermentada con alta acidez y poco
aroma.
Leche fermentada por L. acidophilus. Esta
leche se usa por su valor benéfico al
tracto digestivo y mejora el estado de
salud.
Producto de leche con sólidos
concentrados por evaporación o por la
adición de sólidos de leche descremada.
Producto con consistencia de budín.
Leche fermentada conteniendo ácido
láctico y alcohol. Las bacterias lácticas
producen ácido láctico, las levaduras
producen alcohol.
Capítulo 3
Actividad 20
- La preferencia del mercado por alimentos
dulces ha sido determinante en la aceptación
de productos lácteos como bebidas edulcoradas
refrescantes y postres, y no sólo de alimentos con
valor nutrimental.
- La demanda por alimentos bajos en calorías
se aprovecha para diseñar productos reducidos
en grasa o en carbohidratos, dirigidos al apoyo
de programas de reducción de peso en personas
preocupadas por su figura.
- Las campañas de promoción y comercialización,
encaminadas a mejorar la imagen de estos
productos en el mercado y aumentar así sus
ventas.
La orientación de la publicidad y su mensaje
hacia las generaciones más jóvenes, quienes han
respondido en forma entusiasta.
La investigación y desarrollo tecnológico realizados
para lograr innovaciones en estos productos, puede
conducir a un importante aumento en su aceptación.
337
Capítulo 3
Autoevaluación
Fermentación de productos industriales
1. El ámbito de la Biotecnología microbiana
o Microbiología industrial se centra
principalmente en:
(a) La comercialización de cepas microbiana
(b) Las actividades útiles de los
microorganismos
(c) La alimentación de los microorganismos
(d) Los efectos perjudiciales de los
microorganismos
Actividad
2. ¿Cuál es la fuente más frecuente
de aislamiento de una cepa de interés
industrial?
(a) Aislamiento directo de fuentes naturales,
como agua, suelo, plantas y desechos.
(b) De cultivos desarrollados en el laboratorio.
(c) De microorganismos modificados
genéticamente.
(d) De enriquecimiento de cultivos mixtos,
buscando favorecer el crecimiento del
microorganismo deseado.
Práctica
3. ¿Cuál es la principal característica que
debe reunir la preparación de medios para
el desarrollo de procesos de fermentación.
(a) Bajos requerimientos de nutrientes.
(b) Que no requiera de micronutrientes o en
una cantidad muy pequeña.
(c) Que los nutrientes solo sean de origen
animal o vegetal.
(d) Que tenga factores de crecimiento
adecuados para asegurar una alta
productividad.
338
4. ¿Con qué finalidad se diseña un medio de
fermentación?
(a) Conocer los requerimientos nutricionales
de las cepas por utilizar en el proceso
fermentativo
(b) Determinar la disponibilidad real de los
componentes del medio de fermentación
(c) Determinar los componentes necesarios
para lograr el crecimiento de las cepas y la
formación de los productos por fabricar.
(d) Conocer los mecanismos bioquímicos que
regulan la formación de los productos de
fermentación.
5. ANÁLISIS DE UN CASO: se desea
desarrollar una levadura para la industria
vinícola y obtener 30 gramos de biomasa/
lt en un fermentador. Determina las
condiciones del medio de cultivo, su
formulación y optimización del proceso.
6. ¿Qué significa esterilización?
(a) Es la remoción o destrucción por cualquier
vía de organismos vivos que pueden causar
daño particular o infección.
(b) Es la exclusión continuada de
microorganismos contaminantes.
(c) Es la eliminación de toda forma de vida de
un medio o material, lo que se lleva a cabo
generalmente por medios físicos
(d) Es el proceso que se utiliza para la
destrucción de algunos de los microorganismos
posiblemente presentes en materiales sensibles
al calor como la leche y cerveza.
Capítulo 3
7. ¿Cuál es el primer aspecto para
considerar en el desarrollo de de un
proceso fermentativo?
(a) Determinación de la temperatura óptima
(b) Determinación del pH
(c) Determinación de la presión osmótica
(d) Selección de una cepa microbiana
apropiada
8. ¿En qué consiste la mutación inducida
de los microorganismos?
(a) La que ocurre cuando se produce una
división celular
(b) Es la mutación producida mediante el
empleo de un mutágeno
(c) Cuando el elemento mutagénico es
desconocido
(d) Es la mutación que ocurre
espontáneamente
9. ¿Qué son los metabolitos?
(a) Son elementos esenciales para la vida de
un microorganismo
(b) Son los nutrientes de los microorganismos
(c) Son los oligoelementos que requieren los
microorganismos en su alimentación
(d) Es el producto eliminado por la célula
debido a la permeabilidad de la membrana
celular
10. ¿Cuál de las siguientes opciones es un
metabolito secundario?
(a) Los aminoácidos
(b) Los antibióticos
(c) Las melazas
(d) Las vinazas
11. ¿Para qué se lleva a cabo la
conservación de cepas?
(a) Para su regulación gubernamental
(b) Para mantener la supervivencia de las
cepas sin alteración genética
(c) Para la manipulación de las cepas
(d) Para el desarrollo de las cepas
12. ¿Cuál de los siguientes factores no
afecta la velocidad de fermentación?
(a) La textura de las células
(b) La temperatura
(c) La concentración de las cepas
(d) La presencia de catalizadores
13. ¿Cuál es la función más específica de
las enzimas en los procesos fermentativos?
(a) Actúan como inhibidores de los procesos
fermentativos
(b) No tienen ninguna función específica en la
fermentación
(c) Cambia las reacciones de fermentación
(d) Aumenta la velocidad de fermentación
339
Capítulo 3
14. ¿En qué modo de operación de las
fermentaciones se introduce parte de la
materia prima por procesarse al principio del
proceso, luego se inocula la misma con el
microorganismo seleccionado comenzando el
proceso de la fermentación. Posteriormente se
adiciona el resto de la materia prima durante el
tiempo de la fermentación, utilizando un criterio
preestablecido para la razón de alimentación?
(a) Operación por lotes
(b) Operación continúa
(c) Operación semicontinua
(d) Operación Fed-Batch
15. ¿Cuál grupo de tres parámetros son
principalmente controlados en la operación de
los fermentadores?
(a) Temperatura, concentración del microorganismo
y tamaño del fermentador
(b) Temperatura, pH y concentración de oxígeno
disuelto
(c) Temperatura, densidad del caldo de fermentación
y pH
(d) Temperatura, diámetro del fermentador y
producción de CO2
16. En la fabricación de un producto para elegir si
se lleva a cabo por vía química o biotecnológica,
se toman en cuenta varios factores, entre ellos
¿cuál es el más importante?
(a) El tamaño del equipo
(b) El transporte de la materia prima
(c) El costo del proceso
(d) La temperatura de operación del proceso
340
Capítulo 3
17. En la producción de etanol ¿cuál es la
principal materia prima que se utiliza
mayoritariamente?
(a) El petróleo
(b) Las melazas (subproducto en la fabricación de
sacarosa)
(c) Los cereales
(d) Síntesis química
18. ¿Cuál de los ácidos orgánicos es el que se
produce en mayor cantidad por fermentación?
(a) El ácido cítrico
(b) El ácido glucónico
(c) El ácido acético
(d) El ácido málico
19. ¿Cuáles fueron las dos enzimas que se
produjeron primero?
(a) Renina y amilasa
(b) Proteasa y lipasas
(c) Isomerasa e invertasa
(d) Pectinasa y esterasa
20. ¿Qué son los antibióticos?
(a) Son microorganismos que curan enfermedades
microbianas
(b) Son cepas modificadas genéticamente para
combatir enfermedades virales y bactereanas
(c) Son extractos de plantas que curan diversas
enfermedades actuando como bacteriostáticas
y antifúngicas
(d) Son substancias químicas producidas por
organismos vivientes, en la mayoría de los casos,
capaces de inhibir los procesos bacterianos y
fúngicos
341
Capítulo 3
Respuestas a la autoevaluación
1. (b)
2. (a)
3. (d)
4. (c)
5. Para tener una biomasa de levadura de 30 gal/ se deberá formular un medio
de por lo menos con 60 g/lt de fuentes de carbono asimilable. Con respecto a la
fuente de nitrógeno, ésta debe estar en concentración tal como para satisfacer las
condiciones necesarias, como es 0.61 moles de NH3 o sea 10.37 g de amoníaco, lo
que representa 8.54 g de N2. Ya tenemos por lo tanto la cantidad de la otra fuente
fundamental a ser agregada. Del conocimiento de la composición centesimal de
otros componentes menores se pueden establecer así las cantidades por agregar.
Por otro lado, sabes que la levadura necesita para crecer algunas vitaminas
del grupo B como la biotina, tiamina, ácido pantoténico, etc. Esas vitaminas
deben estar por lo tanto presentes en el medio. Como el proceso de
producción de levadura es un proceso industrial que interesa desarrollar
con costos de producción mínimos, es conveniente estudiar las fuentes de
carbono, nitrógeno y de vitaminas y minerales más económicos y disponibles
que puedas encontrar. Surge así la elección lógica de las melazas de caña
de azúcar o de remolacha que reúnen la mayor parte de las condiciones.
Para evitar la formación de alcohol y maximizar la producción de biomasa
se debe implementar una alimentación programada utilizando melaza como
sustrato limitante, de lo cual resulta la elección de un sistema de lotes
alimentado para la producción.
Para llevar a cabo una optimización del medio de cultivo para el desarrollo
de la levadura deberán considerarse las situaciones siguientes:
1) No existencia de información respecto a coeficientes de rendimiento de
macro y microelementos para el cultivo de la levadura.
2) Existencia de limitaciones nutricionales
microelementos y factores de crecimiento.
342
ocultas,
especialmente
de
Capítulo 3
3) Uso de medios de cultivo conteniendo elementos en
exceso respecto de los requerimientos nutricionales de
la levadura en cuestión, que pueden causar inhibición
del crecimiento.
4) Ensayo de sustancias estimulantes, activadoras e
inhibidoras del crecimiento y formación del producto.
5) Empleo de fuentes nutricionales no convencionales.
6.(c)
7.(d)
8.(b)
9.(a)
10.(b)
11.(b)
12,-(a)
13.(d)
14.(d)
15.(b)
16.(c)
17(b)
18.(c)
19.(a)
20.(d)
343
Glosario
Glosario
Absorbancia: Cifra sin dimensiones que indica hasta qué punto absorbe una
sustancia la luz de una determinada longitud de onda lamda. Se define como el
logaritmo negativo de la fracción de luz de longitud de onda que pasa a través
de una muestra de solución. Su valor depende de la longitud del paso de luz, la
concentración de la solución y el coeficiente de extinción de la sustancia a esa
longitud de onda.
Acetilcolinesterasa: Enzima que se encuentra en la sinapsis colinérgicas y que
degrada a la acetilcolina, con lo que interrumpe la acción de esta sobre la célula
pos sináptica.
Ácido graso: Un ácido graso es una molécula orgánica de naturaleza lipídica
formada por una larga cadena hidrocarbonada lineal, de número par de átomos de
carbono, en cuyo extremo hay un grupo carboxilo. Cada átomo de carbono se une
al siguiente y al precedente por medio de un enlace covalente sencillo o doble. Al
átomo de su extremo le quedan libres tres enlaces que son ocupados por átomos de
hidrógeno (H3C-). Los demás átomos tienen libres dos enlaces, que son ocupados
igualmente por átomos de hidrógeno.
Ácido Láctico: El ácido láctico, o su forma ionizada, el lactato (del lat. lac, lactis,
leche), también conocido por su nomenclatura oficial ácido 2-hidroxi-propanoico o
ácido α-hidroxi-propanoico, es un compuesto químico que juega importantes roles
en diversos procesos bioquímicos, como la fermentación láctica.
Ácido: Un ácido es cualquier sustancia que en disolución acuosa aporta iones H+
al medio.
Ácidos biliares: Una familia de derivados anfipáticos del colesterol que se producen
en el hígado y se excretan por la bilis; emulsifican las grasas en el intestino.
Ácidos grasos escenciales: Deben obtenerse de la dieta, puesto que no pueden
sintetizarse en el organismo. Como ejemplo cabe citar el ácido linoléico y el ácido
-linolénico.
345
Glosario
Acoplamiento quimoosmótico: Acoplamiento de una reacción química catalizada
por una enzima con el transporte de una sustancia a través de una membrana, a
favor o en contra de un gradiente de concentración. El ejemplo más destacado es
el acoplamiento de la síntesis del ATP con el movimiento de protones a través de
una membrana en respuesta a un gradiente protónico.
Adipocitos: células grasas; células que estan especializadas en el almacenamiento
de triacilgliceroles y en la liberación de éstos a la sangre en forma de ácidos grasos
y glicerol cuando es necesario.
Aldosa: monosacárido en el que el grupo carbonilo se encuentra al final de la
cadena y constituye, por tanto un grupo aldehido. Compárese con cetosa.
Alginato: Sal orgánica u organometálica derivada del ácido algínico.
Alostérico: relativo a las enzimas, un efecto que se produce sobre la actividad de
una parte de una enzima (como lugar activo) por la unión de un efector a una parte
diferente de la propia enzima.
Aminoácidos esenciales: aminoácidos que deben obtenerse de la dieta, ya que
no pueden sintetizarse en el organismo (al menos en cantidades suficientes).
Anabolismo: la suma de todos los procesos metabólicos mediante los cuales se
forman las biomoléculas complejas a partir de moléculas más sencillas. En general,
estos procesos consumen energía celular y no la producen.
Anaerobio: indica la ausencia de oxígeno o la ausencia de una necesidad de éste;
los procesos que han de producirse o pueden producirse sin oxígeno se denominan
procesos anaeróbicos.
Anfipático: respecto a una molécula la propiedad de tener partes hidrófobas y
partes hidrófilas. Generalmente un extremo o un lado de la molécula es hidrófilo y
el otro es hidrófobo.
Anticodón: triplete de nucleótidos de un ARNt que se une a un codón complementario
del ARNm durante la síntesis de proteínas, y de este modo interviene en la traducción
del codón en un aminoácido específico.
Antimetabolito: sustancia que es un análogo estructural de un metabolito normal
o que se parece al mismo, y que interfiere en la utilización del metabolito por la
célula.
346
Glosario
Antiporte: proceso de transporte de membrana que acopla el transporte de una
sustancia en una dirección a través de una membrana con el transporte de una
sustancia distinta en la otra dirección.
Apolipoproteínas: proteínas específicas que forman la fracción protéica de la
lipoproteínas; intervienen en las interacciones de las lipoproteínas con los tejidos.
ATP: El trifosfato de adenosina (ATP) o adenosín trifosfato es una molécula que
consta de un grupo reducido de enlaces ionicos en las composiciones genéticas
del ADN y ARN. Este enlace permite que se separen los enlaces glucocídicos que
forman parte de las proteinas empaquetadas y enviadas a los cloroplastos para
producir energía y llevar a cabo el metabolismo.
Beta oxidación: La beta oxidación (β-oxidación) es el principal proceso mediante
el cual los ácidos grasos, en la forma de moléculas acil-CoA, son oxidados en la
mitocondria para generar energía (ATP). La β-oxidación de ácidos grasos consta de
cuatro reacciones recurrentes.El resultado de dichas reacciones son unidades de
dos carbonos en forma de acetil-CoA, molécula que pueden ingresar en el ciclo de
Krebs, y coenzimas reducidos (NADH y FADH2) que pueden ingresar en la cadena
respiratoria.
Bicapa lipídica: estructura de membrana que puede formarse mediante moléculas
anfipáticas en un medio acuoso. Consiste en dos capas de moléculas distribuidas
de tal manera que los grupos de cabezas polares se colocan hacia el agua y las
colas no polares hacia el centro de la membrana. La estructura de las membranas
celulares es una bicapa lipídica.
Bicarbonato de sodio: El bicarbonato de sodio (también llamado bicarbonato
sódico o hidrogenocarbonato de sodio o carbonato ácido de sodio), es un compuesto
sólido cristalino de color blanco muy soluble en agua, con un ligero sabor alcalino
parecido al del carbonato de sodio, de fórmula NaHCO3. Se puede encontrar como
mineral en la naturaleza o se puede producir artificialmente.
Biocatálisis: Acción catalítica en un proceso llevada a cabo por medio de enzimas.
Biofábricas: Instalaciones industriales donde se llevan a cabo procesos
biotecnológicos.
Biogás: Gas natural obtenido por fermentación de plantas y desechos de animales.
347
Glosario
Biopolímero: Polímero obtenido de un proceso biotecnológico.
Biorreactores: Reactores biotecnológicos, equipos donde se llevan a cabo
reacciones biológicas.
Biorremediación: Solución a un problema ambiental por medios biotecnológicos.
Biosíntesis: Síntesis llevada a cabo por medios biotecnológicos.
Bombeo de protones: bombeo activo de protones a través de una membrana
celular para formar un gradiente protónico. Así por ejemplo la cadena de transporte
electrónico de las membranas mitocondrial interna y tilacoide incorporan bombas
de protones, que crean un gradiente protónico que activa las ATP sin tasas de esta
membrana.
Cadena de transporte de electrones: La cadena de transporte de electrones
es una serie de transportadores de electrones que se encuentran en la membrana
plasmática de bacterias, en la membrana interna mitocondrial o en las membranas
tilacoidales, que median reacciones bioquímicas que producen adenosina trifosfato
(ATP), que es el compuesto energético que utilizan los seres vivos.
Cadena de transporte electrónico: secuencia de transportadores electrónicos
con un potencial de reducción progresivamente menor en una célula que están
ligados, con los que los electrones pueden pasar de un transportador al siguiente.
La cadena captura parte de la energía liberada por el flujo de los electrones y lo
utiliza para impulsar la síntesis de ATP.
Cadena respiratoria: cadena de transporte electrónico que se utiliza durante la
respiración celular y que tiene al O2 como aceptor electrónico final.
Caloría: La definición oficial describe la caloría como: la cantidad de energía
necesaria para elevar la temperatura de un gramo de agua destilada de 14,5ºC
a 15,5 Grado Celsius a nivel del mar (una atmósfera de presión). Una kilocaloria
(abreviada como kcal) es igual a 1000 cal. Una kilocaloría es equivalente a 4.1858
kJ.
Catabolismo: la suma de todos los procesos metabólicos mediante los cuales las
moléculas complejas se degradan a otras más sencillas, y que incluye los procesos
mediante los cuales las moléculas se degradan para proporcionar energía celular.
348
Glosario
Célula: Una célula (del latín cellula, diminutivo de cella, hueco) es la unidad
morfológica y funcional de todo ser vivo. De hecho, la célula es el elemento de
menor tamaño que puede considerarse vivo.
Cetosa: monosacárido en el que el grupo carbonilo se encuentra dentro de la
cadena y constituye, por tanto un grupo cetona.
Ciclo de Cori: ciclo metabólico mediante el cual el lactato producido por los tejidos
que realizan la glucólisis anaeróa, como el músculo en ejercicio, se regenera a
glucosa en el hígado y vuelve a los tejidos a través del torrente sanguíneo.
Ciclo del ácido cítrico: (también llamado ciclo del ácido tricarboxílico o ciclo
de Krebs). Ciclo de reacciones que tienen lugar en la matriz mitocondrial y que
conlleva la oxidación de unidades acetilo a CO2 con la producción de equivalentes
reductores y ATP. Es una ruta central de la respiración oxidativa. Otros sustratos
además de la acetil CoA pueden incorporarse al ciclo en puntos intermedios.
Cistrón: la unidad más pequeña del ADN que debe estar intacta para codificar la
secuencia de aminoácidos de un polipéptido. Corresponde, pues, a la parte de
codificación de un gen, menos las secuencias 5’ y 3’ no traducidas, y los elementos
reguladores.
Citoplasma: El citoplasma es la parte del protoplasma(es un citoplasma más el
núcleo) que, en una célula eucariota, se encuentra entre el núcleo celular y la
membrana plasmática.1 2 Consiste en una emulsión coloidal muy fina de aspecto
granuloso, el citosol o hialoplasma, y en una diversidad de orgánulos celulares que
desempeñan diferentes funciones. Su función es albergar los orgánulos celulares
y contribuir al movimiento de los mismos. El citosol es la sede de muchos de los
procesos metabólicos que se dan en las células.
Coenzima: Los coenzimas son cofactores orgánicos no proteicos, termoestables,
que unidos a una apoenzima constituyen la holoenzima o forma catalíticamente
activa de la enzima. Tienen en general baja masa molecular (al menos comparada
con la apoenzima) y son claves en el mecanismo de catálisis, por ejemplo, aceptando
o donando electrones o grupos funcionales, que transportan de un enzima a otro.
Clon: grupo de células, organismos o secuencias de ADN que son genéticamente
idénticos, puesto que proceden todos de un único antecesor común.
349
Glosario
Código genético: código mediante el cual una secuencia de nucleótidos de una
molécula de ADN o ARN especifica la secuencia de aminoácidos de un polipéptido.
Está formado por codones de tres nucleótidos que especifican un determinado
aminoácido o indican al ribosoma que detenga la traducción y libere el polipéptido.
Codones de parada: codones del ARN que señalan a un ribosoma que detenga la
traducción de un ARNm y libere el polipéptido. En el código genético normal, estos
codones son: UAG, UGA y UAA.
Coenzima: una pequeña molécula orgánica que se une a una enzima y es esencial
para su actividad, pero no sufre una alteración permanente en la reacción. La mayor
parte de las coenzimas derivan metabólicamente de las vitaminas.
Constante de disociación: para un ácido la constante de equilibrio Ka de la
disociación del ácido en su base conjugada y un protón. Para un complejo de dos
biomoléculas, la constante de equilibrio Kd de la disociación en las moléculas
componentes.
Constante de velocidad: en relación con las reacciones químicas, una constante
que relaciona la velocidad de una reacción concreta con las concentraciones de
sustratos.
C-terminal: (también llamado carboxilo terminal). El extremo de una cadena
polipeptídica que contiene un grupo carboxilo sin reaccionar.
Cuerpos cetónicos: las sustancias acetoacetato, beta-hidroxibutirato y acetona,
que se producen a partir del exceso de acetil CoA en el hígado, cuando la velocidad
de -oxidación de los ácidos grasos en las mitocondrias del hígado supera a la
velocidad con la que se utiliza la acetil CoA en la generación de energía o la síntesis
de ácidos grasos.
Desnaturalización: en ácidos nucleicos o proteínas, la pérdida de estructura
terciaria y secundaria, de manera que el polímero se convierte en un ovillo aleatorio.
En el caso del ADN, este cambio comporta la separación de las dos hebras. La
desnaturalización puede inducirse por calentamiento y por determinados cambios
del entorno químico.
Diálisis: Proceso mediante el cual se añaden o se eliminan solutos de bajo peso
molecular de una disolución mediante la difusión a través de una membrana semi
permeable.
350
Glosario
Ecuación de Michaelis-Menten: ecuación que proporciona la velocidad de una
reacción catalizada enzimáticamente en función de las concentraciones de sustrato
y enzima, así como de dos constantes que son específicas para una determinada
combinación de enzima y sustrato: una constante de velocidad, kcat, para la
producción catalítica del producto cuando la enzima está saturada, y la constante
de Michaelis-Menten.
Electroforesis: Método para separar sustancias con carga eléctrica que se
encuentran en una mezcla. Se coloca una muestra de la mezcla sobre un medio de
soporte (un trozo de papel de filtro o un gel), al que se aplica un campo eléctrico.
Cada sustancia cargada migra hacia el cátodo o hacia el ánodo a una velocidad
que depende de su carga neta y de su interacción de fricción con el medio.
Endonucleasa de restricción: Enzimas que catalizan la ruptura de la doble hebra
de DNA en secuencias de bases específicas. En las bacterias se han encontrado
muchas endonucleasas de restricción con distintas especificidades de secuencia.
Estas endonucleasas se utilizan mucho en genética molecular.
Endonucleasa: Enzima que rompe una cadena de ácido nucleico en un enlace
fosfodiéster interno.
Energía interna (E): Energía contenida en un sistema. Para los fines de la bioquímica,
este término engloba todos los tipos de energía que pueden intercambiarse
mediante procesos químicos o físicos no nucleares, incluyendo la energía cinética
del movimiento y la vibración de los átomos y moléculas, así como la energía
almacenada en los enlaces y las interacciones no covalentes.
Energía libre (G): (también denominada energía libre de Gibbs). Magnitud
termodinámica (función de estado) que incluye la entalpía y la entropía: G = H
- TS, donde H es la entalpía, S es la entropía y T es la temperatura absoluta. El
cambio de energía libre (delta G) de un proceso, como una reacción química, tiene
en cuenta los cambios de entalpía y de entropía, e indica si el proceso estará
termodinámicamente favorecido a una temperatura dada.
Enlace de hidrógeno: Interacción de atracción entre el átomo de hidrógeno de un
grupo donador, como -OH o =NH, y un par de electrones no enlazantes de un grupo
aceptor, como O=C. El átomo del grupo donador, que incluye el hidrógeno, debe
ser claramente electronegativo para que la atracción sea importante.
351
Glosario
Enlace peptídico: Enlace que liga sucesivos aminoácidos para formar un péptido.
Consiste en un enlace amida entre el grupo alfa-carboxilo de un aminoácido y el
grupo alfa-amino del siguiente.
Enzima: En bioquímica, se llaman enzimas las sustancias de naturaleza proteica
que catalizan reacciones químicas, siempre que sea termodinámicamente posible
(si bien no pueden hacer que el proceso sea más termodinámicamente favorable).
En estas reacciones, las moléculas sobre las que actúa la enzima en el comienzo
del proceso son llamadas sustratos, y estas los convierten en diferentes moléculas,
los productos.
Espectrofotómetro: Instrumento que expone una muestra a una luz de longitudes
de onda definidas y mide la absorbancia. Distintos tipos de espectrofotómetros
actúan en distintos márgenes de longitud de onda, como el ultravioleta, el visible
y el infrarrojo.
Estructura cuaternaria: Para una proteína, el nivel de estructura que se obtiene
cuando varias cadenas polipeptídicas plegadas distintas (subunidades) se asocian
de una forma específica para producir una proteína completa.
Estructura primaria: Para un ácido nucleico o una proteína, la secuencia de bases
o de aminoácidos del polinucleótido o el polipéptido.
Estructura secundaria: Plegado local del armazón de un polímero lineal para
formar una estructura de repetición regular. Las formas B y Z de la hélice de DNA y
las estructuras de hélice alfa y lámina beta de los polipéptidos son ejemplos de ello.
Estructura terciaria: Estructura de plegado a gran escala en un polímero lineal
que es de un orden superior al de la estructura secundaria. Para las moléculas de
proteína y RNA, la estructura terciaria es la forma tridimensional específica en la
que se pliega toda la cadena.
Exón: Región de la secuencia codificante de un gen que se traduce a una proteína
(a diferencia de los intrones, que no se traducen). La denominación procede del
hecho de que los exones son las únicas partes de un transcrito de RNA que se
observan fuera del núcleo.
Factores de crecimiento: Péptidos mediadores que influyen en el crecimiento y/o
la diferenciación de las células; se diferencian de las hormonas de crecimiento en
que las producen muchos tejidos y tienen una acción local.
352
Glosario
Fad: El flavín adenín dinucleótido o dinucleótido de flavina-adenina es una molécula
compuesta por una unidad de riboflavina (vitamina B2), unida a un pirofosfato (P-P),
éste unido a una ribosa y ésta unida a una adenina. Por tanto, la molécula es en
realidad ADP unido a riboflavina; o también AMP unido al coenzima FMN.
Fermentaciones: Procesos en los que la energía celular se genera a partir de la
degradación de moléculas de nutrientes sin que haya un cambio neto del estado de
oxidación de los productos, en comparación con el de los reactivos; la fermentación
puede producirse en ausencia de oxígeno.
Fosforilación oxidativa: Fosforilación del ADP a ATP que tiene lugar en conjunción
con el tránsito de electrones por la cadena de transporte electrónico en la
membrana mitocondrial interna.
Fragmentos de Okazaky: Fragmentos discontinuos en los que se sintetiza
inicialmente la hebra retardada durante la replicación del DNA. Estos fragmentos
se unen posteriormente para formar una hebra contínua.
Glucólisis: La glucólisis (del griego glycos:azúcar y lysis:ruptura), es la vía metabólica
encargada de oxidar o fermentar la glucosa y así obtener energía para la célula.
Ésta consiste de 10 reacciones enzimáticas que convierten a la glucosa en dos
moléculas de piruvato, la cual es capaz de seguir otras vías metabólicas y así
continuar entregando energía al organismo.
Glucólisis: Ruta inicial del catabolismo de los hidratos de carbono, en la que una
molécula de glucosa se degrada a dos moléculas de piruvato, con la producción
neta de moléculas de ATP y la reducción de dos moléculas de NAD+ a NADH.
En condiciones aerobias, estas moléculas de NADH se reoxidan por la cadena
de transporte electrónico; en condiciones anaerobias, se utiliza un aceptor de
electrones diferente.
Gluconeogénesis: Es una ruta metabólica anabólica que permite la síntesis
de glucosa a partir de precursores no glucídicos (los cuales ni provienen ni son
glucosa). Está incluye la utilización de varios aminoácidos, lactato, piruvato, glicerol
y cualquiera de los intermediarios del Ciclo de los ácidos Tricarboxílicos (o Ciclo de
Krebs) como fuentes de carbono para la vía metabólica. Todos los aminoácidos,
excepto la leucina y lisina, pueden suministrar carbono para la síntesis neta de
glucosa.
353
Glosario
Gluconeogénesis: Procesos mediante los cuales se sintetiza glucosa a partir de
precursores que no son hidratos de carbono, como el glicerol, el lactato, algunos
aminoácidos y (en las plantas) acetil-CoA.
Grupo prostético: Un ión metálico o una molécula pequeña (distinta de un
aminoácido) que forma parte de una proteína en el estado nativo de la misma y
que es esencial para el funcionamiento proteico; su unión a la proteína puede ser
covalente o no covalente.
Helicasas: Enzimas que catalizan el desenrollamiento de los ácidos nucleicos de
doble cadena.
Hemivida (también llamada tiempo medio): Para una reacción química, el tiempo
necesario para que se haya consumido y transformado en producto la mitad de
sustrato. El término puede referirse también al tiempo análogo en otros procesos,
como la desintegración radiactica de un isótopo (período de semedesintegración).
Hemo: Molécula formada por un anillo de porfirina (protoporfirina IX o un derivado
de la misma) con un hierro central formando complejo. Actúa como grupo prostético
en proteínas como la mioglobina, la hemoglobina y los citocromos.
Hidratos de carbono: En general, sustancias que tienen la fórmula estequiométrica
(CH2O)n, donde n =>3, o que proceden de una sustancia de este tipo mediante la
adición de grupos funcionales.
Hidrófilo: Hace referencia a la capacidad de un átomo o una molécula de presentar
interacciones de atracción con las moléculas de agua. Las sustancias que son
iónicas o pueden participar en enlaces de hidrógeno son hidrófilas. Las sustancias
hidrófilas son solubles en el agua o, como mínimo, humedecibles.
Hidrófobo: La propiedad molecular de no presentar interacciones de atracción con
las moléculas de agua. Las sustancias hidrófobas son no iónicas y no polares; no
son humedecibles y no se disuelven con facilidad en el agua.
Hormona: Sustancia que se sintetiza y secreta por células especializadas, y se
transporta por la circulación a las células diana, en las que provoca modificaciones
específicas de la conducta metabólica de la célula al interactuar con un receptor
específico para la hormona.
Inducción: En el metabolismo de celular, la síntesis de una determinada proteína
en respuesta a una señal; así, por ejemplo, la síntesis de una enzima en respuesta
a la aparición de su sustrato.
354
Glosario
Inhibidor competitivo: Sustancia que inhibe una reacción catalizada por una
enzima compitiendo con el sustrato por el lugar activo. El inhibidor puede ocupar
reversiblemente el lugar activo pero no sufre la reacción.
Inhibidor no competitivo: Inhibidor de una reacción catalizada enzimáticamente,
que actúa uniéndose a un lugar de la enzima distinto del lugar activo y reduciendo
la eficiencia catalítica de la enzima.
Interacciones no covalentes: Todos los tipos de interacciones entre los átomos
y las moléculas que no implican compartir realmente electrones en un enlace
covalente. Incluyen las interacciones electrostáticas, las interacciones de dipolo
permanente e inducido, y los enlaces de hidrógeno.
Interferón: Compuestos químicos que se usan para la generación de anticuerpos
para combatir enfermedades de origen viral.
Intrón: Región de la secuencia codificante de un gen que no se traduce en proteína.
Los intrones son frecuentes en los genes eucariotas, pero son en cambio raros en
los procariotas. Se eliminan del transcrito de RNA antes de la traducción.
Isoenzimas (también denominadas isozimas): Formas diferentes, pero no
relacionadas, de una enzima que catalizan la misma reacción. A menudo difieren
tan sólo en unas pocas sustituciones de aminoácidos.
Ley de Beer: Ecuación que relaciona la observancia de la solución de una
muestra a una determinada longitud de onda, con la longitud del paso de la luz, la
concentración de la sustancia disuelta y el coeficiente de extinción de esa sustancia
a esa longitud de onda.
Ligando: En general, una molécula pequeña que se une de manera específica a
otra más grande; por ejemplo, una hormona que se une a un receptor. El término
puede utilizarse también para hacer referencia a una especie química que forma un
complejo de coordinación con un átomo central, que suele ser un átomo metálico.
Lípidos: Grupo de compuestos biológicos, químicamente diversos, que se clasifican
conjuntamente por su estructura, generalmente apolar, que hace que sean poco
solubles en el agua.
Lipoproteína de muy baja densidad (VLDL): Un tipo de partícula lipoproteica que
se forma en el hígado y actúa principalmente transportando triacilgliceroles desde
el hígado al tejido adiposo y otros tejidos.
355
Glosario
Lipoproteínas de alta densidad (HDL): Un tipo de partícula lipoproteica que actúa
principalmente eliminando el exceso de colesterol de las células de los tejidos y
transportándolo al hígado, donde puede excretarse en forma de ácidos biliares.
Lipoproteínas de baja densidad (LDL): Un tipo de partícula lipoproteica que
actúa principalmente distribuyendo el colesterol desde el hígado a otros tejidos. Su
componente proteico es una sola molécula de apoproteína B-100.
Lipoproteínas: Cualquier conjugado lípido-proteína. Se refiere específicamente
a las asociaciones lípido-proteína que transportan lípidos en la circulación. Cada
lipoproteína tiene un núcleo de de lípidos hidrófobo, rodeado por una envoltura
de lípidos anfipáticos con apolipoproteínas incluidas en ellos. Distintos tipos de
lipoproteínas desempeñan funciones diferentes en el transporte de lípidos.
Metabolismo intermediario: Todas las reacciones de un organismo que tienen
relación con el almacenamiento y la generación de energía metabólica, y con la
biosíntesis de compuestos de bajo peso molecular y compuestos de almacenamiento
de energía. No incluye la síntesis de ácidos nucleicos y de proteínas.
Metabolismo: El metabolismo es el conjunto de reacciones por la cuales se libera
la energía de los alimentos para que el organismo pueda utilizarlos y procesos
físico-químicos que ocurren en una célula.
Metabolismo: La totalidad de las reacciones químicas que se producen en un
organismo.
Metanogénicas: Proceso biotecnológico que produce metano por fermentación.
Micelas: Pequeñas gotas que se forman cuando una sustancia anfipática que tiene
un grupo de cabeza polar y un grupo de cola no polar (como un ácido graso) se
añade a un medio acuoso y se agita. Cada gota está formada por una acumulación
esférica de moléculas anfipáticas dispuestas con los grupos de cabeza polares
hacia fuera, en dirección al agua, y sus colas no polares enfrentadas hacia el centro.
Mitocondria: Las mitocondrias son orgánulos, presentes en prácticamente todas
las células eucariotas, encargados de suministrar la mayor parte de la energía
necesaria para la actividad celular; actúan por tanto, como centrales energéticas
de la célula y sintetizan ATP por medio de la fosforilación oxidativa.
Mutación: Cualquier cambio heredable de la secuencia de nucleótidos del DNA
genómico (o del RNA genómico en el caso de un virus RNA).
356
Glosario
Nad: La dinucleótido de nicotinamida adenina (NAD+) es una coenzima que
contiene la vitamina B3 y cuya función principal es el intercambio de electrones e
hidrogeniones en la producción de energía de todas las células.
N-terminal (también denominado amino terminal): El extremo de una cadena
polipeptídica que contiene un grupo amino sin reaccionar. Un ribosoma sintetiza
un polipéptico en la dirección que va del N-terminal al C-terminal.
Nucleótido: Una molécula que, tras su hidrólisis completa, da al menos 1 mol por
mol de una base púrica o pirimidínica, un azúcar y fosfato inorgánico.
Nucleótidos: Productos orgánicos obtenidos del núcleo de una célula.
Oncogén: Un gen que, en una versión mutada, puede facilitar la mutación de una
célula normal en cancerosa. Muchos oncogenes codifican proteínas que intervienen
en la recepción y transducción de las señales de factores de crecimiento.
Operador: Lugar del DNA al que se une una proteína represora para bloquear la
iniciación de la transcripción a partir de un promotor adyacente.
Operón: Un conjunto de genes estructurales procariotas contiguos que se
transcriben como una unidad, junto con los elementos reguladores adyacentes que
controlan su expresión.
Organelas: Compartimientos del citoplasma de las células eucariotas limitados por
membranas. Cada tipo de organela realiza un conjunto específico de funciones.
Son ejemplos de organelas las mitocondrias, los cloroplastos y los núcleos.
Oxidación: El oxidante es el elemento químico que tiende a captar esos electrones,
quedando con carga positiva menor a la que tenía.
PC: Fosfocreatina, también conocido como creatina fosfato o PCr, es una molécula
de creatina fosfolizada la cual es una importante almacenadora de energía en el
músculo esquelético.
Profago: Un genoma de fago inactivo que se encuentra en una célula bacteriana
y en sus descendientes. Está integrado en el cromosoma del huésped.
Promotor: Secuencia de DNA que puede unirse a la RNA polimerasa, dando lugar
a la iniciación de la transcripción.
357
Glosario
Proteasas: Enzimas que rompen los enlaces peptídicos de un polipéptido. Muchas
presentan especificidad para una determinada secuencia de aminoácidos.
Proteínas fibrosas: Proteínas de forma alargada, que se utilizan a menudo como
materiales estructurales de las células y los tejidos.
Proteínas globulares: Proteínas cuya forma tridimensional plegada es relativamente
compacta.
Quilomicrón: Tipo de lipoproteína que se produce en las vellosidades intestinales
y se utiliza para transportar lípidos de la dieta en la circulación.
Quiral: Respecto a una molécula u otro objeto, la propiedad de no ser superponible
a su imagen especular. Un átomo que hace a una molécula quiral, como un
carbono con cuatro sustituyentes diferentes, se denomina átomo quiral o centro
de quiralidad.
Reacción de primer orden: Reacción cuya velocidad depende de la primera
potencia de la concentración del reactivo.
Reacción de segundo orden: Una reacción en la que dos moléculas de reactivo
deben unirse para que se produzca la reacción. Se denomina de segundo orden
porque la velocidad de la reacción depende del cuadrado de la concentración
del reactivo (para dos moléculas del mismo reactivo) o del producto de las
concentraciones de dos reactivos (cuando los dos reactivos son diferentes).
Reacciones Redox: Las reacciones de reducción-oxidación (también conocido
como reacción redox) son las reacciones de transferencia de electrones. Esta
transferencia se produce entre un conjunto de elementos químicos, uno oxidante
y uno reductor (una forma reducida y una forma oxidada respectivamente). Para
que exista una reacción redox, en el sistema debe haber un elemento que ceda
electrones y otra que los acepte.
Receptor: Una proteína que se une de manera selectiva a una molécula específica
(como un mediador intercelular o un antígeno) e inicia una respuesta biológica.
Reducción: El reductor es aquel elemento químico que tiende a ceder electrones
de su estructura química al medio, quedando con una carga positiva mayor a la
que tenía.
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Glosario
Sistemas energéticos: Son las vías metabólicas por las que el organismo de nutre
de energía para su funcionamiento.
Respiración: En relación con el metabolismo energético, el proceso por el cual se
genera energía celular a través de la oxidación de moléculas de nutrientes con el
O2 como aceptor electrónico final. Este tipo de respiración se denomina también
respiración celular para diferenciarla de la respiración en el sentido de inspiración
y espiración de aire.
Traducción: Síntesis de un polipéptido dirigida por un mRNA de manera que la
secuencia de nucleótidos del mRNA se “traduce” en una secuencia de aminoácidos
de la proteína.
Transaminación: En la célula, la transferencia enzimática de un grupo amino de un
aminoácido a un cetoácido. El cetoácido se transforma en aminoácido y viceversa.
Transcripción: Síntesis de una molécula de RNA complementaria de una hebra de
DNA; la información codificada en la secuencia de bases del DNA se “transcribe”
pues a la versión de RNA del mismo código.
Transcriptasa inversa: Enzima que se encuentra en los retrovirus y que sintetiza
una molécula de ADN de doble hebra a partir de un ARN molde de una sola hebra.
Transportador de glucosa: Proteína de membrana que se encarga del transporte
de glucosa a través de la membrana celular. Los diferentes tejidos pueden tener
transportadores de glucosa con propiedades distintas.
Transporte activo: transporte de una sustancia a través de una membrana
biológica mediante un mecanismo que puede funcionar en contra de un gradiente
de concentración. Requiere siempre el gasto de energía celular.
Transporte facilitado: Movimiento de una sustancia a través de una membrana
biológica en respuesta a una concentración o gradiente electroquímico en que el
movimiento está facilitado por poros de la membrana o por proteínas de transporte
específicas.
Transporte pasivo: En relación con el transporte a través de membranas, el
movimiento de una molécula a través de una membrana biológica mediante
difusión molecular a través de la bicapa lipídica.
359
Glosario
Ultrafiltración: Técnica de filtrado de una solución bajo presión a través de una
membrana semipermeable, que permite el paso del agua y pequeños solutos a
través de la misma, pero retiene las macromoléculas.
Virus: entidades infecciosas que contienen ácidos nucléicos para codificar su
propia estructura pero que carecen de la maquinaria enzimática de una célula; se
replican invadiendo una célula y utilizando su maquinaria para expresar el genoma
viral. La mayor parte de los virus contienen poco más que el ácido nucleico
encerrado en una cubierta protéica; algunos virus tienen también una envoltura
externa de doble capa lipídica.
Xantano: Género de substancias químicas derivadas de alcoholes heterocíclicos y
se caracterizan por ser de color amarillo.
Z-ADN: Una doble cadena de ADN con una estructura helicoidal, a izquierdas,
específica. In vitro, tiende a ser la forma más estable de dobles cadenas de ADN
que tienen purinas y pirimidinas alternadas, especialmente en condiciones de
metilación de la citosina o superenrrollamiento negativo.
360
Bibliografía
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Créditos
Colegio Nacional de Educación Profesional
Técnica Dirección de Desarrollo Curricular de
la Formación Básica y Regional
Lic. Tomás Pérez Alvarado
Director
Servicios Académicos y Educativos S.C.
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Coordinadora Académica
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Experto en contenidos
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Pedagoga
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Coordinador de diseño
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Diseñador editorial
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Ilustradora
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