Download Máster en Biomedicina y Oncología Molecular

Universidad de Oviedo
Instituto Universitario de Oncología del Principado de
Asturias
Máster en Biomedicina y Oncología Molecular
Extracción y purificación de ADN a
partir de muestras de saliva: Un avance
diagnóstico en el paciente pediátrico
Olaya Hernández Frías
Director: Fernando Santos Rodríguez
Codirectora: Ana Gutiérrez Fernández
Trabajo Fin de Máster
Certificado del tutor
D. Fernando Santos Rodríguez, Catedrático de Pediatría del Departamento
de Medicina de la Universidad de Oviedo
Dña. Ana Gutiérrez Fernández, Doctora en Biología, perteneciente al grupo
de Biología Molecular del Cáncer del Instituto Universitario de Oncología del
Principado de Asturias Obra Social Cajastur
CERTIFICAN:
Que Dª Olaya Hernández Frías, Licenciada en Biología, ha realizado bajo su
dirección el Trabajo Fin de Máster titulado: “Extracción y purificación de
ADN a partir de muestras de saliva: Un avance diagnóstico en el paciente
pediátrico” que reúne a su juicio las condiciones necesarias de originalidad y
calidad para ser admitido como Trabajo Fin de Máster de la Universidad de
Oviedo.
Y para que así conste, firma la presente certificación.
En Oviedo, a 14 de julio de 2014
Fdo. Fernando Santos Rodríguez
Director del Proyecto
Fdo. Ana Gutiérrez Fernández
Co-Directora del Proyecto
1
Agradecimientos
En primer lugar me gustaría agradecer a mis directores, Fernando Santos
Rodríguez y Ana Gutiérrez Fernández, por sus consejos y ayuda durante la
realización de este trabajo, así como al equipo docente de este máster.
Además a Fernando Santos Rodríguez, responsable del área de Medicina de la
Universidad de Oviedo y responsable del laboratorio de Pediatría, por
brindarme la oportunidad de formar parte de este laboratorio y poder realizar en
él el presente trabajo.
También he de agradecer a todo el equipo investigador del laboratorio de
Pediatría, en especial a Helena Gil Peña, por tener siempre la mejor
disposición para resolverme cualquier duda.
No me puedo olvidar tampoco de los voluntarios que me permitieron obtener
muestras y que han hecho posible la realización de los ensayos.
Y por último a mis familiares y amigos, por su apoyo y compresión.
2
Índice
Resumen...................................................................................................................................... 4
Antecedentes .............................................................................................................................. 5
Objetivos .................................................................................................................................... 10
Materiales y métodos ............................................................................................................... 11
Obtención de muestras ....................................................................................................... 11
Extracción de la muestra de saliva .................................................................................... 11
Purificación el ADN y almacenaje ...................................................................................... 12
Cuantificación del ADN ........................................................................................................ 12
Análisis genético ................................................................................................................... 12
Análisis de la secuenciación ............................................................................................... 12
Resultados ................................................................................................................................. 13
Discusión ................................................................................................................................... 19
Conclusiones ............................................................................................................................. 22
Bibliografía ................................................................................................................................. 23
3
Resumen
El objetivo general de este trabajo es la puesta a punto en la práctica diaria del
laboratorio de un nuevo método de obtención de ADN a partir de muestras de
saliva. Para ello se pondrá de manifiesto su rendimiento, valorando sus
ventajas e inconvenientes respecto al método que tradicionalmente está siendo
empleado, la extracción de ADN a partir de muestras de sangre.
4
Antecedentes
Las tubulopatías son un grupo heterogéneo de enfermedades poco frecuentes,
ya que tienen una prevalencia de menos de 5 personas por cada 10.000.
Presentan una función anómala de los túbulos renales, con diversas
manifestaciones clínicas según afecte al transporte de una o varias sustancias.
Hablamos de tubulopatías primarias para referirnos a las causadas por un
origen hereditario, distinguiéndolas así de las secundarias, que son producidas
por tóxicos, fármacos u otras enfermedades.
De entre las diferentes
tubulopatías primarias este ensayo está dirigido al diagnóstico genético de la
acidosis tubular renal distal (ATRD) y los raquitismos hipofosfatémicos.
La ATRD se caracteriza por: acidosis metabólica hiperclorémica con anión gap
normal, normo o hipopotasemia, pH urinario mayor de 5,5, excreción urinaria
de acidez titulable disminuida, hipercalciuria y/o hipocitraturia y filtrado
glomerular, al menos inicialmente, conservado. Los síntomas suelen aparecer
en edad temprana en forma de vómitos, deshidratación y retraso en el
crecimiento, aunque las primeras manifestaciones pueden estar presentes
desde las primeras semanas de vida. La ATRD puede ser autosómica
dominante o autosómica recesiva estando esta última asociada a sordera
nerviosa en algunas ocasiones. La ATRD autosómica recesiva se manifiesta en
los primeros meses de vida, cursa con nefrocalcinosis y sordera temprana o
tardía asociándose con mutaciones en los genes ATP6V1B1 y ATP6V0A4
respectivamente. También se han registrado casos de ATRD recesiva con
mutaciones en el gen SLC4A1. La ATRD autosómica dominante es menos
severa y aparece en la adolescencia o en la etapa adulta, y puede o no
presentar nefrocalcinosis. El gen involucrado en la ATRD autosómica
dominante es también el gen SLC4A12, 3.
Los pacientes con raquitismo hipofosfatémico presentan una amplia variedad
fenotípica. El subtipo más común se asocia a una aparición precoz de retraso
de crecimiento, deformidad de extremidades inferiores y lesiones radiológicas
de raquitismo. Otros síntomas menos frecuentes y tardíos son: dolores óseos,
5
defectos dentarios secundarios a caries y abscesos dentales1. Estas patologías
están causadas por un defecto en la reabsorción tubular renal de fosfato
inorgánico, relacionado con mutaciones en cuatro genes: PHEX (patrón de
herencia dominante ligado al cromosoma X), FGF23 (patrón autosómico
dominante), DMP1 (patrón
autosómico
autosómico
manifestaciones
recesivo
y
recesivo)
clínicas
y
SLC34A3
de
(patrón
raquitismo
con
hipercalciuria).
Dado que las tubulopatías primarias tienen carácter hereditario son
enfermedades que suelen debutar en la infancia o adolescencia, y cuyo
diagnóstico y tratamiento precoz mejora significativamente el pronóstico y
calidad de vida del paciente. El análisis genético de un paciente con sospecha
clínica de una tubulopatía será determinante para su correcto diagnóstico.
Renaltube (www.renaltube.com), es un portal clínico online cuyo objetivo es
mejorar el conocimiento de las tubulopatías primarias a través de la creación de
una base de datos clínica y molecular de pacientes afectados por alguna
tubulopatía primaria. La disponibilidad y análisis de esta información permitirá
mejorar significativamente los criterios diagnósticos y, en definitiva, un mejor
manejo clínico de estas enfermedades4. Además, Renaltube ofrece la
posibilidad de realizar el análisis genético a aquellos casos en los que la
sospecha clínica no haya sido confirmada aún a nivel molecular.
Al tratarse de un proyecto internacional en el que pueden participar
profesionales médicos aportando casos desde cualquier lugar del mundo, es
preciso que los interesados realicen el envío de una muestra de ADN del
paciente al laboratorio encargado de su análisis. Sin embargo, en muchas
ocasiones el remitente no dispone de un método para la extracción de ADN y
se ve obligado a enviar una muestra de sangre para que el ADN sea extraído
en el laboratorio de destino. El manejo y envío de muestras de sangre, supone
un auténtico problema para el médico debido al paso de las muestras por
aduanas, donde pueden ser retenidas. Asimismo, supone una dificultad para
el técnico receptor de la muestra, ya que la conservación de la sangre tras un
viaje de varios días sin las condiciones adecuadas de preservación y
6
anticoagulación pueden afectar a la posterior integridad de la muestra de ADN,
resultando inútil para su análisis genético.
Debido a la necesidad de buscar fuentes alternativas a las muestras de sangre
cuando los casos están geográficamente muy dispersos, a que el paciente
pediátrico es reacio al pinchazo necesario para la obtención de una muestra de
sangre y a que se precisa personal especializado para la extracción de sangre
en niños pequeños, se planteó la posibilidad de obtener ADN de otras muestras
biológicas.
La saliva es un fluido biológico complejo con múltiples aplicaciones que ha ido
ganando importancia en los últimos tiempos como alternativa a otros análisis
más invasivos. Tiene usos diagnósticos en enfermedades hereditarias,
autoinmunes, infecciosas, cancerígenas o desórdenes endocrinos, y también
es útil para valorar y monitorizar niveles de medicamentos o drogas gracias al
análisis de su composición química y celular5. Pero además de utilizarse para
este cometido, también se ha demostrado que contiene cantidades importantes
de ADN que puede ser utilizado para la realización de estudios genéticos.
Estas características permiten que sea una herramienta útil tanto en clínica,
como en investigación y en la práctica forense6, 7.
Existen numerosos métodos de recolección, como por ejemplo
hisopos
bucales, enjuagues bucales… Pero estos solo permiten recoger pequeñas
muestras de tejido, consiguiendo por tanto pequeñas cantidades de ADN, que
no resultan suficientes para nuestras necesidades8.Sin embargo, existen kits
comerciales preparados para recolectar muestras de saliva que nos podrían
permitir obtener cantidades suficientes de ADN con la calidad necesaria para
su posterior análisis genético, con un resultado comparable al obtenido de
extracción de ADN a partir de sangre9.
Uno de los kits presentes en el mercado para la obtención ADN a partir de
saliva es DNA Genotek®, presente en diversas publicaciones e incluso en
trabajos con secuenciación masiva9. Esta casa comercial ofrece diferentes kits
para la recolección de muestras de saliva para fines de investigación:
7
Oragene•DNA (OG-500), Oragene•DNA (OG-575) y Oragene•DNA (OG-250).
En niños es más adecuado el kit Oragene•DNA (OG-575) ya que en los otros
kits el sujeto que tiene que escupir, mientras que con este se recoge la saliva
por medio de una esponja.
La media de la cantidad de ADN extraído tras procesar los leucocitos de la
sangre es de 28,4 µg para un volumen de 2ml de sangre, mientras que de 3 ml
de saliva la cantidad media que se obtiene es de 34,91 µg de ADN, que
proviene principalmente de las células escamosas del epiteliobucal10.Sin
embargo, esto no es un factor limitante ya que se puede obtener una muestra
del volumen suficiente que se precise. Además esta técnica nos plantea una
serie de ventajas por las que ha de ser tenida en cuenta como una buena
opción a la extracción de sangre.
Una de las principales ventajas de este método respecto a la tradicional
extracción de sangre es que la veno-punción, puede causar dolor o fobia al
sujeto de estudio, presenta cierto riesgo de infección y con el añadido del
requerimiento de personal cualificado. Sin embargo, la extracción de una
muestra de saliva es un método de recolección no invasivo que resulta inocuo,
por lo que tiene mayor aceptación entre los pacientes pediátricos,
10
, no
requiere de personal especializado y los pacientes pueden obtener por sí solos
la muestra siguiendo las instrucciones del kit recolector9. Debido a esto también
se ve reducido el coste del procedimiento.
Es además de gran ventaja la facilidad de envío que supone una muestra de
saliva respecto al envío de muestras de sangre11, ya que no se requieren
condiciones especiales y pueden ser enviadas por sistema postal estándar y
las muestras llegan con la calidad necesaria para su posterior estudio.
No obstante, hay que analizar sus posibles desventajas, como un menor
rendimiento del ADN y la contaminación de la muestra con ADN bacteriano9 ya
que la saliva, a diferencia de la sangre, no es un fluido estéril.
8
En cuanto a la contaminación con ADN bacteriano con los kits de Oragene® ha
sido estimado que solo el 11,8% del ADN total es de origen bacteriano, siendo
por tanto el restante 88,2% de origen humano12.
Respecto al rendimiento del método, aunque hasta la fecha no es común el
empleo de esta técnica en investigación clínica, y la muestra de sangre sigue
siendo el método de elección, numerosos artículos han podido demostrar que
los resultados que ofrece son comparables a los obtenidos mediante una
muestra de sangre8,
9, 13
, siendo por tanto una alternativa válida. También ha
resultado ser un método adecuado en investigaciones para la secuenciación de
todo el genoma, en los que la calidad del ADN es crítica, demostrando
resultados semejantes a los de las muestras de sangre14. Incluso, se ha
demostrado que estas muestras, antes de realizar la purificación, pueden estar
al menos 8 meses almacenadas a temperatura ambiente sin que afecte ni a la
cantidad ni calidad del ADN, es decir, que los reactivos del kit son capaces de
mantener estable la muestra sin degradación del ADN10.
En la tabla 1 se resumen las características del kit en comparación de con
diferentes métodos de recolección:
Tabla 1. Comparación de diferentes métodos de obtención de muestras de ADN.
Método
Sangre
venosa
Enjuague
bucal
Hisopos
bucales
Oragene•DNA
(OG-575)
Recolección no invasiva
✘
✘
✔
✔
Formato estandarizado para
procesamientos de alto rendimiento
(NGS)
✔
✘
✘
✔
Estabilidad de la muestra a
temperatura ambiente
Días
Semanas
Días
Años
Bajo contenido en bacterias
✔
✘
(más de 60%)
✘
(más de
90%)
Rendimiento medio del ADN
30 µg
35 µg
2 µg
Tamaño de la muestra
1 ml
10 ml
1 algodón
Peso molecular
> 23 kb
> 23 kb
< 23 kb
Envío a temperatura ambiente
✘
✔
✔
✔
Ideal para donantes poco
colaboradores
✘
✘
✘
✔
15
9
15
✔
(media 6.8%)
17.3 µg
16
0.75 ml
> 23 kb
16
Objetivos
El objetivo principal de este trabajo fue poner a punto la técnica de obtención
de ADN de saliva empleando un kit comercial, Oragene•DNA (OG-575).
Objetivos secundarios:
Conocer si el ADN extraído cumple las características que la casa comercial
señala y responde a los requisitos necesarios para el estudio genético de las
tubulopatías primarias.
10
Materiales y métodos
Obtención de muestras
Se utilizaron muestras de saliva de 7 individuos control y 8 pacientes, siendo 5
estas muestras de pacientes de origen internacional, en concreto de Argentina.
Todos los sujetos de estudio, o en su caso de su representante legal
autorizado, dieron su consentimiento informado para la investigación genética
antes de la recogida de la muestra biológica humana.
Extracción de la muestra de saliva
Los participantes en estudio proporcionaron
la muestra de saliva usando el kit de
recolección Oragene•DNA (OG-575) (DNA
GenotekInc, Cánada) (figura 1) de acuerdo
con
las
instrucciones
del
fabricante17,
consistentes en la fricción de una esponja
por el interior de las mejillas y encías
absorbiendo la mayor cantidad de saliva
Figura 2. Presentación del kit empleado,
Oragene•DNA(OG-575).
posible y recogiéndola posteriormente en el tubo preparado para esta función.
Es necesario que el sujeto de estudio no haya comido, bebido o fumado en los
30 minutos previos a la toma del a
muestra.
Una vez finalizado se cierra una tapa
que contiene un líquido estabilizante
que caerá sobre la muestra. Por
último se cambia esta tapa por el
tapón para cerrar el tubo y se
Figura 1. Esquema de
las instrucciones para la
extracción de la muestra
de saliva con el kit
Oragene•DNA (OG-575).
mezcla por inversión varias veces
(figura 2). Tras estos sencillos pasos
la muestra ya está lista para su
envío y posterior purificación en el
11
laboratorio de destino.
Purificación el ADN y almacenaje
Tras la recepción de las muestras se lleva a cabo la purificación del ADN. El
fabricante de este kit facilita dos protocolos según el volumen de la muestra
que vaya a ser purificada. Uno de los protocolos es para un volumen de 0,5 ml
y el otro para la muestra entera. Partiendo de las pautas que nos facilitan se
llevaron a cabo diferentes ensayos para adecuar el protocolo al equipo
disponible en nuestro laboratorio y lograr el máximo rendimiento de las
muestras.
Cuantificación del ADN
Tras la purificación, se cuantificó tanto la concentración de ADN como su
calidad analizando en 2 µl de la muestra y con el equipo DeNovix® DS-11
Spectrophotometer, los valores de la absorbancia a A260/280 y A260/230.
Análisis genético
El análisis genético se realizó mediante PCR convencional y secuenciación de
Sanger. Tanto los primers del gen ATP6V0A4 de la ATRD los primers para el
gen
PHEX
del
raquitismo
hipofosfatémico
fueron
suministrados
por
InvitrogenTM. La Taq polimerasa fue suministrada por EURX®. El termociclador
que se empleó fue el modelo AppliedBiosystems® 2720 ThermalCycler de
LifeTecnologiesTM.
La secuenciación automática se llevó a cabo en el equipo ABI PRISM ® 3013xl
GeneticAnalyzer de LifeTechnologiesTM.
Análisis de la secuenciación
El software empleado para la visualización de las secuencias fue el
Sequencher 5.0 y el programa de secuencia consenso fue Ensembl.org, con el
que se realizó una comparación para la búsqueda de variantes en los
amplicones de los genes analizados. La patogenicidad de las alteraciones fue
confirmada con la base de datos HGMD® mutation.
12
Resultados
Protocolo 1
Tabla 2. Análisis por espectrofotometría de las muestras purificadas mediante el protocolo.
Muestra
Edad
Concentración (ng/µl)
260/280
260/230
Cantidad de ADN (µg)
A
6 meses
217,25
1,81
0,38
10,86
B
9 años
287,8
1,8
0,45
28,78
C
25 años
205,65
1,68
1,46
41,13
D
29 años
273,3
1,56
0,93
54,66
Se extrajo con este protocolo una media de ADN de 33,86 µg, y unos ratios
medios de 260/280 y 260/ 280 de 1, 71 y 0,81, respectivamente.
Protocolo 2
Tabla 3. Análisis por espectrofotometría de las muestras purificadas mediante el protocolo.
Muestra
Edad
Concentración (ng/µl)
260/280
260/230
Cantidad de ADN (µg)
E
26 años
214,1
1,85
2,06
32,12
F
13 años
346,55
1,98
0,56
69,31
G
27 años
260,63
1,78
0,4
78,19
Se extrajo con este protocolo una media de ADN de 59,87 µg, y unos ratios
medios de 260/280 y 260/ 280 de 1,87 y 0,89, respectivamente.
Protocolo 3
En base a este protocolo se probaron otras modificaciones que para intentar
mejorar la calidad de las muestras (tabla 4).
13
Tabla 4. Análisis por espectrofotometría de las modificaciones del protocolo 3 que se estudiaron
con la finalidad de mejorar la calidad del ADN extraído.
Tratamiento
Concent
ración
(ng/µl)
26
0/2
80
26
0/2
30
Cantidad
de ADN
(µg)
Objetivo
Resultado
Protocolo 3
539,7
1,6
5
0,9
26,99
-
-
Recoger la
medusa con la
punta de la pipeta
531,3
1,7
7
1,3
4
26,57
Evaporación del
etanol de 30 min
424,15
1,6
4
0,9
4
21,21
Cloroformo entre
los pasos 7-8
523,2
1,4
4
0,6
4
26,16
Protocolo 3
584,25
1,6
3
0,7
4
58,43
Doble lavado con
o
etanol 70 C
487,6
1,6
5
0,8
3
48,76
Lavado con
cloroformo
181,2
1,8
7
1,6
5
18,12
Aumentar la
cantidad el
ADN
Eliminar las
trazas de
etanol
Eliminar las
trazas de
etanol
Valor semejante pero resultó
difícil hidratar el ADN al
secarse demasiado
-
-
Eliminar las
trazas de
etanol
Eliminar las
trazas de
etanol
Valor semejante al del
protocolo 3
No mejora el valor de ratio
Valor de semejante del ratio
260/230con pérdida de ADN
Mejora el ratio 260/230 pero
hay una gran pérdida de ADN
Hasta este estadio de la puesta a punto del procedimiento, las muestras
empleadas correspondían a voluntarios controles. Una vez establecido el
protocolo definitivo, se comenzó a realizar la extracción el ADN de posibles
pacientes y familiares de tubulopatías para su diagnóstico (tabla 5).
Tabla 5. Análisis por espectrofotometría de las muestras de pacientes purificadas mediante el
protocolo.
Muestra
Edad
Concentración (ng/µl)
260/280
260/230
Cantidad de ADN (µg)
H
3 años
417,15
1,79
1,48
83,43
I
30 años
821,1
1,76
1,02
82,1
J
30 años
224,85
1,68
1,35
44,98
Se extrajo con este protocolo una media de ADN de 70,17 µg, y unos ratios
medios de 260/280 y 260/ 280 de 1,74 y 1,28, respectivamente.
También se evaluó el rendimiento del protocolo con 5 muestras de pacientes
tras un envío internacional, ya que fueron enviadas desde Argentina (tabla 6).
14
Tabla 6. Análisis por espectrofotometría de las muestras internacionales purificadas mediante el
protocolo.
Muestra
Edad
Concentración
(ng/µl)
260/280
260/230
Cantidad
de ADN
(µg)
K
3 años
762,7
1,92
1,37
76,27
L
6 años
375,03
1,83
1,19
75,01
M
3 años
331,45
1,82
1,25
66,29
N
1 año
157,78
1,84
1,01
31,56
O
6 meses
688,33
1,98
1,58
68,84
Se extrajo con este protocolo una media de ADN de 63,59 µg, y unos ratios
medios de 260/280 y 260/ 280 de 1,88 y 1,28, respectivamente.
Tras la cuantificación de las muestras, se realizaron PCR
de todas las
muestras para comprobar el rendimiento de las mismas (figuras 3, 4, 5, 6 y 7).
También se realizó una prueba de la integridad del ADN en gel de agarosa
(figura 8). En el momento de realizar esta prueba las muestras tenían diferente
antigüedad, para comprobar la degradación con el paso del tiempo.
15
Figura 4. Imagen de las bandas tras realizar la
amplificación del exón 9 del gen PHEX correspondiente
para las muestras A, B y F.
Figura 3. Imagen de las bandas tras realizar la
amplificación del exón 3 del gen ATP6V0A4,
correspondiente para las muestras C, D, E y F. cada
muestra está realizada por duplicado
Figura 5. Arriba:
exón 18 del gen
dRTA de las
muestras A y G.
Abajo: exon 19 del
gen dRTA de las
muestras A y G.
Figura 6. Imagen de las bandas tras realizar la amplificación del
exón exón 9 del gen PHEX para las muestras: C, D, E, F, G y H (por
duplicado).
Figura 7. Imagen de las bandas tras realizar la amplificación del
exón exón 9 del gen PHEX para las muestras: I, J, K, L, M, N y O
(por duplicado).
Figura 8.Comprobación de la integridad del ADN de varias muestras
en gel de agarosa 2x.
Calle 1: D3812 DirectLoad™ 50 bp DNA StepLadder (Sigma®).
Calle 2: muestra E, ADN almacenado 9 meses.
Calle 3: muestra F, ADN almacenado 7 meses.
Calle 4: muestra I, ADN almacenado 3 meses.
Calle 5: muestra H, ADN almacenado 4 meses.
Calle 6: muestra J, ADN almacenado 4 meses.
Calle 7: muestra O, ADN almacenado 1 mes.
Adicionalmente varias muestras se sometieron a secuenciación automática.
(Figuras 9-12) para probar que no solo se obtenían buenos amplicones tras la
PCR, si no que estos también producían lecturas de secuencia buenas para su
análisis posterior.
16
Figura 9. Muestra C exón 3 del gen PHEX (lectura reverse).
Figura 10. Muestra E exón 3 del gen PHEX (lectura reverse).
Figura 11. Muestra J exón 15del gen PHEX (lectura forward).
Figura 12. Muestra J exón 15 del gen PHEX (lectura reverse).
17
Gracias a la muestra J, que corresponde a una paciente previamente
secuenciada en este laboratorio que voluntariamente nos permitió obtener una
muestra de saliva para repetir el procedimiento con este método, se pudo
reproducir el resultado, encontrando la mutación que le había sido descrita.
Figuras13 y 14. Detalle de la mutación 16+1 G<A del exón 15 del gen PHEX en la muestra J, en
lectura forward y reverse respectivamente.
18
Discusión
El presente trabajo pone de manifiesto la eficacia del uso de saliva como
alternativa a la extracción de sangre para la obtención de ADN.
Si bien es cierto que, la cantidad de ADN que se obtiene a igual volumen de
muestra de origen, es menor en el caso de la saliva con respecto a la sangre10,
existen una serie de ventajas que inclinan la balanza hacia la implementación
de la saliva como fluido de referencia para la obtención de material genético.
Para Renaltube.com, base de datos internacional de tubulopatías primarias, la
obtención de muestras de ADN desde cualquier punto del mundo se ve muy
beneficiada con la posibilidad del envío de muestras saliva en lugar de sangre
(con un mantenimiento dudoso tras varios días) o el propio ADN (en ocasiones
no se disponen en el hospital de origen de laboratorios para su extracción o la
calidad no es óptima).
Oragene•DNA (OG-575)
La casa comercial DNA Genotek®
propone dos protocolos estandarizados
para la aplicación a niños de edad más avanzada y adultos sin embargo,
aunque ya se consiguió extraer ADN mediante ambas propuestas, el equipo
disponible en nuestro laboratorio, no se ajustaba a las necesidades precisadas.
Las modificaciones que se llevaron a cabo fueron adecuadas permitiendo
obtener buenas muestras de ADN en términos de cantidad e integridad para el
posterior análisis molecular de los casos. Cabe destacar que en los casos de
lactantes, la eficacia de la extracción fue menor. Para estos casos, DNA
Genotek® propone otros kits que no fueron evaluados, como Oragene•DNA
(OG-250) que posee un accesorio adicional preparado para la extracción de
muestras de bebés y niños de corta edad17.
Valoración práctica de la calidad y cantidad del ADN
En relación a la eficiencia, pureza e integridad del ADN de forma aplicada,
observamos que las PCRs que se llevaron a cabo fueron en su mayoría
19
exitosas. Hubo tan sólo un caso en el que la extracción de ADN falló y no se
obtuvo la cantidad suficiente. El caso era un lactante de 4 meses de edad. No
obstante, se le volvió a recoger saliva a la edad de 6 meses (muestra A) y, si
bien es cierto que la cantidad de ADN conseguida es inferior con respecto al
resto de muestras, esta limitación tal vez podría solventarse extrayendo un
volumen de saliva mayor (experimentos no realizados).
Estabilidad y preservación del ADN
Para valorar la estabilidad del ADN, se corrieron muestras contenedoras de
misma cantidad de ADN en un gel de agar (Figura 8). Las calles presentan
poco barrido y se ve una banda de alto peso molecular clara y bien definida,
que corresponde a la banda de ADN. Por ello podemos considerar que existió
poca degradación del ADN transcurridos hasta 9 meses desde su obtención.
Aplicación a la secuenciación de Sanger
Con el fin de comprobar que la extracción de ADN a partir de saliva cumple con
todos los requisitos para representar una alternativa práctica a la extracción de
sangre, se secuenciaron exones amplificados de algunos casos (Figuras 9-12).
Además, la paciente J, con ADN obtenido previamente a partir de sangre y
secuenciado, revelando la presencia de una mutación descrita en el gen PHEX,
nos proporcionó una muestra de saliva para repetir todo el proceso mediante
este método. El resultado fue una secuencia limpia y clara, mostrando de forma
evidente la mutación que porta la paciente.
20
El presente y el futuro
Nuestro trabajo pone de manifiesto la importancia de tener una buena base de
material genético a la hora de desarrollar un estudio molecular en la práctica
diagnóstica. El paso hacia el uso de la saliva, dejando a un lado la práctica
conservadora de la extracción de ADN a partir de muestra de sangre, supone
un avance significativo en comodidad, rapidez y eficacia. Para nuestro equipo
de laboratorio de análisis genético vinculado a Renaltube y encargado de
evaluar el espectro mutacional de los pacientes con ATRD y/o raquitismos
hipofosfatémicos, procedentes de cualquier lugar del mundo, supone un
avance sin comparación ya que las muestras de saliva son capaces de
soportar un envío internacional y mantener íntegro el rendimiento y la
integridad de su ADN. Esta afirmación queda constatada a través de las
muestras (K-O), procedentes de Argentina y en las que se empleó este kit,
cuyos contenedores previamente les remitimos. De estas muestras se
extrajeron cantidades adecuadas de ADN y con buenos grados de pureza
(Tabla 6), y se comprobó que se podían realizar PCR con éxito (Figura 7).
Nuestra propuesta tiene la ventaja de que elimina los gastos derivados del
proceso de extracción de sangre como son: la necesidad de personal
especializado para la extracción de la muestra, profesionales de laboratorio
para la obtención del ADN y todo el proceso intermedio dependiente de
volantes entre la consulta, servicio de enfermería y laboratorio de genética. Si
bien es cierto que estos costes no se han evaluado con detalle, cabe suponer
que, el hecho de que la recogida de la muestra no requiera personal
especializado, abarataría los costes sustancialmente.
Hemos de tener presente la limitación que presentan estos kits, en el caso de
pacientes lactantes, fenómeno que habrá que solventar mejorando la
metodología con este tipo de kit o solicitando el otro kit específico para los
pacientes comprendidos entre este rango de edad.
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Conclusiones
Con el protocolo definitivo y a la vista de los resultados obtenidos, podemos
concluir que:
1. El sistema de obtención de ADN a partir de muestras de saliva, además de
solventar diversos inconvenientes presentes en la obtención de ADN a partir de
muestras de sangre, es un sistema válido para la práctica del laboratorio. El
ADN obtenido es apropiado para el estudio genético por secuenciación Sanger.
2. Se trata de un método simple y de bajo coste.
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