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II Jornada Genética Clínica para Médicos de Familia Bases moleculares y estudios genéticos María García-Barcina Unidad de Genética del H. Universitario de Basurto” Osakidetza Sede SVMFIC Valencia, 2 de octubre de 2014 Soporte de la información La información biológica está determinada por la secuencia de las bases en la molécula de ADN. El ADN no se encuentra libre en el núcleo. Siempre está enrollado alrededor del core de las histonas. El ADN muestra diferentes niveles de condensación Fibra nucleosómica 6x Solenoide 15x Eucromatina – heterocromatina hasta 350x Cromosoma metafásico 700x CROMOSOMAS: estructuras celulares en las que se localizan los genes. El lugar preciso de un cromosoma donde se localiza un gen es el LOCUS. Consisten de una larga molécula de DNA lineal altamente condensada y asociada a determinadas proteínas. Los cromosomas se pueden ver al microscopio durante el proceso de división celular (mitosis o meiosis), cuando su grado de condensación es mayor. El DNA asociado a proteínas que forma los cromosomas se denomina CROMATINA. Cromosomas homólogos Homocigosidad y heterocigosidad Un individuo es HOMOCIGOTO para un gen” cuando presenta dos alelos iguales en sus cromosomas homólogos. Un individuo es HETEROCIGOTO para un gen” cuando presenta dos alelos diferentes en sus cromosomas homólogos. Un ALELO es cada una de las formas distintas y alternativas que puede presentar un gen. Los organismos diploides, presentan dos alelos para cada gen (un alelo en cada uno de los cromosomas homólogos). Los dos alelos pueden ser iguales o diferentes. Par de cromosomas 1 de un individuo Gen Alelo “A” A a B B “B” Relaciones entre los alelos de un gen ALELO DOMINANTE: aquel cuyo efecto fenotípico se expresa en condiciones de heterocigosidad. Se representa con letra mayúscula. ALELO RECESIVO: aquel cuyo efecto fenotípico NO se expresa en condiciones de heterocigosidad. Se representa con letra minúscula. Hay otros tipos de relaciones entre alelos: dominancia parcial, codominancia, etc.. Organización del genoma 1. DNA de copia única o bajo número de copias DNA codificante Codificante de proteínas Codificante de RNA: rRNA, tRNA, snRNA, snoRNA, microRNA DNA no codificante Intrones, UTRs, Pseudogenes 2. DNA repetitivo Repeticiones en tándem: minisatélites, microsatélites, telómeros, centrómeros Secuencias repetitivas intercaladas Secuencias de DNA en un cromosoma Estructura del gen “Un gen es una unidad hereditaria formada por una secuencia de DNA que ocupa un lugar específico en un cromosoma y sirve para la síntesis de RNA”. DNA genómico y codificante Base molecular de las enfermedades genéticas •Enfermedades cromosómicas •Enfermedades monogénicas o mendelianas •Enfermedades multifactoriales I.- Alteraciones cromosómicas Citogenética y citogenética molecular • Es el estudio de los cromosomas al microscopio. • Los cromosomas genético. • Cambios en el número y estructura de los cromosomas están asociados a un gran espectro de síndromes. contienen material Cariotipo Hibridación in situ fluorescente-FISH 13; 21 18; X; Y Microdeleciones S. Williams 22q11 Strong Di George SHPRINTZEN Hibridación genómica comparada (CGH) •Es una técnica de análisis genético: •que detecta pérdidas o ganancias de regiones del genoma •Es una detección global: estudia toda el genoma a la vez, sin selección, sin sesgos, sin sospechas •Resolucion es de 3 a 10 Megabases (30 a 100 genes) Array-CGH •Es un microarray de DNA genómico •Contiene fragmentos de diferente tamaño: • BACs (150 kb) • Oligos (60pb) • SNPs (25-40pb) -Diferente distribución: -Por todo el genoma -Parcial a una resolución definida -Específico log2ratio -0.5 -1 -1.5 -2 chromosome X position 10695074 10310777 9932586 9520390 9120006 8737577 8395933 8041903 7687640 7279221 6949872 6571612 6158728 5780910 5423073 5056453 4674128 4255421 3588423 3233859 2864502 1375885 Position Array-CGH 1.5 1 0.5 0 II.- Alteraciones monogénicas o mendelianas Mutación •Cambio permanente en el ADN. •No todas las mutaciones son patogénicas TIPOS DE MUTACIONES • Cambio de base o mutaciones puntuales • Deleciones / Inserciones • Inversiones / Duplicaciones • Expansión de trinucleótidos p.R345R p.R345P Tipos de mutaciónutación p.R345X Extracción de ADN PCR PCR-RFLP 1º) PCR 2º) Corte con enzima de restricción AME afectos PCR Digestión con DraI PCR a tiempo real La sonda con los dos fluorocromos se enlaza sólo si reconoce la región a estudio. El método no sirve para detectar mutaciones cuya posición se desconoce. PCR a tiempo real: Discriminación alélica PCR a tiempo real Screening PCR cuantitativa AME portadores Secuenciador de capilares • Secuenciación con capilar • La muestra electrocinetica se inyecta por inyección • Electroforesis continua • Detección en la ventana del capilar • Láser y cámara de detección por fluorescencia ABI PRISM 310 Genetic Analyser Secuenciación : Obtención de la secuencia base a base Acondroplasia (Gly380Arg) Noonan LEOPARD Costello Holt-Oram Síndrome de Marfan Miocardiopatía hipertrófica TnC TnI TnT Alfa-tropomiosina Actina Beta-miosina MyBPC Distonía de torsión DYT1 (delección de GAA) Análisis de fragmentos : Análisis del tamaño del amplificado obtenido por PCR con primers fluorescentes Ataxia de Friederich MLPA NHPP E01 E02 E03 E04 E05 E06 E07 E08 E09 E10 E11 E12 E13 E14 E15 E16 E17 E18 E19 E20 E21 E22 E23 E24 E25 E26 E27 E28 E29 E30 E31 E32 E33 E34 E35 E36 E37 E38 E39 E40 E41 E42 E43 E44 E45 E46 E47 E48 E49 E50 E51 E52 E53 E54 E55 E56 E57 E58 E59 E60 E61 E62 E63 E64 E65 E66 E67 E68 E69 E70 E71 E72 E73 E74 E75 E76 E77 E78 E79 V ALOR NORMALIZADO Distrofia muscular de Duchenne-Becker SD0006 2 1.5 1 0.5 0 EXONES GEN DMD AME portadores Afectado AME Portador E7 AME afectos PCR Digestión con DraI AME portadores NGS NGS Paneles dirigidos Exoma Metiloma Genoma completo con diferente cobertura Muchas gracias
