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Revista CENIC Ciencias Biológicas. 41, No. Especial, 2010
Hairy roots cultures of broccoli transformed with the human Papilloma virus L1 protein
Cultivo de raíces aéreas de brócoli transformadas con la proteína L1 del virus del
Papiloma humano
Juan Manuel Jiménez Antaño1, María del Carmen Montes Horcasitas1, Emma Gloria Ramos
Ramírez1, Armando Ariza Castolo2, Josefina Pérez Vargas3, Octavio Gómez Guzmán1, Graciano
Calva Calva1
1
Biotecnología y Bioingeniería, Centro de Investigación y de Estudios Avanzados del Instituto
Politécnico Nacional. Avenida Instituto Politécnico Nacional 2508, Colonia San Pedro
Zacatenco, México Distrito Federal. Código Postal 07360. Tel: 01 (55) 57473800 Ext. 4348.
gcalva@cinvestav.mx, egarcial@cinvestav.mx
2
Química, Centro de Investigación y de Estudios Avanzados del Instituto Politécnico Nacional.
Avenida Instituto Politécnico Nacional 2508, Colonia San Pedro Zacatenco, México Distrito
Federal. Código Postal 07360. Tel: 01 (55) 57473800 Ext. 3727
3
Tecnológico de Estudios Superiores de Ecatepec. División Ingeniería Bioquímica, Posgrado en
Ingeniería Bioquímica. Av. Tecnológico S/N. Colonia Valle de Anáhuac, Ecatepec de Morelos,
Estado de México, Código Postal 55210. Tel: 50002300
RESUMEN. El cáncer cervicouterino está asociado a la infección del virus del papiloma humano
(HPV). La proteína L1es el componente principal de la cápside del HPV y forma partículas
semejantes a virus (VLP) altamente antigénicas. Existen vacunas a base de VLP pero los altos
costos han motivado la búsqueda de procesos de producción alternativa. Los cultivos de raíces
aéreas, biotecnología basada en plantas, ofrece una alternativa viable porque pueden
propagarse en biorreactores o regenerarse a plantas completas. En este trabajo presentamos
los resultados del uso de cultivos de raíces pilosas de brócoli que producen la proteína L1. El
gen l1 de HPV16 se clonó en el brócoli por medio de transformación mediada por
Agrobacterium rhizogenes. La transformación se demostró por PCR, reacciones de restricción y
ensayo de β-glucuronidasa. El análisis por reacciones de restricción y PCR del gen l1 en el
tejido radical y en el plásmido pCAMHPV16L1 construido a partir del pCAMBIA 1105.1 dieron
resultados positivos para la identidad del gen l1. Estos cultivos de raíces transformadas con el
gen l1 ofrecen una alternativa real para estudiar la producción de VLP útiles para preparar
vacunas profilácticas contra el HPV 16.
ABSTRACT. The cervical cancer is associated with the infection by the Human Papillomavirus
(HPV). The L1 protein is the main component of the HPV capsid, and form highly antigenic viruslike particles (VLPs). They are commercially available as VLP-based vaccine; however their high
cost has motivated to investigate for alternative production processes. Hairy roots cultures, a
plant based biotechnology, offer a viable alternative as they can be propagated in bioreactors or
regenerated to produce whole plants. In this work we present the results of use hairy roots of
broccoli to produce this L1 protein. The l1 gene from the HPV 16 was cloned in broccoli via
Agrobacterium rhizogenes transformation. The transformation was proved by PCR, restriction
reactions, and β-glucuronidase assays. The analysis of the radical tissue by restriction reactions
and PCR of the l1 gene in hairy roots, and in the pCAMHPV16L1 plasmid constructed from the
pCAMBIA 1105.1, drew positive results for the identity of the l1 gene. The root transformation
was also confirmed by morphological analysis of the tissue and These hairy roots cultures
1
transformed with the l1 gene offer a real alternative to study the production of VLP useful to
prepare prophylactic vaccines against the HPV 16.
Palabras clave: biotecnología vegetal, raíces transformadas, proteínas heterólogas, proteínas
terapéuticas.
Keywords: plant biotechnology, hairy roots, heterologous protein, therapeutic proteins.
INTRODUCCIÓN
El HPV causa 510 mil casos de cáncer cervicouterino al año.1,2 Las estrategias para tratar las
infecciones por HPV son las vacunas preventivas, que se obtienen gracias a las propiedades
antigénicas de la proteína L1,3 lo que ha permitido desarrollar vacunas comerciales a base de
partículas semejantes a virus (VLP) usando sistemas de expresión de levaduras y baculoviruscélulas de insecto.4,5 No obstante, el costo de producción mediante estos procesos es muy alto,
por lo que gran parte de la población afectada por este tipo de virus no tiene acceso al
producto.6 Esto hace necesario la búsqueda de procedimientos alternativos que disminuyan los
costos de producción y que hagan disponible las vacunas a personas de poblaciones con
menos recursos. La biotecnología vegetal, específicamente el cultivo de raíces transformadas
ofrecen esta posibilidad. Aunque actualmente los trabajos de producción de la proteína L1 de
forma heteróloga en sistemas vegetales han sido enfocados a la producción de plantas
completas y no se encuentran trabajos en los que se estudie su obtención por de cultivos de
raíces, se ha demostrado el potencial de esta biotecnología para la producción de metabolitos
como escopolamina, quinina, quinidina7 y de proteínas heterólogas como la acetilcolinesterasa.8
Así, en este trabajo se presentan los resultados sobre el establecimiento de cultivos de raíces
aéreas de brócoli transformadas con el gen de la proteína L1. Estas raíces se obtuvieron
mediante la transferencia del gen l1 a plántulas de brócoli empleando el método de
transformación mediado por Agrobacterium rhizogenes. Se espera que con estos resultados
estas raíces puedan posteriormente propagarse en biorreactores para proponer una alternativa
biotecnológica para la producción de vacunas contra el HPV. Alternativamente también pueden
regenerarse en plantas transgénicas para evaluar la posibilidad de utilizarse como vacunas
comestibles.
MATERIALES Y MÉTODOS
Caracterización por restricción del plásmido pCAMBIA 1105.1
Para asegurar que se trabajaba con el plásmido correcto y que sus sitios de restricción NcoI y
BglII estaban de forma adecuada se realizaron restricciones enzimáticas. Primeramente una
restricción con la enzima HindIII para obtener al plásmido linearizado y posteriormente una
doble restricción con las enzimas HindIII y NcoI y otra doble restricción con las enzimas XhoI y
NcoI. Después se realizaron restricciones dobles empleando la enzima BstEII con NcoI y BstEII
con BglII.
Obtención de las construcciones pCAMHPV16L1 y pCAMHPV16∆L1
El gen l1 se amplificó por PCR en un termociclador (Techne TC-312 USA) empleando dos pares
de iniciadores preparados: un par que amplifico al gen l1 completo (directo 5’TTGACCATGGATGC-AGGTGACTTTTATTTAC
y
reverso
5’GGTAAGATCTTTACAGCTTACGTTTTTTGCG) y otro par que amplifica al gen sin la secuencia
de localización nuclear y que inicia a partir del segundo ATG del gen l1 (directo 5’
TTGACCATGGATGTCTCTTTGGCTGCCTAGT,
reverso
5’GGTAAGATCTTCCTAATGTAAATTTTGGTTT). También se utilizaron iniciadores universales My09
5’-CGTCCMARRGGAWACTGAT y My11 5’-GCMCAGGGWCATAAYAATG los cuales se para
2
amplificar una región conservada de 450 pb dentro del gen l1. Estos últimos se emplearon bajo
las condiciones reportadas por Picconi, et al.9
Ligación del gen l1 al vector pCAMBIA 1105.1 para generar la construcción
pCAMHPV16L1
Se realizaron restricciones en pCAMBIA con las enzimas NcoI y BglII y después la ligación de
los productos cohesivos con el gen l1. Se utilizo una relación molecular 1:1 de DNA del vector
pCAMBIA 1105.1 y del gen l1 en una mezcla de ligación de volumen final de 20 µL empleando
buffer de ligasa a una concentración final de 1X, DNA plasmídico de pCAMBIA 1105.1 6.5 µg,
DNA gen l1 0.8 µg, Ligasa 200 unidades (New England Biolabs).10 Estos plásmidos se clonaron
en Agrobacterium rhizogenes por electroporación.
Material vegetal
Se usaron plántula de brócoli de 2-3 semanas de edad obtenidas por germinación de semillas
en medio de cultivo B5 (Gamborg et al., 1968). Para la germinación las cámaras de cultivo
fueron incubadas en un cuarto de cultivo con temperatura controlada entre 25 y 27 °C con
iluminación continua de 8400 lux.11
Inducción de raíces transformadas
Los hipocotilos de plántulas de 2-3 semanas de edad fueron punzadas con una aguja
hipodérmica previamente sumergida en una suspensión bacteriana de A. rhizogenes con 48
horas de crecimiento, un centímetro por debajo de los cotiledones. Los frascos con las plántulas
infectadas fueron incubados a 25-27 °C con iluminac ión constante de 5400-8400 lux por
aproximadamente 15 días o hasta la aparición de raíces pilosas en el punto de punción. Algunas
plántulas fueron punzadas con agua estéril como controles.
Establecimiento de cultivos de raíces transformadas y no transformadas
Las raíces no transformadas fueron extraídas a partir de plántulas no infectadas de 15 días de
edad y crecidas en matraces con 25 ml de medio SH (Shenck & Hildebrandt 1972) con 30 g/L
de sacarosa. Las raíces aéreas emergidas de los puntos de punción en plántulas infectadas con
Agrobacterium fueron cortadas junto con un fragmento del hipocotilo al alcanzar 2-3 cm de
longitud y puestas en placas de petri con medio SH adicionado con cefatoxima (400 µg/ml).
Cuando estas raíces alcanzaron 10 cm de longitud se depositaron en matraces con medio SH
líquido adicionado con el mismo antibiótico. Las raíces transformadas se mantienen en medio
líquido adicionado con 400 µg/mL de higromicina y por subcultivos periódicos de 15-20 dias.
Ensayo de β-glucuronidasa
Se realizaron cortes de aproximadamente 1 cm de los cultivos de raíces transformadas.
También se obtuvieron cortes de raíces no transformadas y raíces transformadas con A.
rhizogenes silvestre sin los plásmidos. Los cortes de raíces se colocan en tubos eppendorf de
600 µl conteniendo 250 µl de solución de teñido GUS (100 mM de fosfato de sodio pH 7, 10mM
EDTA pH 8, 0.1% Triton X-100, 2 mM X-Gluc). Los tubos abiertos se colocaron en un desecador
al vacío por 10 min enseguida se liberó lentamente el vacío y se repitió el proceso 2 veces más.
Después de los ciclos de infiltración, los tubos se incubaron por 10 horas a 37°C. La presencia
de actividad de GUS se evaluó mediante la observación al microscopio de coloración azul en el
tejido.12
PARTE EXPERIMENTAL
Se dividió en tres etapas, en la primera etapa de la metodología se llevó a cabo la amplificación
y posterior purificación del gen l1 a partir de la construcción p16L1 Este gen se utilizo para
obtener la construcción pCAMHPV16L1 ligando el gen l1 al vector pCAMBIA 1105.1.
3
Posteriormente se establecieron cultivos de raíces no transformadas de brócoli y cultivos de
raíces transformadas con la cepa A. rhizogenes silvestre y cultivos de raíces transformadas con
A. rhizogenes con el plásmido pCAMBIA 1105.1. En la segunda etapa se llevó a cabo la
transformación de cepas de A. rhizogenes con la construcción pCAMHPV16L1 para inducir los
cultivos de raíces de brócoli transformadas con el gen la proteína L1. En esta etapa se
comprobó la transformación del genoma del brócoli con el gen l1 mediante ensayos de βglucuronidasa y PCR.
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Aislamiento y purificación del gen l1 completo y sin localización nuclear
El aislamiento y purificación del gen l1 se realizó mediante amplificación por PCR. Para ello se
diseñaron dos pares de iniciadores (Tabla 1), uno que amplifica al gen completo (OD1L1 y
OR1L1) y otro que amplifica a partir del segundo ATG y sin secuencia de localización nuclear
(OD2L1ATG2 y OR2L1NLS-), que de acuerdo a Maclean, et al.,13 puede aumentar la producción
de proteína además de facilitar la clonación en los vectores de transfección. Como control
positivo para verificar la presencia del gen l1 en el vector también se utilizaron los óligos
universales My que amplifican una secuencia conservada de 450 pb dentro del gen l1.9 En la
tabla 1 las letras en negrita resaltan los sitios de restricción de NcoI y BglII que en los productos
de PCR flanquean al gen l1 con y sin la secuencia de localización nuclear (NLS) según
corresponda. Los resultados de la amplificación se muestran en la figura 1, donde pueden
observarse claramente los fragmentos esperados de 1.6 kb para el gen completo y el de 1.4 kb
para el gen a partir del segundo ATG y sin la secuencia de localización nuclear (NLS-); además
del de 450 pb que corresponde a la secuencia conservada. De esta manera los fragmentos con
L1 quedaron listos para ser utilizados para la incorporación del DNA correspondiente al vector
pCAMBIA, el cual fue previamente caracterizado respecto a los sitios de restricción planeados
en la estrategia experimental del presente trabajo.
Caracterización del vector pCAMBIA 1105.1.
Experimentos previos para clonar DNA foráneo en pCAMBIA 1105.1 presentaron diversas
dificultades atribuidas a la identidad del plásmido. Debido a ello, una de las actividades
importares de este trabajo fue la caracterización de este plásmido como preludio para la
incorporación de los fragmentos de DNA con el gen l1 a este vector de transfección. Esta
caracterización se realizó por restricción simple con EcoRI y doble con diversas enzimas (Figura
2). La electroforesis de la reacción de la restricción simple (carril 2 en figura 2a) fue incompleta,
pero mostró la banda correspondiente al plásmido abierto en comparación con el vector sin
digerir (carril 1 en 2a). Las dobles restricciones con NcoI en combinación con HindIII, XhoI y
BstEII también produjeron los fragmentos esperados de 762, 1843 y 6139 pb respectivamente.
Este último corroborado con la doble restricción con BstEII y BglII (carril 2 figura 2b). Con estos
resultados se comprobó la identidad e integridad del plásmido pCAMBIA en los sitios NcoI y
BglII que fueron usados posteriormente para la incorporación de los fragmentos de DNA con el
gen l1 obtenidos en la sección anterior.
4
Tabla 1. Iniciadores diseñados para la amplificación del gen l1 con y sin la secuencia de
localización nuclear
OD1L1
OR1L1
OD2L1ATG2
OR2L1NLSMy09
My11
TTGACCATGGATGCAGGTGACTTTTATTTAC
GGTAAGATCTTTACAGCTTACGTTTTTTGCG
TTGACCATGGATGTCTCTTTGGCTGCCTAGT
GGTAAGATCTTCCTAATGTAAATTTTGGTTT
CGTCCMARRGGAWACTGAT
GCMCAGGGWCATAAYAATG
Los dos primeros pares de iniciadores amplifican para el gen l1 con y sin la secuencia de localización nuclear respectivamente,
mientras los My amplifican una región interna del mismo gen l1. Las letras en negritas indican los sitios de restricción para las
enzimas NcoI y BglII necesarias para la clonación posterior en pCAMBIA.
CARRIL:
MPM
1.
2.
3.
P16L1 + primer ODL1 y ORL1
P16L1 + primer OD2L1ATG2 y
OR2L1NLSP16L1 + primer My09 y My11
MPM.- Marcador 1Kb plus DNA Ladder.
Agarosa 1%, 100 V, 40 min
Fig. 1. Productos de PCR de pVAX1-L1 usando los iniciadores mostrados en la Tabla 1. Las
flechas indican los fragmentos esperados. En el carril 1 el gen l1 completo, en el 2 el gen l1 sin
NLS y en el carril 3 la región conservada del gen l1.
CARRIL
MPM
1.
2.
3.
4.
pCAMBIA 1105.1
pCAMBIA 1105.1
+ EcoRI
pCAMBIA 1105.1
+ HindIII y NcoI
pCAMBIA 1105.1
+ XhoI y NcoI
MPM.- Marcador 1 kb plus
DNA Ladder.
Agarosa 1.6% 100 v 25
minutos
CARRIL
MPM
pCAMBIA 1105.1
+BstEII y NcoI
pCAMBIA 1105.1 +
BstEII y BglII
MPM.- Marcador 2log DNA Ladder.
Agarosa 1% 100 v
25 minutos
a) pCAMBIA 1105.1 con diversas enzimas. Las
b) flechas
Fig. 2. Restricción simple y doble de
muestran los fragmentos esperados según la enzima de restricción.
5
Incorporación del gen l1 completo (pCAMHPV16L1) y sin localización nuclear
(pCAMHPV16∆L1) a pCAMBIA
El DNA del gen l1 completo y sin localización nuclear fue aislado y purificado con las enzimas
NcoI y BglII como se describió arriba y contenían los sitios cohesivos necesarios para ser
ligados en el vector pCAMBIA. En la figura 3 se presentan los resultados de estos productos de
ligación, señalados con flechas, del gen l1 completo (carril 2) y sin la secuencia de localización
nuclear (carril 3). Durante los experimentos de ligación se pudo observar también los productos
de la ligación gen l1-gen l1 (bandas de L1-L1 de 3200 pb en el carril 2); L1NLS-L1NLS de 2900
pb (carril 3); y la ligación vector- vector (carril 4). Estos resultados indican claramente que se
logró obtener las construcciones con el gen l1 completo (pCAMHPV16L1) y sin localización
nuclear (pCAMHPV16L1 NLS-) con el vector pCAMBIA.
CARRIL
MPM
1.
2.
3.
4.
pCAMBIA 1105.1
Ligación Gen completovector
Ligación NLS-vector
Ligación vector-vector
L1-L1
completo
L1-L1
NLS
MPM.- Marcador 1 kb plus
DNA Ladder.
L1
completo
L1 NLS
Agarosa 0.6% 120 v 1 hora
Fig. 3. Productos de la reacción de ligación del gen l1 completo (carril 2) y sin señal de
localización nuclear (carril 3) al vector pCAMBIA 1105.1 señalado en el carril 1. En el carril 4 se
muestra la ligación vector-vector como muestra de la eficiencia de la ligasa. Nótese la diferencia
entre el tamaño del fragmento vector-vector con los correspondientes a los productos vectorgen.
Clonación de pCAMHPV16L1 con el gen l1 en A. rhizogenes
Después de que la construcción pCAMHPV16L1 se amplificó en E. coli se prosiguió a la
clonación en Agrobacterium por electroporación. La presencia de la construcción en la bacteria
se comprobó por PCR amplificando el DNA del gen l1 a partir de DNA plasmídico extraído de
dos clonas de A. rhizogenes (Figura 4). Se puede observar que por PCR se amplificó
positivamente (banda de 1.6 kb) el gen l1 a partir del DNA de las dos clonas (carriles 1 y 2). El
carril 3 es un testigo positivo para el DNA de completo L1 y el carril 4 un testigo negativo que
consiste en el vector pCAMBIA 1105.1 vacío. Estos resultados aseguran que la construcción
pCAMHPV16L1 que lleva al gen l1 completo se ha clonado correctamente en A. rhizogenes y
podía usarse para la inducción de raíces transformadas con el gen l1 completo.
6
1
2
3
4
pCAMHPV16L1 clona 1
pCAMHPV16L1 clona 3
Testigo positivo p16L1
Negativo pCAMBIA
MPM.- Marcador 1 kb DNA
Ladder.
Agarosa 1% 100 v 40 minutos
Gen l1 1.6 kb
Fig. 4. Amplificación por PCR del gen l1 a partir del DNA plasmídico de A. rhizogenes transformada con la
construcción pCAMHPV16L1.
Inducción de cultivos de raíces transformadas con el gen l1
Se establecieron cultivos de raíces no transformadas a partir de plántulas de brócoli de 15 días
de edad y cultivos de raíces transformadas con Agrobacterium rhizogenes silvestre y
transformada con pCAMBIA 1105.1 y la construcción pCAMHPV16L1 que lleva al gen l1 completo
(Figura 5). En la figura se resalta el sitio de infección y se señala la raíz aérea emergente que se
transfiere posteriormente a medio con cefotaxima para eliminar la bacteria. En consistencia con
la literatura,12,14 las raíces transformadas mostraron ageotropía positiva en la plántula y en los
cultivos en placa. También mostraron abundante vellosidad y rápido crecimiento (ciclo de
resiembra de 7 días), contrario a las raíces no transformadas que en medio líquido fueron de
lento crecimiento (ciclo de resiembra 20-25 días). Vistas al microscopio (Figura 6), las raíces
transformadas son mucho más pilosas en comparación con las no transformadas.
Adicionalmente, como se esperaba, las raíces transformadas con el vector pCAMBIA o la
construcción pCAMHPV16L1 que llevan el gen gus, generalmente dieron resultados positivos de
coloración azul típica para la actividad de β–glucuronidasa. Esto por supuesto contrario a las
raíces no transformadas y las transformadas con la cepa silvestre de Agrobacterium.
Fig. 5. Esquema para del protocolo para el establecimiento de cultivos de raíces de Brócoli.
7
Comprobación de la presencia del gen l1 en raíces de brócoli
La presencia del gen l1 en las raíces transformadas con la construcción pCAMHPV16L1 que
lleva en el T-DNA el gen l1 completo, fue investigada mediante la actividad de β-glucuronidasa.
Debe tenerse en cuenta que el gen que codifica para esta enzima está localizado en el vector
pCAMBIA inmediatamente después del sitio donde se insertó el gen l1. Por ello la presencia de
actividad de esta enzima se considera evidencia suficiente para demostrar la presencia del gen
heterólogo en el tejido radical.
A
25X
100X
100X
B
Fig. 6. A, Microfotografías 25X y 100X después del ensayo de β–glucuronidasa de raíces no
transformadas (a) y transformadas negativamente con gen l1 del HPV (b), en comparación con
raíces transformadas con el vector pCAMBIA (c). B, Ensayo de β –glucuronidasa y morfología
microscópica de raíces de brócoli transformadas positivamente (b, c) con el gen de la proteína
l1 observadas al microscopio óptico a 100X.
La mayoría de las raíces que se indujeron por punción de hipocotilos de plántulas con la cepa
de A. rhizogenes transformadas con la construcción pCAMHPV16L1 murieron cuando se
pusieron en contacto con higromicina, que es el marcador de selección para raíces
transformadas con el vector pCAMBIA 1105.1. El ensayo de β-glucuronidasa, como se
esperaba, resultó negativo en comparación con raíces transformadas con el vector pCAMBIA
1105.1 vacío (Figura 6 A). Este resultado sugiere que estos tejidos habían sido transformado
solo con el T-DNA de A. rhizogenes silvestre,15 no con el T-DNA de pCAMBIA que lleva el gen l1
clonado. No obstante, después de seleccionar entre varias líneas transformadas con el gen l1,
se logró obtener tejido suficiente para investigar la presencia del gen heterólogo mediante el
ensayo de de β-glucuronidasa observándose la coloración típica en una de las dos líneas de
raíces probadas en concordancia con el control positivo de raíces transformadas con pCAMBIA
y en contraste con el control negativo de raíces no transformadas (Figura 6 B). Es interesante
notar que en la línea mostrada en la figura 6 Bb se observó intensa coloración azul en toda la
raíz, mientras que en la línea mostrada en la figura 6 Bc solo se observó coloración en algunas
8
de las vellosidades. Esto puede deberse a que la integración del T-DNA en el genoma vegetal
se haya dado en algún sitio de poca actividad metabólica, como ha sido reportado para otros
casos.16 De cualquier forma, con estos resultados se demuestra que es posible establecer
cultivos de raíces transformadas con el gen l1 de la proteína L1 del HPV.
CONCLUSIONES
Se establecieron cultivos de raíces transformadas con el gen de la proteína L1 positivas al
ensayo de β-glucuronidasa. Con fines de comparación y control, también se establecieron
cultivos de raíces no transformadas, de raíces transformadas con la cepa silvestre de A.
rhizogenes LBA9402, y con A. rhizogenes transformadas con el vector pCAMBIA 1105.1.
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