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INSTITUTO DE BIOTECNOLOGIA DE LAS PLANTAS
Obtención de plantas de banano cv. `Grande naine´ (Musa AAA) que
portan el gen de la proteína inhibidora de poligalacturonasa 2 de
Phaseolus vulgaris L.
Tesis presentada en opción al Título Académico de
Master en Biotecnología Vegetal
Autor: Lic. Mairenys Concepción Hernández
Tutores: Dr. C. Borys Chong Pérez
Dr. C. Rafael Gómez Kosky
Santa Clara, Cuba
2015
A mis padres
Agradezco a todas las personas que colaboraron en la realización de este trabajo y
especialmente a:
Borys por su ejemplo, enseñanzas y apoyo incondicional durante este período.
Maritza por la ayuda en todo momento más allá del compromiso profesional y por sus valiosos
consejos.
Kosky por su guía durante el transcurso de la tesis.
Mayelín por su disposición y compromiso con nuestro trabajo.
Los profesores del programa de maestría por compartir sus experiencias con nosotros.
Miladys y Naivys, por sus importantes comentarios durante la revisión del documento y sus
consejos profesionales.
Luis y Baby por toda la ayuda que me han brindado desde que comencé a trabajar en el lab.
Yudith, Novisel y Jorge por la asistencia en el procesamiento de los datos.
Mariana por estar dispuesta siempre a ayudar.
Marta por su atenta colaboración con los documentos.
Muchachas del cuarto de calor y área estéril por su organización y solidaridad en los momentos
más precarios.
Investigadores que contribuyeron al mejoramiento del trabajo durante los seminarios.
Colegas del CIGB Orlando e Ingrid, por su disposición a ayudarnos.
José Luis por facilitarme el trabajo a deshora y apoyarme siempre con una sonrisa.
Elizabeth y Adolfo por ser maravillosos compañeros de maestría.
Leo y Yanelis por su amistad y ayuda infinita, sin ustedes todo sería más difícil.
Finalmente, agradezco a mi familia por su amor y su apoyo, y en especial a Santiago, que ha
estado a mi lado en cada momento.
Índice General
1. INTRODUCCIÓN……………………………………………………………………………… 1
2. REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA………………………………………………………………… 4
2.1. Musa spp. …….……………….………………..…………………………………………
2.1.1. Importancia de los bananos y plátanos ………..……………….…………………
2.1.2. Taxonomía……………………………….…………………………………………...
2.1.3. Características del cultivar `Grande naine´………………………..………………
2.1.4. Limitaciones en la producción………………………...……..……………………..
2.2. Mejoramiento genético en Musa spp.……………………………………..…….……..
2.2.1. Factores que influyen en la eficiencia de la transformación genética mediada
por A. tumefaciens………………………………………………………………………………..
2.3. Genes empleados en la transformación genética contra enfermedades fúngicas
de Musa spp……………………………………………………………………………………….
2.3.1. Proteínas inhibidoras de poligalacturonasa …………………………………….
2.3.2. PvPGIP2………………………………………………………………………………
3. MATERIALES Y MÉTODOS……….……….………………………………………………..
3.1. Transformación genética de suspensiones celulares embriogénicas de banano
cv. ´Grande naine´ con el gen de la proteína inhibidora de poligalacturonasa 2 de
Phaseolus vulgaris L. ..………..........................................................................................
3.2. Chequeo de la presencia del inserto en las plantas obtenidas……………………..
3.2.1. Reacción en Cadena de la Polimerasa………….……………………..…………
3.3. Determinación del efecto del tiempo de inoculación y de la espermidina en la
eficiencia de transformación mediada por Agrobacterium tumefaciens en Musa cv.
`Grande naine´ (AAA)………………………….…………………………………………………
3.3.1. Determinación histoquímica de la β-glucuronidasa ………………………………
3.3.2. Análisis molecular de plantas regeneradas……………………………………….
4. RESULTADOS Y DISCUSIÓN……………………..…....................................................
4.1. Transformación de suspensiones celulares embriogénicas de banano cv.
´Grande naine´ con el gen de la proteína inhibidora de poligalacturonasa 2 de
Phaseolus vulgaris L.………..............................................................................................
4.2. Chequeo de la presencia del inserto en las plantas obtenidas……………………...
4.2.1. Reacción en Cadena de la Polimerasa….…….…........................................
4.3. Determinación del efecto del tiempo de inoculación y de la espermidina en la
eficiencia de transformación mediada por Agrobacterium tumefaciens en Musa cv.
`Grande naine´ (AAA)…………………………………………………………………………….
4.3.1. Análisis molecular de plantas regeneradas….……………………………………
5. CONCLUSIONES………………………………………………………………….......………
6. RECOMENDACIONES…………………………………………………………….......……..
7. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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RESUMEN
La incidencia de enfermedades fúngicas afecta gravemente el cultivo de bananos y plátanos a
escala global. En especial, el Mal de Panamá causado por Fusarium oxysporum f.sp. cubense y
la Sigatoka negra producida por Mycosphaerella fijiensis constituyen la principal amenaza para
el crecimiento de esta industria, que representa una importante fuente de ingresos y alimentos
para millones de personas. El desarrollo de variedades resistentes mediante la transformación
genética constituye una estrategia viable en el enfrentamiento a estas enfermedades. En este
sentido, el empleo de proteínas inhibidoras de poligalacturonasas (PGIP) resulta prometedor.
Estas moléculas inhiben las enzimas fúngicas durante el ataque y favorecen la inducción de
respuestas de defensa en las plantas. Con el objetivo de obtener plantas transgénicas de
banano cv. `Grande naine´ (Musa AAA) que portan el gen que codifica para la PvPGIP2 de
Phaseolus vulgaris L. se realizó la transformación genética mediada por Agrobacterium
tumefaciens de suspensiones celulares embriogénicas. Luego de la selección y regeneración,
se obtuvieron 81 líneas posiblemente transformadas con una eficiencia del proceso de 13,16
plantas/50 mg de células. La presencia del inserto fue analizada en 72 de estas líneas mediante
PCR de los genes PvPGIP2 y nptII, obteniéndose frecuencias de transformación de 94,4% y
88,9%, respectivamente. Se estudió además, la influencia del tiempo de inoculación y el uso de
la espermidina para aumentar la eficiencia de este protocolo. En efecto, mediante el aumento
del tiempo de inoculación con la bacteria a 24 h en combinación con el uso de espermidina
1mM, se logró obtener el mayor número de colonias después de transcurrido el período de
selección. Estos resultados permiten contar por primera vez con plantas de banano que portan
el gen PvPGIP2 para ser evaluadas en ensayos de resistencia a patógenos fúngicos.
Introducción
1. Introducción
Los plátanos y bananos se cultivan en 130 países de las regiones tropicales y subtropicales
del planeta y son un componente básico de la dieta de cerca de 400 millones de personas
(FAOSTAT, 2013). Anualmente se producen alrededor de 144 millones de toneladas, de las
cuales el 87% es obtenida en pequeñas parcelas y destinada al consumo familiar o la venta
en mercados locales (Roux et al., 2008).
El crecimiento de la producción está limitado por la existencia de numerosas enfermedades
y plagas que afectan a este cultivo, dentro de las cuales las causadas por patógenos
fúngicos son las de mayor importancia económica (Sowmya et al., 2014).
El Mal de Panamá, causado por Fusarium oxysporum L. f. sp. cubense (Foc)(Smith) Snyder
y Hanson, es la enfermedad históricamente más importante que afecta a este cultivo
(Stover, 1972; Hwang et al., 2004). Actualmente no existen métodos que permitan erradicar
esta enfermedad y su diseminación es difícil de controlar, pues el patógeno se puede
transportar fácilmente en el suelo infestado donde las esporas sobreviven por años (PérezVicente et al., 2014). Recientemente se detectó una nueva raza (TR4) que constituye una
seria amenaza para la producción actual de bananos y plátanos, la cual se basa en un 80%
de germoplasma susceptible (Swarupa et al., 2014).
Paralelamente, la Sigatoka negra causada por Mycosphaerella fijiensis Morelet (anamorfo
Pseudocercospora fijiensis (Morelet) Deighton) es considerada la enfermedad foliar más
destructiva y costosa de los cultivos de bananos y plátanos. Esta enfermedad es controlada
parcialmente mediante el empleo exhaustivo de fungicidas, los cuales provocan daños al
medio ambiente, la aparición de cepas resistentes y no constituyen una opción viable para
los pequeños productores (Churchill, 2011).
El desarrollo de variedades resistentes constituye la estrategia más viable y sostenible en el
enfrentamiento a estas devastadoras enfermedades (Marín et al., 2003). Sin embargo, el
empleo de las técnicas tradicionales de mejoramiento genético se ve limitado por los largos
1
Introducción
tiempos de regeneración, varios niveles de ploidía, esterilidad y limitada variabilidad
genética que caracterizan a las musáceas más importantes.
La transformación genética constituye una alternativa para superar las limitaciones
anteriores (Gelvin, 2003). En Musa spp. se han utilizado tres métodos para la transferencia
de genes: el bombardeo de partículas (Vishnevetsky et al., 2011), la electroporación de
protoplastos (Sági et al., 1994) y la transformación genética mediada por Agrobacterium
tumefaciens (Pérez-Hernández et al., 2006a), siendo este último el más empleado.
Actualmente, la mayoría de los protocolos desarrollados utilizan suspensiones celulares
embriogénicas, ya que disminuyen la probabilidad de obtener plantas quiméricas (ChongPérez et al., 2012a). Adicionalmente, la modificación de numerosos parámetros de
transformación ha permitido la obtención de protocolos más eficientes, que son necesarios
para las iniciativas de mejoramiento genético.
En este género, la transformación genética en Musa spp. se ha enfocado mayormente en la
búsqueda de resistencia o tolerancia a las enfermedades que afectan a este cultivo,
especialmente las causadas por hongos (Ortiz y Swennen, 2013). Sin embargo, no se
cuenta en la actualidad con variedades de bananos comerciales obtenidos por esta técnica
con resistencia a Mycosphaerella fijiensis o a Foc (TR4), por lo que la búsqueda de nuevos
genes y estrategias continúa.
Las proteínas inhibidoras de poligalacturonasas (PGIP) reconocen las poligalacturonasas
microbianas y de insectos e interfieren en la degradación de la pared de las células
vegetales durante el ataque del patógeno. Además, favorecen la acumulación de
oligogalacturónidos (OG), que activan diversas respuestas de defensa en las plantas, por lo
que se han empleado para la transformación genética de diferentes especies (Brutus et al.,
2010)
La proteína inhibidora de poligalacturonasa 2 de Phaseolus vulgaris L. (PvPGIP2) es el
inhibidor de poligalacturonasa (PG) más eficiente y de amplio espectro estudiado hasta
ahora (Kalunke et al., 2015). Al ser expresada en plantas transgénicas de tabaco, disminuyó
los síntomas provocados por Rhizoctonia solani (Kühn) y dos oomicetes (Phytophthora
2
Introducción
parasitica var. nicotianae (Breda de Haan) y Peronospora hyoscyami f. sp. tabacina
(Skalický)) (Borras-Hidalgo et al., 2012). En este estudio se emplearon condiciones de casa
de cultivo para R. solani y P. parasitica var. nicotianae mientras que se utilizaron
condiciones de campo para P. hyoscyami.
Tomando en consideración la importancia de las enfermedades fúngicas en Musa spp., la
disponibilidad de metodologías para la transformación genética y que no se ha referido el
empleo de PGIP con estos fines en este género, se propone la siguiente hipótesis:
Mediante la transformación genética mediada por Agrobacterium tumefaciens de
suspensiones celulares embriogénicas se podrán obtener plantas de banano cv.
´Grande naine´ (Musa AAA) que portan el gen de la proteína inhibidora de
poligalacturonasa 2 de Phaseolus vulgaris L.
Para analizar la misma se propusieron los siguientes objetivos de trabajo:
Objetivo general
Obtener plantas de banano cv. ´Grande naine´ (Musa AAA) que porten el gen del inhibidor
de poligalacturonasa 2 de Phaseolus vulgaris L.
Objetivos específicos
1. Transformar suspensiones celulares embriogénicas de banano cv. ´Grande naine´
con el gen de la proteína inhibidora de poligalacturonasa 2 de Phaseolus vulgaris L.
2. Verificar la presencia del inserto en las plantas obtenidas.
3. Determinar el efecto del tiempo de inoculación y de la espermidina en la eficiencia de
transformación mediada por Agrobacterium tumefaciens en Musa cv. `Grande naine´.
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Revisión Bibliográfica
2. REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA
2.1. Musa spp.
2.1.1. Importancia de los bananos y plátanos
Los plátanos y bananos se cultivan en 130 países de las regiones tropicales y subtropicales
del planeta y son un componente básico de la dieta de cerca de 400 millones de personas.
La producción anual estimada es de 144 592 009 toneladas (t) en 10 360 676 hectáreas (ha)
(FAOSTAT, 2013), por lo que se encuentran entre los 10 cultivos de mayor importancia
económica. Solo el 13% de la producción mundial es destinado a la exportación, mientras
que el 87% restante es realizado por pequeños productores y destinado al consumo familiar
o la venta en mercados locales (Roux et al., 2008).
En Cuba se producen anualmente un aproximado de 658 500 t de bananos y plátanos en un
área de 81 232 ha, que se destinan en su mayoría al consumo local (FAOSTAT, 2013).
2.1.2. Taxonomía
Los plátanos y bananos son plantas monocotiledóneas pertenecientes al orden Zingiberales
y a la familia Musaceae, la cual incluye los géneros Musa, Ensete y Musella. El género Musa
se divide, de acuerdo al número de cromosomas y las características morfológicas, en
cuatro secciones: Callimusa, Rhodochlamys, Australimusa, y Eumusa (Cheesman, 1947).
Argent (1976) propuso incluir una nueva sección llamada Ingentimusa, para clasificar las
especies de Musa con un número de cromosomas diferente.
Las especies comestibles pertenecen a las secciones Australimusa, y Eumusa, y se derivan
fundamentalmente de las especies salvajes diploides M. acuminata Colla (genoma A) y M.
balbisiana Colla (genoma B), originarias del sudeste asiático (Simmonds, 1962). La mayoría
de las variedades cultivadas en la actualidad son triploides (2n = 3x = 33), partenocárpicas y
estériles, con genomas formados por tres copias del genoma A (AAA) o mezclas de A con B
(AAB y ABB). Solo unos pocos cultivares son diploides o tetraploides (Ortiz y Swennen,
2013).
4
Revisión Bibliográfica
2.1.3. Características del cultivar `Grande naine´
El cultivar `Grande naine´ (AAA) (Musa acuminata subgrupo Cavendish) es el más
importante comercialmente a nivel mundial (ProMusa, 2014). Sus principales ventajas son:
la altura de la planta de 2,5 m, lo que favorece su manejo y disminuye el daño del viento,
presenta un índice de cosecha más alto que otros cultivares y el intervalo de emergenciafloración y floración-madurez fisiológica es de 196 y 122 días respectivamente, lo que hace
un ciclo completo de 318 días (Soto, 1985). Es resistente a las razas 1, 2 y 3 de Fusarium
oxysporum L. f. sp. cubense y susceptible a la Sigatoka negra (Mycosphaerella fijiensis
Morelet) y amarilla (M. musicola R. Leach (anamorfo P. musae (Zimm.) Deighton)), a la
enfermedad del moko (Ralstonia solanacearum (Smith)(Hayward, 2006)) y a la raza 4 de
Foc. En Cuba posee una alta aceptación como banano de postre. En general es un cultivar
de rendimientos altos.
2.1.4. Limitaciones en la producción
Los plátanos y bananos son susceptibles a un elevado número de plagas y enfermedades,
entre las que se destacan: el virus del cogollo racemoso en bananos (BBTV, del inglés:
Banana Bunchy Top Virus), el marchitamiento producido por la bacteria Xanthomonas
campestris pv. musacearum (Pammel) Dowson (Ploetz, 2004) y la enfermedad del moko.
Dentro de las plagas está la afectación por nemátodos barrenadores (Radopholus similis
(Cobb) Thorne) (Marín et al., 2003) y por el picudo negro Cosmopolites sordidus Germar
(Kiggundu et al., 2003).
Sin embargo, las enfermedades fúngicas causan los daños más significativos a la
producción actual de plátanos y bananos y constituyen la mayor amenaza para las
producciones futuras (Pérez-Vicente et al., 2014).
El Mal de Panamá, causado por F. oxysporum f. sp. cubense (Foc), es la enfermedad
históricamente más importante que afecta a este cultivo (Pérez-Vicente et al., 2014 ). El
hongo infecta las plantas a través de las raíces y coloniza los conductos xilemáticos,
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Revisión Bibliográfica
provocando el colapso de las hojas y finalmente la muerte. Las clamidosporas de Foc
pueden permanecer en el suelo hasta 30 años, impidiendo su uso para la plantación de
variedades susceptibles (Stover, 1962, 1972). Debido a esto, el desarrollo de la raza 1 de
Foc durante la primera mitad del siglo XX destruyó la industria bananera basada en el cv.
`Gros Michel´ (AAA), que tuvo que ser sustituido por cultivares resistentes del subgrupo
Cavendish. En la actualidad, estos últimos representan el 99% de las exportaciones a nivel
mundial (Stover, 1972; Pérez-Vicente et al., 2014).
El primer informe oficial en Cuba sobre la marchitez por Foc fue el de Smith (1910), sin
embargo, Johnston (1915) informó que el cv. `Gros Michel´ y el cv. `Manzano´ (subgrupo
Silk, AAB) se encontraban severamente afectados antes de 1910. A partir de la sustitución
del cv. `Gros Michel´ por otros del subgrupo Cavendish y el cultivo masivo de plátanos AAB,
la marchitez por Foc perdió su importancia económica en Cuba, y quedó confinada a las
pequeñas parcelas de agricultores y jardines de viviendas, donde se mantenía sobre plantas
de los genotipos Burro Criollo (`Bluggoe´, ABB) y Manzano (Pérez-Vicente, 2004).
La aparición en la década de los 90´ de la raza tropical 4 de Foc (TR4) ha provocado
cuantiosas pérdidas por la destrucción de plantaciones de Cavendish en el sudeste asiático
(Butler, 2013). Esta nueva raza constituye una seria amenaza para la producción actual de
bananos y plátanos, la cual se basa en un 80% de germoplasma susceptible (Swarupa et
al., 2014).
El control químico, saneamiento de suelos, rotación con cultivos no hospedantes, fungicidas
y agentes biológicos no han sido efectivos en el control de esta enfermedad y no son viables
para los pequeños productores (Ploetz et al., 1990, Pérez-Vicente et al., 2014). Debido a
esto, el desarrollo de resistencia en variedades élites mediante ingeniería genética
constituye la opción más prometedora.
La Sigatoka negra (SN) es la enfermedad foliar más importante que afecta los plátanos y
bananos. Este hongo forma parte del complejo Sigatoka, que también incluye a M. musicola
R. Leach (anamorfo P. musae (Zimm.) Deighton) el agente causal de la Sigatoka amarilla y
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Revisión Bibliográfica
M. eumusae Crous y Mour. (anamorfo P. eumusae), que produce la mancha foliar eumusae
(Churchill, 2011). La Sigatoka provoca necrosis de las hojas y aunque no causa la muerte
inmediata de las plantas, disminuye su capacidad fotosintética. Como resultado de esto, la
cantidad y calidad de los frutos se reduce y se induce la maduración prematura de los
mismos (Castelan et al., 2011).
La aparición de la SN en Cuba a finales de 1990 (Vidal, 1992) tuvo un fuerte impacto en los
costos de producción y en la estructura de los cultivares plantados en el país (Pérez et al.,
2003). Hasta hace poco solo se mantenía el 18% de las más de 43 000 ha de plátanos
(AAB) existentes en el año 1990. Los plátanos fueron sustituidos por el cultivo a gran escala
del cv. `Burro CEMSA´ (ABB), que ocupaba unas 63 000 ha y por el `FHIA 3´ (PérezVicente, 2004).
El control de la SN se realiza mediante el empleo de fungicidas de contacto y sistémicos. Se
estima que, en ausencia de fungicidas, las pérdidas debido a esta enfermedad constituyen
entre el 20-80% de la producción total, mientras que el costo aproximado de su uso en
grandes plantaciones es de USD $1000/ha, lo que representa cerca del 30% de los costos
totales de producción (Kema, 2006; Churchill, 2011). El empleo frecuente e intensivo de
fungicidas ha favorecido la aparición de cepas del patógeno resistentes, así como el
aumento de la preocupación pública por sus efectos dañinos sobre el ambiente y la salud.
Adicionalmente, esta estrategia es económicamente poco viable para los pequeños
productores, por lo que el manejo de esta enfermedad debe integrar el empleo de
variedades resistentes (Marín et al., 2003).
2.2. Mejoramiento genético en Musa spp.
La obtención de cultivares de bananos y plátanos resistentes a enfermedades se puede
lograr mediante las técnicas de mejoramiento genético convencional y la biotecnología. El
empleo de los métodos convencionales se ve limitado por los largos tiempos de
regeneración, varios niveles de ploidía, esterilidad y limitada variabilidad genética que
caracterizan a las musáceas más importantes. A pesar de esto, el Instituto Internacional de
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Revisión Bibliográfica
Agricultura Tropical (IITA) obtuvo diferentes híbridos de plátanos (Vuylsteke et al., 1993)
mientras que la FHIA desarrolló híbridos tetraploides con variación en la respuesta a SN
desde susceptible a moderadamente resistente (FHIA, 2007). Sin embargo, a 100 años del
comienzo del mejoramiento por cruzamientos en Musa spp., el empleo de estos híbridos
(mayormente plátanos) se limita a los pequeños productores de África sub-sahariana, Asia y
Latinoamérica, mientras que los bananos de exportación actuales son resultado de la
selección de mutaciones somáticas en el subgrupo Cavendish (Ortiz y Swennen, 2013).
La aplicación de las técnicas biotecnológicas permite superar las limitaciones que presenta
el mejoramiento genético clásico de bananos y plátanos. Estas incluyen el cultivo de tejidos,
cultivo de anteras, fusión de protoplastos, embriogénesis somática, mejoramiento genético
por mutación in vitro, variación somaclonal, selección in vitro, citometría de flujo de ADN
(ácido desoxirribonucleico),
marcadores moleculares
y la
transformación genética
(Arvanitoyannis et al., 2008).
La transformación genética permite la introducción de genes propios (cisgénesis) o no
propios de Musa (transgénesis) en cultivares de interés, cuando no existe variabilidad
natural para ese carácter o durante el mejoramiento de cultivares estériles (Schouten et al.,
2006; Ortiz y Swennen, 2013). A pesar de que existen pocos equipos de investigación
dedicados a la ingeniería genética en el género, desde su empleo por primera vez hace 20
años (May et al., 1995; Sági et al., 1995) se han obtenido resultados alentadores
(Chakrabarti et al., 2003; Yip et al., 2011; Pérez Hernández et al., 2006a).
La transferencia directa de genes por biolística se ha aplicado con éxito en algunos
cultivares de banano (Sági et al., 1995; Côte et al., 1997; Becker et al., 2000). Igualmente se
han
realizado
numerosos
avances
en
la
transformación
genética
mediada
por
Agrobacterium tumefaciens (Smith y Townsend) Conn, desde que se demostró la
compatibilidad entre la bacteria y varios tejidos de la planta durante las fases de quimiotaxia
y adhesión (Pérez-Hernández et al., 1999). Este método tiene como ventajas su simplicidad
y bajo costo, la inserción de un bajo número de copias del transgén y la capacidad de
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Revisión Bibliográfica
transferencia de segmentos grandes de ADN con baja ocurrencia de reordenamientos
(Gelvin, 2003). Debido a esto, es el más empleado en la transformación genética de Musa
spp. (May et al., 1995; Ganapathi et al., 2001; Arinaitwe et al., 2004; Khanna et al., 2004;
Remy et al., 2005; Pérez-Hernández et al., 2006a; Ghosh et al., 2009; Chong-Pérez et al.,
2012a,b). Actualmente la mayoría de los protocolos desarrollados para bananos utilizan
suspensiones celulares embriogénicas (SCE) (Ganapathi et al., 2001; Khanna et al., 2004;
Becker et al., 2000, Chong-Pérez et al., 2012a,b). Estos explantes son considerados ideales
debido a que los embriones somáticos formados pueden tener un origen unicelular o
pluricelular a partir de pocas células. Por lo tanto, la posibilidad de obtener plantas
quiméricas es baja (Grapin et al., 1996).
2.2.1. Factores que influyen en la eficiencia de la transformación genética mediada
por A. tumefaciens
Múltiples factores influyen en la transformación genética mediada por A. tumefaciens de
plantas monocotiledóneas. Entre estos se encuentran el genotipo de la planta, el tipo de
explante, los vectores binarios y la cepa de A. tumefaciens empleados, así como las
condiciones de inoculación y cocultivo (Opabode, 2006).
El primer protocolo de transformación genética vía A. tumefaciens de SCE, fue desarrollado
por Ganapathi et al., (2001) en el cultivar de banano Rasthali (Musa AAB). Desde entonces,
varios parámetros han sido modificados para aumentar la eficiencia de transformación: la
cepa de A. tumefaciens (Khanna et al., 2004, Pérez-Hernández et al., 2006a), la edad de las
SCE (Ganapathi et al., 2001; Arinaitwe et al., 2004), el tiempo de infección (Arinaitwe et al.,
2004), el tiempo de co-cultivo y densidad de células bacterianas (Khanna et al., 2004; PérezHernández et al., 2006a), la co-centrifugación de las células embriogénicas y bacterianas
(Khanna et al., 2004; Ghosh et al., 2009), el pretratamiento de las SCE con golpe térmico
(Khanna et al., 2004), empleo de medio de co-cultivo líquido o semisólido (Ghosh et al.,
2009), la utilización del surfactante Pluronio F68 (Khanna et al., 2004) y de acetosiringona
como inductor de los genes vir (Khanna et al., 2004; Pérez-Hernández et al., 2006a).
Adicionalmente, Khanna et al. (2007) obtuvieron un incremento de la eficiencia de un 100%
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Revisión Bibliográfica
al transformar SCE de Musa AAA y AAB con los genes antiapoptóticos de origen animal BclxL, Bcl-2 3´ y CED-9. Este sistema permitió obtener pruebas de la inducción de la muerte
celular programada por A. tumefaciens en Musa spp., sin embargo su aplicación se dificulta
por los posibles efectos tóxicos para los alimentos, asociados a la expresión de estos genes.
Además, estos autores emplearon kanamicina 50 mg l-1 como agente selectivo, mientras
que Pérez-Hernández et al. (2006a) refirió que las plantas de banano son resistentes a
concentraciones de este antiobiótico tan altas como 1 g l -1.
A pesar de estas modificaciones, la eficiencia de transformación obtenida en los protocolos
descritos hasta el momento oscila entre 10 a 65 plantas transgénicas por 50 mg de células
embriogénicas (Khanna et al., 2004; Pérez-Hernández et al., 2006a; Ghosh et al., 2009).
En 2005, Kumar y Rajam observaron que la adición exógena de las poliaminas espermina,
putrescina y espermidina inducía la expresión de los genes vir de A. tumefaciens y
aumentaba la transferencia del ADN-T en plantas de tabaco (Nicotiana tabacum L.),
obteniéndose los mejores resultados para la espermidina.
Esta molécula favorece también la multiplicación secundaria de los embriones somáticos en
Theobroma cacao L. durante la transformación genética mediada por A. tumefaciens (Petri
et al., 2005). Adicionalmente, Silva et al. (2009) observaron que su empleo, en combinación
con pulsos de auxina e inhibidores de etileno, favorece la regeneración de plantas de
Prunus armeniaca L. durante la transformación genética de segmentos de hojas.
En Musa, Arinaitwe (2008) estudió la influencia de la adición de espermidina durante la
formación de embriones, en la regeneración de plantas de los cv. `Williams´ (Musa AAA) y
`Three Hand Planty´ (ABB) a partir de SCE transformadas con A. tumefaciens. Los valores
obtenidos fueron dependientes del cultivar y de la concentración de poliamina utilizados.
Recientemente, Chong-Pérez et al. (2012b) lograron un incremento en la eficiencia de
transformación de SCE de Musa cv. `Dwarf Cavendish´ (AAA) mediante el empleo de
espermidina 1 mM y el aumento del tiempo de 30 min a 6 h durante la inoculación con la
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Revisión Bibliográfica
bacteria. En este estudio, la influencia de la espermidina sobre la expresión transitoria GUS,
el número de colonias embriogénicas y el número de plantas regeneradas, fue mayor que la
de los otros factores estudiados.
2.3. Genes empleados en la transformación genética contra enfermedades fúngicas de
Musa spp.
La transformación genética en Musa se ha enfocado mayormente en la búsqueda de
resistencia o tolerancia a las enfermedades que afectan a este cultivo, especialmente las
causadas por hongos (Ortiz y Swennen, 2013). En los últimos años se han obtenido plantas
transgénicas de banano que expresan péptidos antimicrobianos (PAM) y proteínas
antifúngicas (Tabla 1).
Los PAM poseen un amplio espectro de actividad contra hongos y bacterias y la mayoría no
son tóxicos para plantas y mamíferos. Chakrabarti et al., (2003), utilizaron el PAM MSI-99
para obtener plantas de banano cv. `Rasthali´ (Musa AAA) que mostraron resistencia a Foc
raza 2 en una evaluación primaria realizada en condiciones de casa de cultivo.
Las defensinas constituyen una de las familias más grandes de PAM en plantas. En el cv.
`Rasthali´, la expresión constitutiva de altos niveles de las defensinas florales de Petunia
PhDef1 y PhDef2 provocó una disminución de los síntomas con respecto al control durante
la infección de Foc raza 1 en ensayos in vitro y ex vivo (Ghag et al., 2012).
Dentro de las proteínas antifúngicas, las de tipo ferredoxina (pflp, del inglés plant ferredoxin
like protein) participan en los mecanismos de defensa mediados por respuesta hipersensible
a través de la producción de especies reactivas del oxígeno. En el cv. `Pei Chiao´ (AAA) la
introducción del gen pflp de pimiento (Capsicum annum L.) provocó una disminución de la
severidad de la enfermedad provocada por Foc RT4 (de 41,6% a 14,2%) en estudios en
casa de cultivo (Yip et al., 2011). El método de transformación escogido por estos autores
(brotes múltiples tipo coliflor-A. tumefaciens) incidió en la obtención de plantas mosaico, lo
cual dificulta el análisis en campo de las plantas transformadas.
Tabla 1. Genes empleados en la transformación de Musa spp. contra enfermedades
fúngicas.
11
Revisión Bibliográfica
Genes
Modo de acción
Desestabilización
de
las
membranas
celulares
Desestabilización
de
las
membranas
celulares
MSI-99
(Péptido
antimicrobiano)
PhDef1 PhDef2
(defensinas)
ThEn-42
(Endoquitinasa)
StSy
(estilbeno sintasa)
SOD
(superóxido
dismutasa)
Degradación de
la pared celular
fúngica
12
Cultivar
Sistema de
transformación
genética
Patógeno
Fase de
evaluación
Referencia
`Rasthali´
(AAB)
A. tumefaciens-SCE
Foc raza 2
M.
musicola
Casa
cultivo
Chakrabarti et
al., 2003
`Rasthali´
(AAB)
A. tumefaciens-SCE
Foc raza 1
in vitro
Casa
cultivo
`Grande
naine´ AAA
Bombardeo
partículas-SCE
de
Eliminación de
radicales libres
M.
fijiensis
Botrytis
cinerea
de
de
Campo
Ghag et al.,
2012
Vishnevetsky
et al., 2011
in vitro
Bcl-xL, Bcl-2 3´,
y CED-9
Inhibición de la
apoptosis
`Lady
Finger´
(AAB)
A. tumefaciensSCE
Foc raza 1
Casa
cultivo
de
Paul et
2011
Ace-AMP
(Péptido
antimicrobiano)
Altera integridad
de la membrana
`Rasthali´
(AAB)
A. tumefaciens SCE
Foc raza 1
Casa
cultivo
de
Mohandas
al., 2013
`Pei Chiao´
(AAA)
A. tumefaciens Brotes
múltiples
tipo coliflor
Foc RT4
Casa
cultivo
de
Yip et
2011
A. tumefaciens-SCE
M.
fijiensis
Ensayo
discos
hojas
en
de
Bombardeo
de
partículas -Brotes
múltiples
tipo
coliflor
Foc TR 4
Casa
cultivo
de
Mahdavi
al., 2012
A. tumefaciens-SCE
Foc raza 1
Casa
cultivo
de
Gagh et al.,
2014
Pflp
ferredoxina
rcc2
o
Quitinasa
tlps
proteína
taumatina
MusaDAD1,
MusaBAG1
MusaBI1
rcg3
Activación
de
respuesta
hipersensible
Degradación de
la pared celular
fúngica
tipo
Desestabilización
de
las
membranas
celulares
y
Inhibición de la
apoptosis
‘Gros
Michel’
(AAA)
Musa
sapientum
cv.
`Nangka´
(AAB)
`Rasthali´
AAB
al.,
et
al.,
Kovács et al.,
2012
et
Las quitinasas de plantas han sido las proteínas relacionadas con la patogénesis (PR, del
inglés pathogenesis related protein) más estudiadas y empleadas en la transformación
genética contra enfermedades fúngicas. En banano se han utilizado en el cv. `Rasthali´
(Sreeramanan et al., 2006) contra Foc raza 1. Por otro lado, las quitinasas rcc2 y rcg3 fueron
sobreexpresadas de forma independiente en plantas del cv. `Gros Michel´ (Musa AAA)
(Kovács et al., 2012). En ambos casos las plantas mostraron una disminución en el
desarrollo de la Sigatoka negra y en las lesiones necróticas de hasta tres veces con
respecto al control en un bioensayo in vitro realizado con hojas de plantas crecidas en casa
verde.
Revisión Bibliográfica
En otro enfoque, la endoquitinasa de Trichoderma harzianum Rifai ThEn-42 fue expresada
junto a la estilbeno sintasa de Vitis vinifera L. y la superóxido dismutasa de Solanum
lycopersicum L. en el cv. `Grande naine´ (Vishnevetsky et al., 2011). En este experimento
las líneas transgénicas evaluadas en campo contra M. fijiensis no mostraron diferencias
estadísticamente significativas respecto a los controles de plantas no transformadas.
Las proteínas PR-5 de tipo taumatina (tlp, del inglés thaumatin like protein) desestabilizan
las membranas celulares de los hongos mediante la creación de poros (Thompson et al.,
2007) e inducen respuestas de defensa en las plantas (Monteiro et al., 2003). La expresión
del gen tlp de arroz en Musa sapientum cv. `Nangka´ (AAB) causó la reducción de los
síntomas de hasta tres veces comparado con el control, a los 30 días de inoculadas con Foc
TR4 (Mahdavi et al., 2012).
Paul et al. (2011) obtuvieron plantas transgénicas del cv. `Lady Finger´ (Musa AAB) al
transformar, de forma independiente, suspensiones celulares embriogénicas con los genes
Bcl-xL, Ced-9 y Bcl-2 3´UTR. Los productos de estos genes están relacionados con la
inhibición de la apoptosis. Después de 12 semanas de inoculadas con Foc raza 1, 7 líneas
transgénicas mostraron una disminución de los síntomas internos y externos de la
enfermedad, con respecto al control. De estas, una línea Bcl-2 3´UTR se comportó de forma
similar a los Cavendish usados como control negativo. Esta estrategia resulta prometedora
para la obtención de resistencia contra patógenos necrotróficos.
Por otro lado, la disponibilidad desde el 2012 de la secuencia genómica completa del
genotipo DH-Pahang (resistente a Foc RT4) de Musa acuminata y un año más tarde de
‘Pisang Klutuk Wulung’ de Musa balbisiana constituye un impulso considerable a los
esfuerzos de mejoramiento genético de plátanos y bananos (D´Hont et al., 2012; Davey et
al., 2013).
En este sentido, Gagh et al. (2014) identificaron y sobreexpresaron en el cv.`Rasthali´ tres
genes (MusaDAD1, MusaBAG1 y MusaBI1) supuestamente relacionados con la inhibición
de la apoptosis. Las plantas transformadas con MusaBAG1 mostraron la mayor resistencia a
13
Revisión Bibliográfica
Foc raza 1 en ensayos en casa de cultivo. Este estudio es el primero en mostrar la
factibilidad del empleo de genes propios en Musa para el desarrollo de resistencia a hongos.
Finalmente, el número de investigaciones en las que se refiere el empleo de la
transformación genética en Musa spp. contra patógenos fúngicos ha aumentado en los
últimos años, mostrando su factibilidad las evaluaciones realizadas in vitro o en casas de
cultivo. Sin embargo, pocos estudios incluyen evaluaciones en campo y hasta el momento
no se han referido casos exitosos.
2.3.1. Proteínas inhibidoras de poligalacturonasa
Las proteínas inhibidoras de poligalacturonasa (PGIP) son glicoproteínas de tipo LRR
(repetición rica en leucina) que están asociadas a la pared celular de las plantas mono y
dicotiledóneas e inhiben las poligalacturonasas (PG) fúngicas durante el ataque del
patógeno. Los genes de PGIP han sido caracterizados en varias especies de plantas mono
y dicotiledóneas. Estos análisis muestran que son codificadas por pequeñas familias de
genes cuyos miembros difieren en su regulación transcripcional y en las propiedades
inhibitorias de PG fúngicas y de insectos (De Lorenzo et al., 2001; D’Ovidio et al., 2004b).
La estructura primaria típica de las PGIP está constituida por un péptido señal para la
translocación al retículo endoplasmático y un polipéptido maduro de 292 a 315 aminoácidos
(aa). La proteína madura contiene entre 9-10 LRR imperfectas de 24 aa cada una, que
responden a la secuencia consenso LxxLxLxxNxLT/SGxIPxxLxxLxx y contienen residuos
importantes para la interacción con las PG (Kalunke et al., 2015).
Durante el ataque de un patógeno, las PGIP reducen la actividad hidrolítica de las PG y
favorecen la acumulación de oligogalacturónidos (OG) de cadena larga (10-15 monómeros),
que son un tipo de patrón molecular asociado al daño capaz de inducir una variada
respuesta de defensa en las plantas (Cervone et al., 1989; Brutus et al., 2010). Esta
respuesta incluye la inducción de genes de la ruta de fenilpropanoides, la acumulación de
fitoalexinas, glucanasa y quitinasa, producción de especies reactivas del oxígeno y óxido
nítrico y deposición de calosa en la pared celular (Ferrari et al., 2013). Es además,
14
Revisión Bibliográfica
independiente de etileno, ácido jasmónico y ácido salicílico (Ferrari et al., 2007). Asimismo,
la adición de OG favorece la acumulación de transcriptos de PGIP en células de frijol y
plantas de Arabidopsis thaliana L. (Bergmann et al., 1994; Ferrari et al., 2003). Los
mecanismos de activación de estas defensas son desconocidos, sin embargo se cree que
incluyen la despolarización de la membrana citoplasmática con influjo de H + y eflujo de K+,
aumento de los niveles citosólicos de Ca 2+, activación de proteínas de unión a GTP,
activación de las fosfolipasas C y A 2, fosforilación de proteínas e inducción de fosfatasas y
quinasas activadas por mitógeno (D’Ovidio et al., 2004a).
La sobreexpresión de PGIP en diversas especies de plantas ha permitido demostrar la
importancia de estas proteínas en los mecanismos de defensa. En estos experimentos, los
genes empleados provenían de la propia especie o de otras diferentes, mientras que las
plantas de tabaco han sido las más ampliamente utilizadas. Se han obtenido altos niveles de
expresión constitutiva en plantas transgénicas de N. tabacum para los genes PvPGIP2
(Phaseolus vulgaris L.) (Borras-Hidalgo et al., 2012), VvPGIP1 (Vitis vinífera L.), CaPGIP1
(Capsicum annum L.) y BrPGIP2 (Brassica rapa L.). En cada caso se manifestó una
reducción significativa de los síntomas producidos por los patógenos: Botrytis cinerea (De
Bary) Whetzel (Manfredini et al., 2005), Rhizoctonia solani, Phytophthora parasitica var.
nicotianae (Breda de Haan) y Peronospora hyoscyami f.sp. tabacina (Skalický) para el gen
PvPGIP2; B. cinerea para el gen VvPGIP1 (Joubert et al., 2006); Alternaria alternata (Fr.)
Keissl. y Colletotrichum nicotianae Av.-Saccá para el gen CaPGIP1 (Wang et al., 2013) y
Pectobacterium carotovorum (Jones) Waldee para el gen BrPGIP2 (Hwang et al., 2010).
Los experimentos contra P. hyoscyami f.sp. tabacina han sido los primeros en utilizar
plantas transgénicas que expresan PGIP en campo. Además, los niveles de resistencia
obtenidos en las plantas de tabaco que expresan la PvPGIP2 fueron similares a los
expresados por las especies N. rustica L., N. debneyi Domin y N. megalosiphon Heurch y
Mtiller Arg. altamente resistentes al moho azul (Borras-Hidalgo et al., 2012).
15
Revisión Bibliográfica
A pesar del bajo contenido de pectina de las paredes celulares de las plantas
monocotiledóneas, la expresión de PGIP puede limitar algunas enfermedades causadas por
hongos. Las plantas transgénicas de Triticum aestivum L. que expresaban el gen PvPGIP2
mostraron una reducción de los síntomas causados por los hongos hemibiotróficos Bipolaris
sorokiniana (Sacc.) Shoemaker
(25-30%) y Fusarium graminearum Schwabe (25-30%)
(Ferrari et al., 2012).
En plantas transgénicas de este cultivo para el gen GmPGIP3 (de Glycine max (L.) Merr.) se
observó una reducción de los síntomas provocados por los patógenos Gaeumannomyces
graminis var. tritici Walker (47-83%) y B. sorokiniana (42-60%) (Wang et al., 2014a). De igual
forma, la expresión en arroz transgénico de OsPGIP1 se relacionó con el aumento de la
resistencia a R. solani en pruebas de campo (Wang et al., 2014b)
Los altos niveles de expresión de PGIP no previenen la infección, pero limitan
significativamente la colonización de los tejidos de la planta hospedante, lo que favorece los
rendimientos y calidad final del producto. Estas proteínas son eficaces en el control de
enfermedades producidas por hongos, oomicetes y bacterias, y son igualmente eficientes
contra patógenos necrotróficos y hemibiotróficos (Kalunke et al., 2015). En cuanto a los
patógenos biotróficos, los experimentos realizados hasta ahora no son concluyentes, ya que
la actividad PG del único patógeno analizado Claviceps purpurea (Fr.) Tul. no fue inhibida
por la PvPGIP2 expresada en plantas transgénicas de trigo (Volpi et al., 2013).
2.3.2. PvPGIP2
En P. vulgaris la familia de genes PGIP está constituida por 4 miembros que ocupan una
región de 50 kpb en el cromosoma 10 (D´Ovidio et al., 2004b). Al igual que otras familias de
genes relacionados con la resistencia, exhiben patrones de expresión variados frente a
patógenos y daño mecánico (Oliveira et al., 2010).
La PvPGIP2 es el inhibidor de PG más eficiente y de amplio espectro estudiado hasta ahora
(Kalunke et al., 2015). Su estructura terciaria fue determinada por cristalografía de rayos X
(Di Matteo et al., 2003), la que reveló una forma curva y alargada de la proteína (Figura 1).
16
Revisión Bibliográfica
A
B
Figura 1. A, Representación de la estructura de la PvPGIP2 de Phaseolus vulgaris L. (las
hojas B1 y B2 se muestran en verde y las hélices α en azul). B, organización de la estructura
secundaria del motivo LRR (53-289) (Di Matteo et al., 2003).
La sección cóncava de la proteína está formada por una hoja β paralela (B1) constituida por
tres cadenas de seis residuos en el extremo N-terminal y siete cadenas más cortas en el Cterminal. En esta estructura se encuentran los residuos que participan en la interacción
(Leckie et al., 1999). En el lado opuesto se encuentran 9 hélices α y otra hoja β paralela (B2)
la cual pudiera contribuir a la formación de una superficie adicional de interacción con otros
ligandos. El dominio LRR está flanqueado por dos puentes disulfuro en la región N-terminal
(Cys-3–Cys-33 y Cys-34–Cys-43) y otros dos en la C-terminal (Cys-281–Cys-303 y Cys305–Cys-312) (Di Matteo et al., 2003).
El análisis de los transcriptos de los genes de la familia PGIP de P. vulgaris en varios tejidos
de la planta y durante la infección con los hongos B. cinerea, Sclerotinia sclerotiorum (Lib.)
de Bary y Colletotrichum lindemuthianum (Sacc. y Magnus) Briosi y Cavara, mostró niveles
de inducción diferentes para cada gen (Kalunke et al., 2011). PvPGIP2 fue el único que se
expresó en todos los tejidos analizados y mostró además, la mayor acumulación de
17
Revisión Bibliográfica
transcriptos en etapas más tempranas de la infección. Esto refuerza el importante papel que
juega esta proteína en la defensa contra patógenos fúngicos.
Igualmente, PvPGIP2 posee una respuesta rápida ante señales de estrés como daño
mecánico, ácido salicílico, glucano y oligogalacturónidos (D’Ovidio et al., 2004b). PvPGIP2
es el inhibidor más potente de la actividad PG de B. cinerea (D’Ovidio et al., 2004b;
Manfredini et al., 2005) e inhibe eficientemente las dos PG segregadas por S. sclerotiorum
durante la infección (Farina et al., 2009). Además, se ha comprobado su actividad inhibidora
frente a las PG de F. phyllophilum Nirenberg y O'Donnell FC-10, 10241, 25219, 25218
(Mohammadzadeh et al., 2012), Bipolaris sorokiniana y F. graminearum (Janni et al., 2008) y
R. solani (Akhgari et al., 2012).
Recientemente, el gen PvPGIP2 fue fusionado con el gen de la PG de F. phyllophilum
(FpPG) y expresado en plantas de A. thaliana bajo el control de un promotor inducible por
patógenos (Benedetti et al., 2015). Las plantas transgénicas acumularon OG y mostraron
mayor resistencia a Botrytis cinerea, Pectobacterium carotovorum, y Pseudomonas syringae
van Hall. Este excelente enfoque confirma el papel de los OG como inductores de
respuestas de defensa en plantas y las potencialidades de su empleo en la protección
contra patógenos.
A pesar de los avances obtenidos en el desarrollo de protocolos de transformación genética
de plátanos y bananos para la búsqueda de resistencia a patógenos fúngicos, no se cuenta
aún con ningún cultivar comercial resistente a M. fijiensis y a Foc RT4. La utilización de
proteínas inhibidoras de poligalacturonasas ha demostrado ser efectiva para el control de
numerosos tipos de patógenos. Especialmente, la PvPGIP2 de P. vulgaris ha mostrado los
mejores resultados tanto en estudios en casa de cultivo y en campo. Por estas razones, la
transformación genética con este gen del cultivar élite de bananos `Grande naine´ puede ser
una
alternativa
para
el
enfrentamiento
a
estas
devastadoras
enfermedades.
18
Materiales y Métodos
3. MATERIALES Y MÉTODOS
La presente investigación se realizó en los laboratorios de Biología Molecular,
Embriogénesis Somática y Transformación Genética del Instituto de Biotecnología de las
Plantas (IBP), perteneciente a la Universidad Central “Marta Abreu” de Las Villas, en el
período comprendido desde febrero del 2014 hasta mayo del 2015.
Técnicas y procedimientos generales de trabajo
Los medios de cultivo utilizados en este trabajo, así como las puntas de mircropipetas,
mallas de nailon, papel de filtro y tubos de polipropileno de 1,5, 2,0 y 50 ml, fueron
esterilizados en autoclave vertical a 121°C y 1,2 kg cm -2 de presión, por tiempos que
variaron en dependencia del volumen de medio de cultivo a esterilizar, según información
técnica de la firma SIGMA (1991). Los platos metálicos para el manejo de los explantes, los
tamices para filtrado, placas de Petri y pipetas, se esterilizaron en la estufa a 180°C durante
dos horas.
Los medios de cultivo en estado semisólido se dosificaron en frascos de vidrio con
capacidad total de 250 ml, a los que se les adicionaron 30 ml de medio de cultivo, en placas
de Petri de 5 y 10 cm de diámetro con capacidad de 10 y 20 ml de medio de cultivo
respectivamente y en tubos de vidrio de 25 ml de capacidad, con 10 ml de medio de cultivo.
El pH fue ajustado con NaOH 0,5 N y HCl 0,5 N antes de la esterilización.
El instrumental (pinzas y espátulas) se desinfectó en un esterilizador eléctrico modelo
DENT-EQ (India) que permaneció dentro de la cabina de flujo laminar vertical, donde se
realizó el manejo de los materiales biológicos (subcultivos, transformación genética y
cambios de medios de cultivo). En los trabajos con suspensiones celulares embriogénicas,
se utilizaron pipetas cortas de vidrio de 15 ml de volumen y un dosificador PIPETBOY
(Drummond, EUA).
19
Materiales y Métodos
3.1. Transformación genética de suspensiones celulares embriogénicas de banano cv.
´Grande naine´ (Musa AAA) con el gen de la proteína inhibidora de poligalacturonasa
2 de Phaseolus vulgaris L.
Inoculación y co-cultivo
Con el objetivo de obtener plantas transgénicas que portan el gen PvPGIP2 que codifica
para la proteína inhibidora de poligalacturonasa 2 de P. vulgaris, se realizó la transformación
genética SCE según el protocolo descrito por Pérez-Hernández et al. (2006a, b), modificado
por Chong-Pérez et al. (2012b).
Se aisló una colonia de la cepa EHA105 (Hood et al., 1993) de Agrobacterium tumefaciens
que contenía el vector binario pBI121–PvPGIP2 (Figura 2), la cual creció en medio de cultivo
semisólido Luria Bertani (LB, triptona 10 g l-1; extracto de levadura 5 g l-1; NaCl 10 g l-1) que
contenía 50 mg l-1 de kanamicina y rifampicina y se inoculó en 3 ml de medio de cultivo LB
líquido en presencia de los antibióticos anteriormente mencionados (precultivo).
Figura 2. Representación esquemática de la región ADN-T del vector recombinante pBI121PvPGIP2. LB y RB, bordes izquierdo y derecho respectivamente; nptII, gen de la neomicina
fosfotransferasa; P35S, promotor del gen del ARN 35S del virus del mosaico de la coliflor; Ω,
secuencia del virus del mosaico del tabaco que favorece la traducción; PvPGIP2, gen de la
proteína inhibidora de poligalacturonasa 2 de Phaseolus vulgaris L.; Pnos y Tnos, promotor
y terminador del gen de la nopalina sintasa, respectivamente (Borras-Hidalgo et al., 2012).
Los precultivos se incubaron por 18 h a 28°C y 200 revoluciones por minuto (rpm). Luego se
inocularon 50 µl del precultivo en 50 ml de medio de cultivo YEP (extracto de levadura 10 g l 1
; bactopeptona 10 g l-1; NaCl 5 g l-1; pH 7,0) con las mismas concentraciones de antibióticos
y se mantuvieron a 28°C y 150 rpm en un agitador orbital Thermoshaker (Alemania) hasta
alcanzar una densidad óptica (DO)
600nm
de 1,2 unidades. Posteriormente se centrifugó el
cultivo bacteriano a 3 430 x g por 10 min en una centrífuga Eppendorf (Alemania), se eliminó
el sobrenadante y se resuspendieron las células en medio de cultivo líquido ZZ (sales MS
20
Materiales y Métodos
(Murashige y Skoog, 1962) al 50%; vitaminas MS; ácido ascórbico 10 mg l -1; sacarosa 30 g
l-1; 2,4-D 1 mg l-1; pH 6,12), con acetosiringona 200 µM y espermidina 1mM, ajustándose la
DO600 nm entre 0,4 y 0,5 unidades.
Se emplearon SCE de Musa cv. `Grande naine´ (AAA) obtenidas a partir de flores
masculinas inmaduras, según la metodología descrita por Côte et al. (1996) y Chong-Pérez
et al. (2012a). A los nueve días después de subcultivadas, las SCE se ajustaron a una
concentración de 33% del volumen de células sedimentadas (VCS) en un tubo cónico de
vidrio graduado de 15 ml de capacidad. La SCE se homogenizó empleando una micropipeta
(GILSON, Francia) de 1000 µl y puntas cortadas, y luego se mezclaron 200 µl de esta
(aproximadamente 50 mg de peso fresco) con 1 ml del cultivo de la suspensión bacteriana.
La inoculación se realizó en placas multipozos (Nalgene) con 24 capacidades que luego
fueron colocadas en la oscuridad a 25°C en un agitador orbital a 25 rpm por seis horas.
Posteriormente, las células vegetales se transfirieron a una malla de nailon (50 µm de
diámetro de poro) colocadas encima de papel de filtro para eliminar el exceso de medio de
cultivo y de la suspensión de A. tumefaciens. Las mallas fueron transferidas a placas de
Petri de 5 cm de diámetro que contenían 10 ml de medio de cultivo ZZ con 3 g l -1 de Gelrite y
200 µM de acetosiringona a pH 6,3. El co-cultivo se realizó por seis días en la oscuridad a
una temperatura de 21°C.
Selección y regeneración
Después del co-cultivo, las células fueron transferidas a medio de cultivo semisólido ZZ con
geneticina 50 mg l-1 (para la selección de las células transformadas) y timentina 200 mg l -1
(para el control de A. tumefaciens), y mantenidas en condiciones de oscuridad y temperatura
de 27 ± 2°C durante ocho semanas con subcultivos cada dos semanas.
Posteriormente, las colonias embriogénicas (grupo de embriones y proembriones formado a
partir de un mismo embrión) obtenidas se transfirieron para un medio de cultivo de formación
de embriones somáticos RD1 (sales MS al 50%; vitaminas MS, ácido ascórbico 100 mg l -1;
mio-inositol 100 mg l-1; Gelrite 2,5 g l-1, sacarosa 30 g l-1; pH 5,8) con geneticina 50 mg l-1 y
21
Materiales y Métodos
fueron colocadas durante cuatro semanas en la oscuridad a una temperatura de 27 ± 2°C.
Los embriones somáticos obtenidos fueron transferidos a un medio de cultivo de maduración
(medio basal MS, 6-bencilaminopurina (6-BAP) 0,25 mg l-1; ácido indol-3-acético (AIA) 0,75
mg l-1; mio-inositol 100 mg l-1; sacarosa 45 g l-1; Gelrite 2,5 g l-1; pH 5,8) donde se
mantuvieron por tres semanas en condiciones de oscuridad y temperatura de 27 ± 2°C.
Los embriones somáticos maduros se colocaron en placas de Petri de 10 cm de diámetro,
con 20 ml de medio de cultivo de germinación (medio basal MS; 6-BAP 0,5 mg l-1; AIA 2,0
mg l-1; sacarosa 30 g l-1; Gelrite 2,5 g l-1; pH 5,8). El cultivo se realizó en cámara de luz solar
a 27 ± 2°C durante 28 días. Los embriones que no germinaron fueron transferidos a un
medio de cultivo de germinación fresco durante otros 28 días.
Las plantas regeneradas fueron subcultivadas en tubos de vidrio con 10 mL de medio de
cultivo de crecimiento (medio basal MS al 50%, mio-inositol 100 mg/L, sacarosa 20 g/L;
Gelrite 2,3 g/L; pH 5,8) por 28 días y transferidas posteriormente a medio de cultivo de
multiplicación (sales MS; tiamina 0,5 mg/L; 6-BAP 4 mg/L; AIA 0,65 mg/L; sacarosa 30 g/L;
ácido cítrico 50 g/L, Gelrite 2,3 g/L; pH 5,8).
3.2. Chequeo de la presencia del inserto en las plantas obtenidas
Extracción de ADN total
Para la realización de los análisis moleculares se aisló el ADN genómico a partir de hojas de
plantas cultivadas in vitro de 77 líneas (plantas obtenidas a partir de diferentes colonias
embriogénicas) posibles transformadas con el vector pBI121-PvPGIP2 utilizando el
protocolo descrito por Khayat et al. (2004) con modificaciones. Se adicionó 1 ml de tampón
de extracción (CTAB 4% (m/v); Tris–HCl 10 mM, pH 8,0; NaCl 1,4 M; EDTA 20 mM; polivinil
pirrolidona (PVP) 10 000 2% (m/v); β-mercaptoetanol 10 mM) a 100 mg de tejido triturado en
nitrógeno líquido. Las muestras se homogenizaron e incubaron a 55°C por 30 min, se
enfriaron en hielo durante 5 min y se centrifugaron a 3 430 x g por 5 min. El sobrenadante se
incubó con RNasaI 40 mg l-1 a 37°C durante 30 min. Se añadió cloroformo previamente
enfriado a -20ºC (1:1), se centrifugó a 3 430 x g por 5 min y se transfirió la fase acuosa a un
22
Materiales y Métodos
nuevo tubo, donde se añadió 2-propanol (1:1). Las muestras se mantuvieron a -20°C por 18
h y se centrifugaron a 12 851 x g y 4°C por 15 min. El precipitado se lavó con 500 µl de
etanol al 70% (v/v), se dejó secar a temperatura ambiente y se resuspendió en 30 µl de
agua bidestilada estéril. La calidad y concentración del ADN se verificó por medición en un
espectrofotómetro BioPhotometer (Eppendorf, Alemania) y su integridad se comprobó
mediante electroforesis en gel de agarosa 0.8% (m/v) en tampón TBE 1X (0,09 M Trisborato; 0,002 M EDTA; pH 8). El gel fue teñido con bromuro de etidio (BrEt) 0,5 µg ml -1 por
10 min y observado en un transiluminador MacroVue (Pharmacia LKB) mediante la
incidencia de luz ultravioleta (UV).
3.2.1. Reacción en Cadena de la Polimerasa
La transformación de las líneas regeneradas fue comprobada mediante reacción en cadena
de la polimerasa (PCR, del inglés Polymerase Chain Reaction) empleando ADN genómico
extraído de las mismas. Como control positivo de las reacciones de PCR se utilizaron los
plásmidos empleados para la transformación genética. En el caso del control negativo se
utilizó ADN de plantas sin transformar y en el control de contaminación se sustituyó el ADN
por un volumen equivalente de agua. La reacción se llevó a cabo en un volumen total de 25
μl, que contenía 0,4 μg de ADN genómico, 0.5 μM de cada cebador, 200 μM de dNTP,
tampón de reacción de la DreamTaq polimerasa (Fermentas, Alemania) a 1X, 1 U de
DreamTaq polimerasa. Además, se adicionó albúmina de suero bovino (BSA, del inglés
bovine serum albumin) 0,1% (m/v) y PVP 1,0% (m/v) a la mezcla de PCR para aumentar la
especificidad de la reacción. Los ciclos de amplificación se llevaron a cabo en el equipo de
control térmico programable epgradient (Eppendorf, Alemania). Los cebadores y el
programa de PCR empleados se muestran en la tabla 2.
Los resultados de la amplificación fueron analizados mediante electroforesis en gel de
agarosa al 1.5% (m/v) a 10 V/cm en tampón TBE 1X por 40 min, seguido por tinción con
BrEt 0,5 µg ml-1 y visualización en transiluminador con luz ultravioleta como se explicó
anteriormente.
23
Materiales y Métodos
Tabla 2: Cebadores y condiciones empleados en la reacción en cadena de la polimerasa
para la detección de los genes PvPGIP2 y nptII sobre muestras de ADN aislado de plantas
de banano cv. ‘Grande Naine’ (Musa AAA).
Gen
Amplicón
(pb)
PvPGIP2
560
nptII
488
Cebadores
Programa de PCR
94°C por 4 min, 30
ciclos (94°C por 30 s,
Fw 5’-TCCTCATGGCTTCCAACCAC -3’
66,7°C por 30 s, 72°C
Rv 5’-ACCCTCCAGCATGTTTCGAG -3’
por 35 s) y 72°C por
10 min
94°C por 4 min, 30
Fw 5´-ATGATTGAACAAGATGGATTGCACGC- ciclos (94°C por 45 s,
3´
66°C por 45 s, 72°C
Rv 5´-TGATGCTCTT CGTCCAGATCATC-3´
por 45 s) y 72°C por
10 min
3.3. Determinación del efecto del tiempo de inoculación y de la espermidina en la
eficiencia de transformación mediada por Agrobacterium tumefaciens en Musa cv.
`Grande naine´ (AAA)
Para determinar el efecto de la adición de espermidina y la modificación del tiempo de
inoculación con A. tumefaciens en la eficiencia de la transformación genética, se empleó la
cepa EHA105 (Hood et al., 1993) que contenía el plásmido pFAJ3000 (De Bondt et al.,
1994). Este vector porta en su ADN-T (ADN de transferencia) el gen reportero uidA que
codifica para la β-glucuronidasa guiado por el promotor 35S del virus del mosaico de la
coliflor y el gen nptII que codifica para la neomicina fosfotransferasa bajo el promotor de la
nopalina sintasa nos de A. tumefaciens (Figura 3). La transformación genética de las SCE
se realizó según se describe en el acápite 3.1. Se empleó espectinomicina 100 mg l-1,
estreptomicina 300 mg l-1 y rifampicina 50 mg l-1 en los medios de cultivo selectivos de A.
tumefaciens.
Figura 3. Representación esquemática de la región ADN-T del vector binario pFAJ3000. LB
y RB, bordes izquierdo y derecho respectivamente; P35S y T35S, promotor y terminador del
gen del ARN 35S del virus del mosaico de la coliflor, respectivamente; uidA-intron, gen de la
β-glucuronidasa interrumpido por un intrón; Pnos, promotor del gen de la nopalina sintasa;
24
Materiales y Métodos
nptII, gen de la neomicina fosfotransferasa; Tocs, señal de poliadenilación de la octopina
sintasa (De Bondt et al., 1994).
Para la inoculación con la bacteria se utilizaron los tiempos 6 h, 12 h y 24 h, y se añadió
espermidina 1 mM (Spd) en el medio de cultivo ZZ líquido empleado (Chong-Pérez et al.,
2012b), quedando conformados los tratamientos de la siguiente manera: 6h, 6h + Spd, 12 h,
12 h + Spd, 24 h, 24 h + Spd.
Se evaluó para cada tratamiento la expresión transitoria de la β-glucuronidasa (número de
puntos azules por muestra) al finalizar el co-cultivo. Se emplearon 30 réplicas por
tratamiento pertenecientes a cinco experimentos independientes.
Posteriormente se evaluó el número de colonias embriogénicas luego de ocho semanas en
medio de cultivo de selectivo ZZ. Se emplearon 15 réplicas por tratamiento.
3.3.1. Determinación histoquímica de la β-glucuronidasa
El ensayo histoquímico se llevó a cabo en agregados celulares, embriones somáticos, y
fragmentos de hojas de plantas in vitro, posibles transformados con el plásmido pFAJ3000.
La expresión transitoria de la β-glucuronidasa en los agregados celulares se determinó al
finalizar el co-cultivo. Las mallas con las células se transfirieron a placas de Petri que
contenían papel de filtro saturado en la solución de ensayo [X-Gluc 1 mM (Duchefa, Países
Bajos), tampón fosfato (Na2HPO4 50 mM y KH2PO4 50 mM; pH 7,0) 100 mM, EDTA 10 mM;
ferricianuro de potasio 5 mM; ferrocianuro de potasio 5 mM; Triton X-100 0,1% (v/v)
(Jefferson et al., 1987)]. Las muestras fueron incubadas a 37°C durante la noche.
Posteriormente se contó el número de puntos azules por cada muestra, utilizando un
microscopio estereoscópico (OLYMPUS, Japón) (160x).
Para el ensayo de expresión estable de la β-glucuronidasa, los embriones somáticos y las
plantas obtenidos durante el proceso fueron incubados en la solución de ensayo durante la
noche a 37°C.
Se seleccionaron al azar 24 líneas posibles transformadas con el plásmido pFAJ3000 a las
que se analizó la expresión GUS en segmentos de hojas y verificó la presencia de los genes
25
Materiales y Métodos
uidA y nptII por PCR. Para favorecer la penetración del sustrato en los fragmentos de 1 cm2
de hojas, estos se sumergieron en la solución de ensayo, a la que se añadió SDS 0,2% y
ácido ascórbico 1% (m/v), se aplicó vacío (66,6 kPa) durante 10 min y se incubó a 37°C
durante la noche. Finalmente, se añadió etanol al 70% (v/v) y se incubó en las condiciones
mencionadas anteriormente. La expresión de la β-glucuronidasa se evaluó de manera
cualitativa a través de la presencia de puntos o manchas de color azul en las muestras
mencionadas anteriormente.
3.3.2. Análisis molecular de plantas regeneradas
El análisis por PCR se realizó como se describe en el acápite 3.2.1. para el gen nptII y para
el uidA se utilizaron las condiciones mostradas en la tabla 3:
Tabla 3: Cebadores y condiciones empleados en la reacción en cadena de la polimerasa
para la detección de los genes uidA y nptII sobre muestras de ADN aislado de plantas de
banano cv. ‘Grande Naine’ (Musa AAA)
Gen
Amplicón
(pb)
Cebadores
Programa de PCR
uidA
609
Fw 5’-TTGGGCAGGCCAGCGTATCGT -3’
Rv 5’-ATCACGCAGTTCAACGCTGAC -3’
94°C por 4 min, 30 ciclos (94°C por 30 s,
66,7°C por 30 s, 72°C por 35 s) y 72°C
por 10 min
Análisis estadístico
El procesamiento estadístico de las variables número de puntos azules y número de
colonias embriogénicas se realizó con
el
programa
Statistical
Package
for
Social
Sciences (SPSS) versión 22,0 para
Windows, con previa comprobación de los
supuestos de normalidad y homogeneidad de varianza, para p < 0,05. Se utilizaron las
pruebas no paramétricas Kruskal-Wallis y Mann-Whitney para p < 0,05.
26
Resultados y Discusión
4. RESULTADOS Y DISCUSIÓN
4.1. Transformación de suspensiones celulares embriogénicas de banano cv. ´Grande
naine´ (Musa AAA) con el gen de la proteína inhibidora de poligalacturonasa 2 de
Phaseolus vulgaris L.
Para la obtención de plantas de banano que contienen el gen PvPGIP2 que codifica para una
proteína inhibidora de poligalacturonasa, se realizó la transformación genética mediada por A.
tumefaciens sobre seis muestras (200 µl de SCE al 33% de VCS) de SCE del cultivar de
banano `Grande naine´ (AAA) (Figura 4) empleando la el vector binario pBI121-PvPGIP2
(Borrás-Hidalgo et al., 2012).
Figura 4. Transformación genética mediada por Agrobacterium tumefaciens de suspensiones
celulares embriogénicas de Musa cv. `Grande naine´ (AAA). A, agregados celulares
embriogénicos durante el co-cultivo con la bacteria; B, embriones formados después de dos
meses en medio de cultivo selectivo (geneticina 50 mg.l-1); C, control no transformado en medio
de cultivo selectivo; D, colonias embriogénicas en medio de cultivo de formación de embriones
RD1; E, colonias embriogénicas en medio de cultivo de maduración; F, germinación de
embriones somáticos; G, planta regenerada; H, multiplicación de las plantas (barra = 1.0 cm).
27
Resultados y Discusión
Durante el período de co-cultivo (oscuridad y 21ºC) no se observó sobre-crecimiento de la
bacteria en las muestras inoculadas (Figura 4A), hecho que corrobora los resultados obtenidos
anteriormente por otros autores al utilizar estas condiciones de inoculación y co-cultivo (PérezHernández et al., 2006a; Arinaitwe et al., 2008; Chong-Pérez et al., 2012a). Durante el período
de selección se observó que, tanto las células inoculadas como las no inoculadas sometidas a
presión selectiva tomaron una coloración parda oscura. Las muestras no inoculadas y crecidas
en medio de cultivo sin presión de selección no mostraron ninguna afectación. No obstante,
entre la tercera y cuarta semanas, se observó la aparición de pequeños embriones y proembriones blancos solamente en las muestras inoculadas con A. tumefaciens y en las no
inoculadas que no fueron sometidas a selección. Las muestras no inoculadas y sometidas a
selección continuaron tornándose negruzcas, lo que mostraba el efecto necrótico de la
geneticina sobre las células.
Después de ocho semanas en medio de cultivo selectivo, se observó la presencia de embriones
somáticos globulares formando colonias embriogénicas en la superficie de los agregados
celulares necrosados, en las muestras que fueron inoculadas con A. tumefaciens (Figura 4B).
En las muestras no inoculadas no se detectó crecimiento de ninguna estructura embriogénica
después de los cuatro ciclos de selección (Figura 4C). Los resultados indican la eficiencia del
régimen selectivo empleado y coincide con los obtenidos por Arinaitwe (2008) para este cultivar
e igual régimen selectivo.
Posteriormente, las colonias embriogénicas fueron cuantificadas y transferidas individualmente
al medio de cultivo selectivo RD1, corroborándose la resistencia a geneticina de los embriones
somáticos formados (Figura 4D). Se obtuvo un promedio de 21,6 ± 6,6 colonias posibles
transformadas por muestra y de 44 ± 7,0 para los controles no transformados sin presencia de
agente selectivo. Estos embriones fueron luego colocados en medio de cultivo de maduración
28
Resultados y Discusión
(Figura 4E). En ninguno de estos procesos se observó el crecimiento de A. tumefaciens,
indicando la eficacia de la timentina 200 mg l-1 en su control.
Luego de cultivar los embriones somáticos maduros obtenidos en el medio de cultivo de
germinación por 28 días (Figura 4F), se observó la aparición de plantas con diferentes patrones
morfológicos. Las plantas que poseían hojas abiertas, pseudotallo definido y raíces fueron
transferidas a medio de cultivo de crecimiento por 28 días (Figura 4G). Una vez concluido este
período se tomaron muestras para los análisis moleculares. A la vez, los embriones no
germinados o con germinación incompleta fueron colocados nuevamente en medio de cultivo
de germinación por igual período de tiempo. Finalmente, las plantas fueron mantenidas en
medio de cultivo de multiplicación, con subcultivos cada 20 días (Figura 4H).
De las seis muestras inoculadas con A. tumefaciens se logró la regeneración de 81 líneas
posibles transformadas (Figura 4G), para un promedio de 13,5 plantas/200 µl de SCE al 33% de
VCS. En el caso de los controles no transformados se obtuvo un promedio de 43,5 plantas por
muestra. Considerando estos datos, podríamos calcular la eficiencia de transformación a través
del potencial embriogénico de la línea celular utilizada en estos experimentos. Teniendo en
cuenta la relación entre el número de líneas obtenidas por muestra (13,5) y de plantas
obtenidas en los controles no transformados (43,5), podríamos decir que la eficiencia de
transformación fue de 31%. El uso de este indicador no se ha referido en la literatura y resulta
útil para caracterizar el proceso de transformación de forma independiente de la capacidad
regenerativa de las líneas celulares embriogénicas utilizadas.
En un experimento similar, Arinaitwe (2008) obtuvo para este cultivar entre 85-90 colonias
embriogénicas y 40-45 plantas/200 µl de SCE al 33% de VCS. Debido a que el protocolo
utilizado fue el mismo para ambos casos, las diferencias detectadas deben estar influidas en
mayor medida por el empleo de líneas celulares que poseen diferente potencial embriogénico.
Este fenómeno fue corroborado con anterioridad por Chong-Pérez et al., (2012) al comparar la
29
Resultados y Discusión
capacidad de formación de embriones y regeneración de plantas de dos líneas celulares
establecidas del cv. `Dwarf Cavendish´ (AAA). En este caso, una de las líneas mostró una
respuesta embriogénica dos veces mayor a la obtenida para la otra.
La selección y regeneración de plantas constituye uno de los puntos críticos para el éxito de la
transformación genética (Joersbo, 2001). Esto se debe a que las colonias transformadas deben
superar el estrés inducido por los antibióticos empleados para eliminar la bacteria y las células
vegetales no transformadas. En este estudio, la frecuencia de regeneración de las colonias
embriogénicas fue menor en las muestras transformadas en comparación con los controles de
SCE no transformadas. Esto coincide con lo observado por Arinaitwe (2008) para la
transformación genética mediada por A. tumefaciens y con el uso de bombardeo de partículas
en SCE del cv. `Grande naine´. Lindsey y Gallois (1990) indicaron que este efecto se debe a la
acumulación de compuestos tóxicos que se originan de los tejidos necróticos no transformados
durante la selección. Por otro lado, la exposición a A. tumefaciens provoca ennegrecimiento y
necrosis de los tejidos de plantas como la uva (Perl et al., 1996), el sorgo (Gao et al., 2005),
trigo (Parrott et al., 2002), pimiento, tomate y lechuga (Wroblewski et al., 2005). Por su parte,
Khanna et al., (2007) presentaron evidencias de la inducción de la muerte celular programada
en células de banano (cv. `Grande naine´ y `Lady Finger´) luego de la exposición con la
bacteria, que provocó la muerte a cerca del 90% de las células embriogénicas expuestas.
La transformación genética mediada por A. tumefaciens de SCE del cv. `Grande naine´ fue
descrita por primera vez por Khanna et al. (2004). Estos autores determinaron la influencia de
varios factores en la formación de colonias embriogénicas y/o la regeneración de plantas. En
los estudios realizados utilizando una suspensión bacteriana con DO600nm = 0,5 se obtuvieron,
para el número de colonias embriogénicas, valores que oscilaron entre 100-200 en
dependencia del tratamiento, mientras que el número de plantas regeneradas que expresaban
las proteínas GUS o GFP estuvo entre 8 y 64. Estos últimos valores concuerdan con los
30
Resultados y Discusión
informados por Pérez-Hernández et al. (2006a) para el protocolo de transformación que se
emplea en la presente investigación, que posee una eficiencia de 25-65 plantas/200 µl de SCE
al 33% de VCS para los cultivares `Grande naine´, `Williams ´, `Orishele´, `Obino l´Ewai´ y
`Cacambou´ empleando las cepas de A. tumefaciens EHA101, EHA105, AGL0, AGL1 y
LBA4404.
Utilizando el protocolo anterior con algunas modificaciones, Chong-Pérez et al. (2012a)
obtuvieron entre 63-107 colonias y 29-41 plantas/200 µl de SCE al 33% de VCS en el cultivar
`Grande naine´. Estos autores informaron además el porciento de regeneración obtenida con el
empleo de dos vectores diferentes que fue de 43,8 y 44,9%. A su vez, estos últimos valores son
muy similares a los obtenidos en este presente trabajo (47,7%), lo que corrobora el papel de las
líneas celulares embriogénicas utilizadas en las diferencias observadas con el resto de los
protocolos analizados.
4.2. Chequeo de la presencia del inserto en las plantas obtenidas
4.2.1. Reacción en Cadena de la Polimerasa
El ADN genómico extraído de las 72 líneas posiblemente transformadas se utilizó para el
análisis por PCR y se determinó la presencia o no de los genes PvPGIP2 (Figura 5) y nptII
(Figura 6).
Se obtuvieron 68 líneas (94,4%) en las que se detectó la presencia del segmento de 560 pb del
gen PvPGIP2 (positivas) mientras que en cuatro de las líneas analizadas no se detectó la
presencia del mismo, lo que representa el 5,6% (negativas)(Figura 5). Los cebadores utilizados
fueron efectivos al generarse un único producto de PCR del tamaño esperado, mientras que no
se obtuvo amplificación para el control de plantas sin transformar ni para el control de
contaminación (H2O).
31
Resultados y Discusión
600 bp
500 bp
Figura 5. Electroforesis en gel de agarosa al 1,5% (m/v) del producto de PCR realizado
con el ADN extraído a partir de 72 líneas regeneradas de banano cv. `Grande naine’ (Musa
AAA). La amplificación se realizó utilizando cebadores específicos de un fragmento de 560 pb
del gen PvPGIP2. C-, plantas sin transformar; C+, plásmido pBI121-PvPGIP2 utilizado en la
transformación; H2O en lugar de ADN; PM patrón de masa molecular O´Range RulerTM 100 bp
DNA Ladder Plus (Fermentas, Alemania). Se señalan las bandas del patrón de peso molecular
más cercanas al fragmento amplificado.
Por otro lado, para la amplificación del segmento de 488 pb correspondiente al gen nptII se
obtuvieron 64 líneas positivas (88,9%) mientras que ocho resultaron negativas (11,1%)(Figura
6).
32
Resultados y Discusión
500 bp
400 bp
Figura 6. Electroforesis en gel de agarosa al 1,5% (m/v) del producto de PCR realizado
con el ADN extraído a partir de 72 líneas regeneradas de banano cv. `Grande naine’ (Musa
AAA). La amplificación se realizó utilizando cebadores específicos de un fragmento de 488 pb
del gen nptII. C-, plantas sin transformar; C+, plásmido pBI121-PvPGIP2 utilizado en la
transformación; H2O en lugar de ADN; PM patrón de masa molecular O´Range RulerTM 100 bp
DNA Ladder Plus (Fermentas, Alemania). Se señalan las bandas del patrón de peso molecular
más cercanas al fragmento amplificado.
En las líneas posiblemente transformadas 18, 20 y 21 no se detectó la presencia de los genes
PvPGIP2 ni nptII. Estos resultados indican la ocurrencia de escapes durante el proceso de
selección o la inhibición de la reacción de amplificación por la presencia de contaminantes en la
muestra de ADN. A su vez, en la línea 19 no se detectó la presencia del gen PvPGIP2 pero sí la
del nptII. Esto pudiera deberse a que el ADN-T insertado esté cortado y haya ocurrido una
transgénesis incompleta.
33
Resultados y Discusión
El gen de frijol común PvPGIP2 utilizado en este trabajo codifica para el inhibidor de PG más
eficiente y de amplio espectro estudiado hasta ahora (Kalunke et al., 2015). Teniendo en
cuenta que hasta la fecha no se describen en la literatura científica revisada resultados
relacionados con la transformación genética en el género Musa con este gen, se resume en la
tabla 4 los parámetros fundamentales relacionados con la misma.
Tabla 4. Transformación genética mediada por Agrobacterium tumefaciens de banano cv.
`Grande naine´ (AAA) con el gen de la proteína inhibidora de poligalacturonasa 2 de Phaseolus
vulgaris L.
Parámetros evaluados
Muestras inoculadas*
Promedio de colonias
embriogénicas/muestra
Líneas regeneradas
Promedio de plantas
regeneradas/muestra
% Líneas regeneradas/plantas
control regeneradas
6
21,25
81
13,5
31
Líneas chequeadas
72
Líneas positivas a PvPGIP2
68 (94,4%)
Líneas positivas a nptII
64 (88,9%)
*200 μl de SCE al 33% de VCS~50 mg de masa fresca
La eficiencia de transformación genética obtenida en este experimento fue menor que las
referidas por otros autores en el cv. `Grande naine ´empleando un protocolo de transformación
similar, sin embargo las frecuencias de transformación fueron similares a las referidas por otros
autores. Por ejemplo, Arinaitwe (2008) obtuvo entre 90-100% de líneas positivas al analizar por
PCR la presencia de los pares de genes uidA y nptII, y hpt y Cht3 en plantas transformadas con
los vectores pFAJ3000 y pBI333-EN4-RCG3, respectivamente. En este sentido, se han referido
34
Resultados y Discusión
frecuencias de 100% (Chong et al., 2012a) y de 81,8% (Chong et al., 2013). En este último
caso, la disminución del tiempo de selección de 12 a 8 semanas provocó el aumento del
número de escapes.
Durante la transformación genética mediada por A. tumefaciens se espera una frecuencia de
co-transformación del 100% para los genes contenidos en el ADN-T (Kovács et al., 2012). Sin
embargo, se han referido comportamientos diferentes al esperado.
En este trabajo, la frecuencia de co-transformación fue de 91,3% para los genes PvPGIP2 y
nptII. Resultados similares fueron obtenidos por Arinaitwe (2008), quien refirió una frecuencia
de co-transformación del 90% para los genes nptII (9/10) y sgfpS65T (10/10) en los cv. `Obino
l´Ewai´ y `Orishele´. Sin embargo, estos resultados deben confirmarse mediante hibridación por
Southern, debido a que pudieran existir falsos negativos en los análisis realizados mediante
PCR a las líneas posiblemente transformadas.
Al transformar SCE del cv. `Gros Michel´, Kovács et al. (2012) obtuvieron una frecuencia de cotransformación de 71,4% para los genes rcg3 y hpt mediante el análisis por PCR. La posterior
hibridación por Southern evidenció la presencia de falsos negativos para los dos genes, por lo
que la frecuencia final fue de 100%. Adicionalmente, en 15 de las 24 líneas transgénicas
obtenidas observaron diferencias en el número de copias para los transgenes ligados.
Estos fenómenos indican la integración incompleta del ADN-T y/o la ocurrencia de
reordenamientos de los insertos. Los mismos están descritos para la transformación genética
con A. tumefaciens en diferentes especies (Ziemienowicz et al., 2008) y se relacionan con el
mecanismo de formación, transferencia e integración del ADN-T en el genoma hospedante. Los
ADN-T no siempre se escinden de la misma posición en su plásmido de origen y pueden sufrir
reordenamientos, rupturas o ser degradados por nucleasas en la célula vegetal antes de la
integración. Además, la secuenciación de los bordes entre el ADN-T y el genoma de las plantas
ha mostrado que, durante el proceso de integración, las moléculas de ADN-T pierden parte de
35
Resultados y Discusión
sus secuencias (Bartlett et al., 2014), mientras que ocurren pequeñas deleciones en el genoma
hospedante (Meza et al., 2002). Generalmente es el borde derecho el mejor conservado, sin
embargo existen evidencias en numerosas plantas de la ocurrencia de deleciones en este
extremo.
En este trabajo se identificaron cinco líneas con posibles deleciones del gen nptII ubicado cerca
del borde derecho y solo una para el gen PvPGIP2 localizado cerca del borde izquierdo.
En este sentido, el análisis de los bordes derechos de 19 líneas transgénicas de cebada indicó
que en el 33% de los casos existían deleciones de entre 1-89 pb (Bartlett et al., 2014). Por otro
lado, Gambino et al. (2009) encontraron varias deleciones en ambos bordes durante el estudio
de las inserciones del ADN-T en plantas de uva transgénicas. Adicionalmente, Wu et al. (2006)
identificaron, en 34 líneas de trigo transgénico, una serie de deleciones en el borde derecho. El
44% de las líneas poseía un ADN-T incompleto en las cuales el gen bar o el uidA se había
perdido, aunque el gen uidA que se encontraba cercano a este estaba más conservado que el
gen bar ubicado cerca del borde izquierdo.
Meza et al. (2002) encontraron en Arabidopsis thaliana dos líneas con insertos truncados, una
con una deleción que incluye el gen nptII con su promotor y terminador en el borde izquierdo y
otra en la cual el borde derecho fue eliminado en su totalidad.
De igual manera, en un análisis de los bordes de la región de integración del ADN-T
pertenecientes a 19 plantas de Musa cv. `Three Hand Planty´ transformadas con el vector
pFAJ3000, Pérez-Hernández et al. (2006b) observaron una mayor conservación de los bordes
izquierdos. Estos autores describieron además, la integración de secuencias no propias del
ADN-T hacia los bordes izquierdo y derecho, en un 26% de las plantas analizadas.
Los elementos expuestos con anterioridad indican que la ocurrencia de deleciones en los
bordes izquierdos y derecho del ADN-T durante la integración pudiera constituir una explicación
36
Resultados y Discusión
para los patrones observados en la amplificación de los segmentos de los genes nptII y
PvPGIP2 en esta investigación.
La versatilidad de la proteína PvPGIP2 de P. vulgaris en el reconocimiento de numerosas
poligalacturonasas fúngicas y su capacidad para la activación de respuestas de defensa en las
plantas presenta una nueva vía en la solución de los problemas causados en Musa spp. por
estos patógenos. La obtención de plantas transgénicas es el primer paso en esa dirección. La
metodología utilizada en este trabajo para la transformación de SCE del cv. `Grande naine´
permitió la obtención de plantas que contienen el gen de la PvPGIP2. No obstante, la eficiencia
de este proceso pudiera incrementarse mediante la modificación de algunos parámetros.
4.3. Determinación del efecto del tiempo de inoculación y de la espermidina en la
eficiencia de transformación mediada por Agrobacterium tumefaciens en Musa cv.
`Grande naine´ (AAA)
En el acápite anterior se realizó la inoculación con la bacteria durante 6 h y se añadió
espermidina 1 mM según las metodologías descritas por Pérez-Hernández et al. (2006a) y
Chong-Pérez et al. (2012b). Con el objetivo de determinar el efecto de este compuesto en
combinación con el aumento del tiempo de inoculación en la eficiencia de la transformación
genética, se empleó el vector binario pFAJ3000 que porta el gen de la β-glucuronidasa.
Se utilizaron seis tratamientos (6h, 6h + Spd, 12 h, 12 h + Spd, 24 h, 24 h + Spd) y se evaluó la
eficiencia de transformación genética expresada como número de puntos azules por muestra
(expresión transitoria GUS) al finalizar el co-cultivo y número de colonias embriogénicas por
muestra obtenidas luego del proceso de selección.
La expresión transitoria GUS se evaluó para cinco experimentos independientes, con seis
muestras cada uno (Figura 7 y Tabla 5).
No se observaron diferencias significativas entre los tratamientos con espermidina y sin
espermidina (Tabla 5), mientras que el empleo de tiempos de inoculación superiores a 6 h
37
Resultados y Discusión
provocó un aumento significativo de la expresión transitoria, sin diferencias entre los
tratamientos 12 y 24 h.
Figura 7. Efecto del tiempo de inoculación y la espermidina (Spd, 1 mM) en la expresión
transitoria de la β-glucuronidasa en agregados celulares embriogénicos de Musa cv. `Grande
naine´ (AAA) que fueron inoculados con Agrobacterium tumefaciens por A, 6 h; B, 12 h; C, 24 h;
D, 6 h + Spd; F 12 h + Spd y G: 24 h + Spd. (barra = 0,5 cm)
Seguidamente, las células transformadas crecieron y se multiplicaron en medio de cultivo
selectivo durante dos meses, al término de los cuales aparecieron colonias embriogénicas en la
superficie de los agregados celulares. No se observó formación de embriones en los controles
sin transformar colocados en medio de cultivo selectivo. Las colonias embriogénicas obtenidas
a partir de 15 muestras por cada tratamiento aplicado, fueron cuantificadas (Tabla 5) y
colocadas en medio de cultivo RD1 con agente selectivo por otro mes.
38
Resultados y Discusión
Tabla 5. Efecto del tiempo y la espermidina (Spd, 1 mM) durante la inoculación de
suspensiones celulares embriogénicas de Musa cv. `Grande naine´ (AAA) con A. tumefaciens
en la expresión transitoria de la β-glucuronidasa en agregados celulares y el número de
colonias embriogénicas obtenidas después de la selección.
Tratamientos
Número de
puntos azules
Rangos
medios
Número de
colonias
embriogénicas
Rangos
medios
6h
1540,73
149,4 b
12,63
44,62 d
6h+Spd
1331,53
140,2 b
21,86
59,28 cd
12 h
2610,65
214,26 a
9,08
35,00 d
12 h+Spd
2186,56
183,63 a
27.11
67,66 c
24 h
2539,36
190,53 a
22,50
58,25 cd
24 h+Spd
2832,73
200,13 a
45,25
120,00 a
Control sin
transformar
-
-
37,67
97,00 ab
Control sin
transformar
+Spd
-
-
31,90
82,00 b
Se muestran las medias y rangos medios de cinco experimentos independientes, cada uno con seis
réplicas de 200 µL de SCE al 33% de VCS para la variable Número de puntos azules y de un
experimento con 15 réplicas para la variable Número de colonias embriogénicas. Los valores en una
misma columna con letras distintas difieren estadísticamente según Kruskal–Wallis/Mann-Whitney para
p<0,05.
Algunas colonias embriogénicas fueron seleccionadas al azar y teñidas con X-Gluc. Se observó
la expresión estable del gen uidA en todas las colonias analizadas, con variaciones en la
intensidad de la tinción (Figura 8A). Consecuentemente, en la tinción realizada a algunas
plantas in vitro se puedo comprobar la expresión GUS estable (Figura 8B).
39
Resultados y Discusión
Figura 8. Expresión estable de la β-glucuronidasa (GUS) en colonias embriogénicas luego de la
selección con geneticina 50 mg l-1(A) y plantas in vitro (B) de Musa cv. `Grande naine´ (AAA)
transformados mediante Agrobacterium tumefaciens con el vector pFAJ3000. (barra = 0,5 cm)
De manera general, se observaron diferencias significativas entre los tratamientos con
espermidina y sin espermidina para los tiempos 12 y 24 h, siendo mayores las frecuencias de
transformación estable, expresadas en número de colonias embriogénicas, para los
tratamientos con espermidina (Tabla 5). De estos, el mayor valor se obtuvo con el tratamiento
24 h + Spd que no mostró diferencias significativas con los controles y superó por cinco veces
la frecuencia obtenida con el tratamiento 12 h.
Adicionalmente, el número de colonias embriogénicas/muestra obtenido para el tratamiento 6 h
+ Spd (21,8) fue similar al referido en esta investigación durante la transformación con el gen
PvPGIP2 (21,25). Esto se debe a que en ambos casos se utilizó la misma línea celular
embriogénica, y a que en los vectores empleados, la expresión del gen nptII está regulado por
el promotor de la nopalina sintasa de A. tumefaciens.
Por su parte, el tiempo de inoculación no influyó en la eficiencia a nivel de transformación
estable en los tratamientos sin espermidina. Sin embargo, cuando esta fue adicionada, se
observó un aumento en la formación de colonias embriogénicas (Tabla 5), lo que indica el
efecto aditivo de estos factores.
40
Resultados y Discusión
El desarrollo de protocolos que resulten en elevadas frecuencias de transformación genética y
puedan utilizarse para varios grupos de cultivares de Musa spp. es un requerimiento de los
estudios de genómica funcional y las iniciativas de mejoramiento genético en este género
(Khanna et al., 2004). Adicionalmente, la variedad existente en los métodos de transformación
genética, genotipos, sistemas de cultivo de tejidos empleados y capacidad de regeneración de
las líneas celulares empleadas dificulta la comparación de la eficiencia entre los trabajos
encontrados en la bibliografía.
En las metodologías descritas para la transformación genética de SCE en Musa spp. se han
utilizado diferentes variables como indicadores de la eficiencia del proceso, siendo las más
empleadas el número de puntos azules o verdes (expresión transitoria GUS o GFP,
respectivamente) (Khanna et al., 2004; Arinaitwe et al., 2008; Chong-Pérez et al., 2012b), el
número de colonias embriogénicas obtenidas después de la selección (Khanna et al., 2004;
Chong-Pérez et al., 2013) y el número de plantas regeneradas (Pérez-Hernández et al., 2006a;
Chong-Pérez et al., 2012b).
La modificación del tiempo de inoculación con A. tumefaciens se ha utilizado para aumentar la
eficiencia de transformación en Musa spp. En el cv. `Dwarf Cavendish´ Chong-Pérez et al.
(2012b) evaluaron las variables mencionadas anteriormente para los tiempos de inoculación 30
min y 6 h, en un protocolo de transformación genética con A. tumefaciens asistida por
centrifugación. Como resultado de esto observaron que el tratamiento de 6 h duplicó la
eficiencia obtenida para el de 30 min.
Por otro lado, Arinaitwe et al. (2004) estudiaron el efecto de los tiempos 4, 6, 8, 10 y 14 h en la
expresión transitoria GUS en el cv. `Grande naine´, observando una relación directamente
proporcional entre ellos. Estos autores refirieron además que, luego de tres meses en medio de
cultivo selectivo, al aumentar el tiempo de inoculación se incrementaba el número de colonias
embriogénicas totalmente teñidas a la vez que disminuían las teñidas parcialmente. Esto puede
41
Resultados y Discusión
deberse a que el aumento del tiempo de contacto entre la bacteria y las células vegetales
favorece los procesos de quimiotaxia y activación de los genes vir. Sin embargo, en este
estudio también se observó una disminución en la coloración azul a las 14 horas, que los
autores atribuyeron a la necrosis provocada por el prolongado tiempo de contacto con la
bacteria.
En el presente trabajo, el aumento del tiempo de inoculación favoreció la expresión transitoria
GUS, aunque por sí solo no influyó en el número de colonias embriogénicas. Este efecto está
relacionado probablemente con la inducción por A. tumefaciens de la muerte celular
programada, fenómeno descrito por Khanna et al. (2007) en los cv. `Grande naine´ (AAA) y
`Lady Finger´ (AAB). Estos autores demostraron la formación de cuerpos apoptóticos y la
fragmentación del ADN genómico característicos de esta respuesta. Adicionalmente, la
transformación de SCE con genes antiapoptóticos de origen animal, aumentó significativamente
la frecuencia de transformación, indicando la incidencia de este fenómeno en las tasas de
regeneración de plantas.
En un estudio anterior, Hansen (2000) refirió la inducción de una respuesta hipersensible
inducida por A. tumefaciens en callos de maíz con características propias de la muerte celular
programada. La transformación con dos genes antiapoptóticos de baculovirus previno la
degradación del ADN y los cambios morfológicos típicos de la este proceso. En este caso, no
aumentó la regeneración de plantas transgénicas, lo que se debió fundamentalmente a la baja
eficiencia de la transferencia del ADN-T a las células de maíz.
La inducción de múltiples genes en los hospedantes durante la inoculación con A. tumefaciens,
dentro de los que se encuentran componentes de los mecanismos de defensa (Ditt et al., 2001)
pudiera influir en la variabilidad en la respuesta entre genotipos durante la transformación
genética.
42
Resultados y Discusión
En esta investigación, el empleo de espermidina 1 mM durante la inoculación no tuvo efectos
significativos en la expresión transitoria GUS, sin embargo favoreció la posterior formación de
colonias embriogénicas (Tabla 5). Un resultado similar fue obtenido por Khanna et al. (2004) al
aplicar un golpe de calor de 45°C por 5 min a SCE de los cv. `Grande naine´ y `Lady Finger´
previo a la inoculación con A. tumefaciens. Este tratamiento no aumentó la expresión transitoria
GFP, mientras que duplicó la formación de colonias embriogénicas. El empleo de un golpe de
calor durante la transformación genética con A. tumefaciens se había descrito con anterioridad
por Hansen (2000), quien lo asoció a la inhibición de la muerte celular programada inducida por
la bacteria en tejidos de maíz y trigo.
La espermidina, junto a la espermina y la putrescina, participa en la regulación de importantes
aspectos del desarrollo celular en organismos eucariontes y procariontes. En las plantas,
participan en numerosos procesos del crecimiento y desarrollo, así como en las respuestas a
estrés biótico y abiótico (Kusano et al., 2008). Recientemente se ha referido su empleo en la
transformación genética, al favorecer la multiplicación y regeneración de los embriones (Petri et
al., 2005; Silva et al., 2009).
Adicionalmente, Kumar y Rajam (2005) observaron que la adición exógena de las poliaminas
espermina, putrescina y espermidina inducía la expresión de los genes vir de A. tumefaciens y
aumentaba la transferencia del ADN-T y la expresión transitoria GUS en plantas de tabaco.
En este sentido, la adición de espermidina 1 mM durante la inoculación con la bacteria provocó
un incremento en la expresión transitoria GUS en agregados celulares del cv. `Dwarf
Cavendish´ (AAA) (Chong-Pérez et al., 2012b). Este efecto se manifestó igualmente en la
transformación estable, donde la poliamina favoreció el aumento del número de colonias
embriogénicas y de plantas obtenidas.
Adicionalmente Arinaitwe (2008) estudió en Musa spp. la influencia de la adición de
espermidina durante la formación de embriones, en la regeneración de plantas de los cv.
43
Resultados y Discusión
`Williams´ y `Three Hand Planty´ a partir de SCE transformadas con A. tumefaciens. Este autor
utilizó cinco concentraciones de espermidina entre 0,1 mM - 10 mM, para las cuales la
regeneración de embriones se vio afectada en el cv. `Williams´ mientras que fue máxima en el
cv. `Three Hand Planty´ para la concentración de 0,1 mM. Esto sugirió que esta respuesta es
dependiente del genotipo, así como de los niveles exógenos y endógenos de la poliamina
(Shoeb et al., 2001). No obstante, este autor no evaluó el efecto de la adición de este
compuesto en la regeneración de plantas sin transformar, lo que limita la extensión de sus
conclusiones al respecto.
Los resultados de la presente investigación indican que la espermidina favorece la
transformación genética mediada por A. tumefaciens de SCE del cv. `Grande naine´.
Aparentemente esto ocurre por su acción sobre los tejidos vegetales. Se ha referido que este
compuesto favorece los procesos de división celular (Theiss et al., 2002), y en SCE de Musa cv.
`Grande naine´ se asoció la competencia embriogénica con la presencia de un elevado
catabolismo de esta poliamina (Noceda, 2001).
En este trabajo no se observaron diferencias significativas en cuanto a la formación de colonias
embriogénicas entre los controles a los que se añadió espermidina, y los que no estuvieron en
contacto con esa poliamina. Además, el hecho de que las diferencias significativas entre las
muestras transformadas se observen a partir de las 12 h y que el valor máximo corresponda a
las 24 h + Spd sugiere que su efecto se ve favorecido por el aumento del tiempo en que este
compuesto interactúa con las células vegetales. Lo anterior sugiere que la espermidina ejerce
también un papel protector frente a los daños provocados al tejido por la bacteria.
En este sentido, se ha referido que esta y otras poliaminas se comportan como antioxidantes al
favorecer la recuperación de tejidos fenolizados en callos de Pinus spp. (Tang et al., 2004).
A su vez, se ha relacionado a las poliaminas con la regulación de los procesos de muerte
celular programada (Kuehn y Phillips 2005). En suspensiones celulares de tabaco se observó
44
Resultados y Discusión
que la adición exógena de espermidina protegía a las células de la apoptosis inducida por golpe
de calor (Locato et al., 2008). Este efecto fue dependiente de la concentración de espermidina
utilizada y se relacionó con la recuperación de la actividad ascorbato peroxidasa.
Recientemente se observó que esta enzima es reprimida en callos de Vitis vinifera después de
ser co-cultivados con A. tumefaciens (Zhao et al., 2011). A pesar de esto, los mecanismos por
los cuales las poliaminas pudieran regular la apoptosis se desconocen hasta el momento.
A modo de conclusión, el efecto de la espermidina en la transformación genética observado en
esta investigación pudiera deberse a la acción de esta molécula sobre la multiplicación celular y
la regeneración, así como a la regulación de la muerte celular programada inducida por A.
tumefaciens. No obstante, son necesarios otros estudios para confirmar esta hipótesis.
Finalmente, mediante el aumento del tiempo de inoculación y la adición de espermidina se logró
aumentar significativamente la eficiencia de la transformación genética en el cv. `Grande naine´
hasta casi el máximo de la capacidad de formación de embriones de la línea celular empleada.
Por otro lado, con el objetivo de verificar la transformación estable en este proceso de
transformación genética, los embriones maduros fueron transferidos a medio de cultivo de
germinación. De las plantas obtenidas, fueron seleccionadas 24 líneas al azar para el análisis
de la expresión GUS estable (Figura 9).
La tinción GUS se manifestó principalmente en los bordes de los segmentos de hojas
empleados con variación en la intensidad del color. Un total de 16 líneas resultaron teñidas
(66,6%) mientras que en el resto no se observó la coloración (Figura 9). La ausencia de
actividad GUS en estas plantas puede deberese a las siguientes razones: a) las plantas no son
transgénicas, b) el ADN-T insertado está truncado y c) el gen uidA está silenciado.
En este sentido, en el acápite 4.2. se detectó y discutió la presencia de escapes durante el
proceso de selección. Es posible que la proliferación de células transformadas adyacentes a
otras que no lo son, contribuya a la inactivación del antibiótico y la aparición de falsos positivos
45
Resultados y Discusión
(Padilla y Burgos, 2010). Esto puede explicar parcialmente los resultados de la tinción GUS en
colonias embriogénicas mostrados en la figura 8A.
Con anterioridad se discutió en este documento sobre la ocurrencia de deleciones en los ADN-T
durante los procesos de transferencia e integración en el genoma hospedante. Este fenómeno
pudiera estar influyendo en los resultados de la tinción GUS observados.
Por otro lado, el silenciamiento de los genes insertados durante la transformación genética con
A. tumefaciens es un fenómeno ampliamente referido (Gelvin, 2003). La inserción aleatoria del
ADN-T en el genoma de la planta tiene importantes implicaciones en la expresión de los
transgenes, la cual puede ser afectada por la presencia de secuencias reguladoras de las
plantas y de fenómenos como la metilación (Banta y Montenegro, 2008). El silenciamiento
transcripcional ocurre también con mayor frecuencia en los loci donde se han insertado
múltiples copias del transgén (Koprek et al., 2001).
Este factor, unido a la existencia de patrones de integración complejos, favorece además el
silenciamiento post-transcripcional por un mecanismo llamado co-supresión, en el que la
formación de moléculas de ácido ribonucleico (ARN) de doble cadena resulta en la degradación
específica de moléculas de ARN homólogas (Soosaar et al., 2005).
46
Resultados y Discusión
Figura 9. Expresión estable de la β-glucuronidasa en segmentos de hojas tomadas de 24 líneas
de banano cv. `Grande naine´ (Musa AAA) posiblemente transformadas mediante A.
tumefaciens con el vector pFAJ3000.
47
Resultados y Discusión
4.3.1. Análisis molecular de plantas regeneradas
A partir de los resultados observados, se analizó mediante PCR la presencia de los genes nptII
y uidA en las 24 líneas anteriores (Figura 10).
500 bp
609 pb
700 bp
600 bp
Figura 10. Electroforesis en gel de agarosa al 1,5% (m/v) del producto de PCR realizado
con el ADN extraído a partir 24 líneas posibles transformadas del cv. `Grande naine’ (AAA).
Amplificación utilizando cebadores específicos de un fragmento de 488 pb del gen nptII (PCR 1)
y de un fragmento de 609 pb del gen uidA (PCR 2). C-, plantas sin transformar; C+, plásmido
pFAJ3000 empleado en la transformación; H2O en lugar de ADN; PM, patrón de masa
molecular O´Range RulerTM 100 bp DNA Ladder Plus (Fermentas, Alemania). Se señalan las
bandas del patrón de peso molecular más cercanas al fragmento amplificado.
Se detectaron 16 líneas positivas (66,7%) para la amplificación de los fragmentos de los genes
nptII y uidA y la expresión en hojas de la β-glucuronidasa. Por otro lado, las líneas 2, 3 y 4,
fueron negativas (12,5%) para los dos PCR y la tinción, por lo que constituyen escapes del
proceso selectivo. Las líneas 1 y 16 fueron positivas para la amplificación de los dos genes, sin
embargo no mostraron actividad GUS, probablemente debido a que el ADN-T se insertó en una
48
Resultados y Discusión
región transcripcionalmente inactiva de la cromatina de las células vegetales, en cuyo caso
sería un escape del proceso de selección, o a la ocurrencia de silenciamientos provocados por
la inserción de múltiples copias del transgén. Otra explicación pudiera ser la ocurrencia de una
deleción hacia el borde derecho que evite la expresión de la actividad GUS sin afectación en la
secuencia que es amplificada por PCR.
Por otra parte, la línea 7 fue positiva para la amplificación de uidA y la tinción, sin embargo no
mostró amplificación del segmento de nptII, por lo que puede ser considerada un escape del
proceso de selección. Contrariamente, las líneas 8 y 15 fueron positivas a nptII y negativas a
uidA y tinción GUS. Esto puede deberse a la pérdida de este último gen durante los procesos
de transferencia e integración del ADN-T.
De manera general, la frecuencia de aparición de escapes durante el proceso selectivo para
este experimento fue ligeramente mayor (16%) que la obtenida en los experimentos del acápite
anterior (11,1%), y por otros autores para iguales condiciones de selección (Arinaitwe, 2008;
Chong-Pérez et al., 2012a y b; Chong-Pérez et al., 2013).
Hasta hace poco existía el consenso de que el ADN-T se insertaba preferencialmente en zonas
activas transcripcionalmente del genoma de la planta (Chen et al., 2003). Sin embargo, esta
conclusión estaba sesgada, pues se fundaba en análisis de plantas transgénicas que habían
sido sometidas a un proceso selectivo. Mediante el estudio de las secuencias borde en plantas
de Arabidopsis transformadas no sometidas a selección, Kim et al. (2007) indicaron que la
integración del ADN-T en el genoma de la planta ocurría de manera aleatoria incluyendo las
regiones centroméricas y teloméricas. Igualmente, los sistemas de selección empleados en la
transformación genética restringen la supervivencia de las células que poseen reordenamientos
y deleciones en el ADN-T, por lo que la identificación de estos fenómenos se ha realizado
fundamentalmente mediante la secuenciación de las uniones entre el ADN-T y el genoma de la
planta.
49
Resultados y Discusión
En este trabajo se identificaron tres líneas con posibles deleciones del gen uidA ubicado cerca
del borde derecho y solo una para el gen nptII localizado cerca del borde izquierdo. Esto
coincide con lo obtenido en este trabajo para la inserción de los genes nptII y PvPGIP2.
Las condiciones de selección utilizadas en estos experimentos pueden haber favorecido la
supervivencia de las plantas con deleciones del gen nptII. Estos resultados sugieren la
existencia de modificaciones en los bordes izquierdo y derecho del ADN-T durante su
integración en Musa spp., lo que coincide con lo referido por Pérez-Hernández et al. (2006b).
No obstante, se requiere un estudio detallado de las secuencias borde en estos casos para
confirmar esta hipótesis.
A modo de conclusión, en la presente investigación se obtuvieron plantas de banano cv.
`Grande naine´ que portan el gen de la proteína inhibidora de poligalacturonasa 2 de P.
vulgaris, que podrán ser utilizadas en ensayos contra patógenos fúngicos. Además, al modificar
el tiempo de inoculación y adicionar espermidina, se logró aumentar la eficiencia del protocolo
de transformación empleado, referida como número de colonias embriogénicas obtenidas luego
de la selección. Esta variable se asocia directamente con la regeneración de plantas
transgénicas. En este experimento, debido al largo tiempo por cuestiones de tiempo e
incidencia de contaminación durante el proceso, no fue posible analizar el número de plantas
regeneradas/muestra como indicador de la eficiencia.
50
Conclusiones
1. CONCLUSIONES
1. Se obtuvieron plantas de banano cv. ´Grande naine´ (Musa AAA) que portan el gen
que codifica para el inhibidor de poligalacturonasa 2 de Phaseolus vulgaris L. con
una eficiencia de 13,16 plantas regeneradas/50 mg de células, mediante la
transformación con A. tumefaciens de suspensiones celulares embriogénicas.
2. Se detectó la presencia de los genes PvPGIP2 y nptII, obteniéndose frecuencias de
transformación de 94,4% y 88,9%, respectivamente.
3. Se determinó que el aumento del tiempo de inoculación con A. tumefaciens a 24 h en
combinación con la adición de espermidina 1 mM aumenta la eficiencia de la
transformación genética en suspensiones celulares embriogénicas del cv. `Grande
naine´.
51
Recomendaciones
6. RECOMENDACIONES
1. Corroborar la integración del gen PvPGIP2 mediante hibridación de Southern.
2. Utilizar las líneas que portan el gen PvPGIP2 en la realización de ensayos de
resistencia frente a patógenos fúngicos de Musa spp. como Mycosphaerella
fijiensis y Fusarium oxysporum f. sp. cubense RT4.
3. Comprobar el efecto de la esperimidina y el tiempo de inoculación en la
regeneración de plantas de banano cv. ‘Grande Naine’ (Musa AAA).
4. Verfificar mediante análisis de PCR inverso y secuenciación la ocurrencia de
deleciones en los ADN-T durante su inserción en el genoma de banano.
5. Dilucidar el efecto de la espermidina en la transformación genética de
suspensiones celulares embriogénicas de banano cv. ‘Grande Naine’ (Musa
AAA).
52
7. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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