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Titulo del proyecto
Amplificación y secuencia del gen nodA de especies nodulantes del
género Burkholderia, determinación de su presencia en distintas
especies de Burkholderia y análisis de la capacidad para formar nódulos
en Mimosa pigra
Resumen
El género Burkholderia se encuentra constituido por 5 especies que son
capaces de nodular plantas leguminosas, B. mimosarum, B. nodosa, B.
tuberum, B. phymatum y B. caribensis. Aunado a estas especies, se han
descrito otras mas con la habilidad para llevar a cabo la fijación
biológica de nitrógeno, sin embargo, se desconoce si éstas son capaces
de nodular. El análisis de la secuencia del gen nodA, perteneciente a
algunas especies nodulantes de Burkholderia así como otros géneros
nodulantes,
fue
comparada
conduciendo
al
diseño
de
tres
oligonucleótidos específicos. El gen nodA junto con los genes nodBC se
encuentran involucrados en la producción de la estructura central de
los factores Nod que actúan como moléculas señal para la nodulación de
leguminosas específicas. El análisis de 4 especies nodulantes de
Burkholderia mostró una banda de amplificación correspondiente al
tamaño esperado del gen nodA en tres de ellas y la secuencia de los
fragmentos fue identificada como perteneciente al gen nodA. El análisis
de alrededor de 50 cepas de Burkholderia (fijadoras o no de nitrógeno)
mostró amplificación en algunas de ellas, sin embargo, la secuencia de
los fragmentos amplificados no correspondió al gen nodA, excepto para
dos cepas de Burkholderia sp., las cuales, fueron aisladas de nódulos
de Mimosa pigra. La secuencia de estas dos cepas fue enviada a la base
de datos GenBank del NCBI (Nacional Center for Biotechnology Institute)
y serán liberadas el 1 de febrero del 2009.
Los ensayos de nodulación in Vitro fueron ampliados utilizando, además
de M. pigra, un mayor número de especies de leguminosas con el fin de
conocer el rango de hospedero de las especies de Burkholderia. Las
plantas leguminosas, 14 especies de plantas, fueron inoculadas
independientemente con B. mimosarum PAS44, B. nodosa BR3437 y
Burkholderia sp. MPA6.4 Los resultados mostraron que Leucaena sp. fue
nodulada por las tres cepas de Burkholderia, en tanto que Mimosa sp.
solo por B. nodosa y Burkholderia MPA6.4. Prosopis laevigata fue
nodulada por Burkholderia MPA6.4, Acacia cochliacantha por B. nodosa y
Gliciridia sepium por B. nodosa y B. mimosarum. No obstante, los
nódulos obtenidos fueron muy pequeños y blancos, sugiriendo la
inexistencia de la fijación de nitrógeno. Desafortunadamente, las
plantas de Mimosa pigra murieron al final del experimento por lo que no
pudo ser determinada la capacidad de nodulación por las distintas
especies de Burkholderia analizadas. Los ensayos de nodulación en
planta requieren ser repetidos para confirmar los resultados obtenidos,
los cuales, muestran presuntivamente que las especies de nodulantes de
Burkholderia tienen un rango de hospedero mayor a lo conocido
actualmente. Además, la incapacidad para amplificar el gen nodA en B.
nodosa, así como, demostrar su presencia mediante análisis de
hibridación sugieren la presencia de un sistema de nodulación que no
implica los genes nodABC.
Introducción
Durante mucho tiempo se creyó que las bacterias capaces de nodular las
raíces de plantas leguminosas se restringían a los géneros contenidos
en el grupo de las alfa proteobacterias (rhizobios). Sin embargo, en el
2001 se reportó que dos especies de Burkholderia, género perteneciente
a las beta proteobacterias, fueron aisladas de nódulos de plantas
leguminosas (Moulin et al.). Actualmente, existen 5 especies descritas:
B. tuberum, B. phymatum, B. nodosa, B. mimosarum y B. caribensis.
Consecuentes estudios sobre las poblaciones de bacterias encontradas en
nódulos de distintas especies de Mimosa han mostrado la predominancia
de cepas del género Burkholderia (Chen et al. 2005). Particularmente,
un 96 % de cepas aisladas de M. pigra pertenecen a Burkholderia.
Por otro lado, existe un gran número de especies fijadoras de nitrógeno
dentro del género Burkholderia que han sido aisladas de plantas
distintas a las leguminosas (Estrada-de los Santos et al. 2001,
Caballero-Mellado et al. 2004, Reis et al. 2004, Perin et al. 2006,
Caballero-Mellado et al. 2007). Sin embargo, su capacidad, para nodular
plantas leguminosas no ha sido determinada así como tampoco la
presencia de los genes para llevar a cabo la nodulación.
La nodulación de las plantas leguminosas llevada a cabo por los
rhizobios es controlada por un grupo de genes denominados nod (Debelle
et al. 2001). Entre los genes nod los nodABC se encuentran involucrados
en la producción de la estructura central de los factores Nod que
actúan como moléculas señal para la nodulación de plantas leguminosas
específicas. La secuencia del gen nodA ha sido utilizada para realizar
análisis filogenéticos sobre la posibilidad de un transferencia
horizontal de la capacidad para nodular plantas leguminosas de los alfa
rhizobios a los beta rhizobios. Un análisis de la secuencia de este gen
ha mostrado que las especies nodulantes de Burkholderia se entremezclan
con las especies nodulantes de los alfa rhizobios en un árbol
filogenético (Chen et al. 2003), lo cual implica probablemente un
intercambio genético entre ambos grupos bacterianos.
Es posible que en el ambiente del suelo se esté llevando a cabo esta
transferencia de información genética por lo que es probable que
bacterias fijadoras o no de nitrógeno puedan adquirir también los genes
para la nodulación.
En este proyecto de investigación se pretende analizar la presencia del
gen nodA en especies fijadoras y no fijadoras de nitrógeno del género
Burkholderia que en su mayoría no fueron aisladas de plantas
leguminosas.
Métodos y Materiales
Diseño de oligonucleoótidos específicos para la amplificación del gen
nodA y condiciones de la PCR.
Las secuencias del gen nodA de las especies nodulantes de Burkholderia
fueron
obtenidas
en
la
base
de
datos
del
NCBI
(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/): B. caribensis TJ182 (AJ505309), B.
phymatum STM815T (NZ-AAUG01000025) y NGR195A (DQ888211), B. mimosarum
PAS44T (AY883419) y B. tuberum STM678T (AJ302321). También se utilizaron
las secuencias del gen nodA de Cupriavidus taiwanensis LMG19424
(AJ505311), Bradyrhizobium USDA3517 (AJ430708), Rhizobium tropici
(X98514), Sinorhizobium melilloti 1021 (AE007237), R. leguminosarum
3841 (AM236080), Mesorhizobium huakuii RA5 (AJ300243) y R. etli p42
(NC_004041).
La comparación de las secuencias se realizó utilizando el programa
ClustalW (http://align.genome.jp/) y el diseño de los oligonucleótidos
fue
realizado
manualmente
comprobando
las
características
fisicoquímicas en el programa Vector NTI (Invitrogen).
Las condiciones para llevar a cabo la PCR fueron las siguientes: un
ciclo de 5 min a 95 °C; 1 min a 95 °C, 1 min a 57 °C y 1 min a 72 °C
durante 30 ciclos y finalmente un ciclo de extensión de 10 min a 72 °C.
La mezcla para la PCR fue en un volumen de 25 μL con las siguientes
cantidades de reactivos: 13.3 μL agua Mili Q,5 μL buffer 5X, 0.5 μL
dNTP’s 10 μM, 2.5 μL inciador 1 y 2 5 μM, 0.5 μL ADN (50 ng) y 0.2 μL
GoTaq 5 U/μL (Promega).
Determinación de la secuencia del gen nodA
Los fragmentos amplificados fueron clonados en el vector pCR2.1
siguiendo las instrucciones de la casa comercial (TA cloning kit,
Invitrogen). Una vez clonados se utilizaron los iniciadores universales
M13F y M13R para obtener la secuencia del fragmento en el secuenciador
ABI Prism 3130 (Applied Biosystems). La secuencia obtenida fue
analizada en la base de datos del NCBI utilizando el programa BlastX
(Basic Local Alignment Search Tool) en el cual la secuencia
nucleotídica en análisis es traducida a secuencia de aminoácidos y
comparada en la base de datos de aminoácidos.
Ensayos de inoculación en planta
Los ensayos de inoculación en planta se realizaron en el Centro de
Ciencias Genómicas, UNAM, para lo cual se realizaron dos estancias de
investigación. Las especies de plantas leguminosas utilizadas fueron:
Conzattia
multiflora,
Zysiloma
tergeminum,
Acacia
cochliacantha,
Gliciridia
sepium,
Leucaena
sp.,
Lysiloma
acapulcense,
Acacia
bilimekii, Acacia coulteri, Mimosa sp., Mimosa pigra, Senna wislizeni,
Piscidia piscipula, Prosopis leavigata y Senna skinerii. Las plantas
fueron cultivadas en dos tipos de soporte, arena de río y vermiculita,
a continuación se detalla el desarrollo de ambos experimentos.
Ensayo en arena de río
Tubos de ensayo de 25x200 mm fueron llenados con 60 gr de arena de río,
11 ml de solución de Fahraeus y estrilizados tres veces durante 20
minutos. La composición de la solución de Fahraeus en g/L fue de:
Na2HPO4 0.15, KH2PO4 0.1, CaCl2 0.1, MgSO47H2O 0.12, citrato Fe 0.005,
oligoelementos 1.0 mL y ajustando a un pH de 6.3. La composición de la
solución de oligoelementos en g/L fue de: H3BO3 2.86, MnSO4 2.03, ZnSO4
0.22, CuSO4 0.08 y Na2MoO4 0.08.
Las semillas de las plantas leguminosas fueron escarificadas con H2SO4
concentrado siguiendo los tiempos indicados en la Tabla 1.
Tabla 1. Tiempo de escarificación de las semillas de leguminosa.
Especie de leguminosa
Tiempo Escarificación
1. Conzattia multiflora*
15’
2. Zysiloma tergeminum
15’
3. Acacia cochliacantha*
15’
4. Gliciridia sepium
15’
5. Leucaena sp.
15’
6. Lysiloma acapulcense
15’
7. Acacia bilimekii
15’
8. Acacia coulteri
15’
9. Mimosa sp.
5’
10. Senna skinerii
5’
11. Senna wislizeni
5’
12. Piscidia piscipula
5’
13. Prosopis leavigata
5’
14. Mimosa pigra
5’
* Semillas lijadas previamente a la escarificación. Se escarificaron
semillas por especie de leguminosa.
15
Las semillas escarificadas se colocaron en placas petri conteniendo
agar-agua (1.5 g/L) y se incubaron a 28-30 °C hasta su germinación (2-3
días). Una vez germinadas, las semillas fueron sembradas en los tubos
conteniendo arena de río y solución de Farhaeus. Las semillas
germinadas fueron inoculadas con 1 mL de una suspensión bacteriana de
las especies B. mimosarum PAS44 y B. nodosa Br3437. Previamente, las
cepas bacterianas fueron inoculadas en un medio de cultivo líquido
conteniendo manitol como fuente de carbono (Composición en g/L: K2HPO4
0.5, NaCl 0.1, MgSO47H2O 0.2, manitol 5.0, extracto de levadura 0.4 g,
pH 6.8) e incubadas en agitación durante la noche a 30 °C. La
suspensión bacteriana fue preparada lavando las células con MgSO47H2O 10
mM y resuspendidas a una densidad óptica de 0.2. Los tubos fueron
cubiertos con papel hasta el nivel de la arena de río para proteger a
las raíces de la luz y fueron transferidas al invernadero con
condiciones de temperatura controlada. Las plantas fueron incubadas
durante 41 días.
Ensayo en vermiculita
Tubos de ensaye de 25x200 mm fueron llenados con 7 gr de vermiculita,
20 mL de solución de Farhaeus y esterilizados 3 veces durante 20
minutos. El experimento se desarrolló del mismo modo que los tubos con
arena de río pero las plantas fueron dejadas en el invernadero por un
periodo de 45 días.
Resultados
El análisis del alineamiento de las secuencias nodA condujo al diseño
de los oligonucleótidos CBG3, CBG4 y CBG5. En la posición 13-32 del gen
nodA de B. caribensis (AJ505309) se diseñó el iniciador forward CBG3
(5’-TGGGAAAATGAKCTTSAACT-3’), en la posición 1-20 el iniciador forward
CBG4 (5’-TGGAGRSTRTGYTGGGAAA-3’) y en la posición 556-575 el iniciador
reverso CBG5 (5’-TCACAGCTCNGGBCCGTT-3’). El fragmento amplificado
esperado fue de aproximadamente 550 pb.
El ADN aislado (Wizard Genomic DNA purification kit, Promega) de las
especies nodulantes de Burkholderia: B. tuberum STM678, B. phymatum
STM815, B. mimosarum PAS44 y B. nodosa BR3437, fue utilizado como
control positivo para analizar la especificidad de los iniciadores
diseñados.
La
combinación
de
iniciadores
CBG3
x
CBG5
mostró
amplificación de una banda de aproximadamente 550 pb correspondiente al
gen nodA en la especie B. phymatum. La combinación de los iniciadores
CBG4 x CBG5 mostró amplificación con las especies B. tuberum, B.
phymatum y B. mimosarum, aunque en esta última la amplificación no fue
consistente en repetidos experimentos de la PCR. La modificación en las
condiciones de amplificación no condujo a la amplificación del gen nodA
de la especie B. nodosa, sugiriendo dos cosas: la secuencia del gen
nodA es muy diferente por lo que los iniciadores diseñados no logran
amplificar el fragmento o el sistema para llevar a cabo la nodulación
no implica el uso de factores nod, como se ha reportado en dos cepas
fotosintéticas de Bradyrhizobium (Giraud et al. 2007).
La especificidad de los iniciadores para amplificar el gen nodA fue
corroborado mediante el análisis de la secuencia. Para llevar a cabo
este objetivo los fragmentos fueron clonados, secuenciados y analizados
en la base de datos (NCBI). El resultado mostró que las secuencias
pertenecían al gen nodA con un porcentaje de identidad: 80 % para B.
mimosarum, 98 % para B. phymatum y 95 % para B. tuberum.
Posteriomente, alrededor de 50 cepas de Burkholderia pertenecientes a
varias
especies
fueron
analizadas
con
la
combinación
de
los
oligonucleotidos CBG3 x CBG5 y CBG4 x CBG5. Las cepas tipo de B.
cenocepacia, B. phytofirmans, B. sacchari, B. ferrariae, B. hospita,
Burkholderia sp. MPA2.1a y Burkholderia sp. MPA6.4 mostraron una banda
de amplificación correspondiente al tamaño esperado. No obstante, la
amplificación de las bandas no fue consistente en diferentes
repeticiones de la PCR. Las bandas amplificadas fueron clonadas y
secuenciadas y la secuencia fue comparada en la base de datos NCBI. Los
resultados mostraron que las secuencias no correspondían al gen nodA,
excepto para las cepas Burkholderia sp. MPA2.1a y MPA6.4. La secuencia
de estas dos cepas mostró un porcentaje de identidad con el gen nodA de
82 para ambas secuencias y serán liberadas en la base de datos del NCBI
el 1 de febrero del 2009. El número de acceso para el gen nodA de
Burkholderia sp. MPA2.1a es EU420073 y para la Burkholderia sp. MPA6.4
EU420074.
Una elevación de dos grados en la temperatura de alineamiento de los
iniciadores fue suficiente para eliminar el pegado inespecífico en el
ADN de las cepas de Burkholderia analizadas.
Dada la imposibilidad para amplificar el gen nodA de B. nodosa así como
para corroborar que las cepas de Burkholderia analizadas no poseían el
gen nodA, el ADN de todas la cepas fue hibridado mediante DotBlot
utilizando como sonda el gen amplificado nodA de B. phymatum. La
hibridación se realizó utilizando un método no radioactivo siguiendo
las instrucciones de la casa comercial (DIG High Prime DNA Labeling and
Detection Starter Kit II, Roche). Los resultados mostraron una señal de
hibridación con el control positivo, B. phymatum, así como con B.
xenovorans CAC124 y B. vietnamiensis SXo-702. La señal de hibridación
con B. xenovorans y B. vietnamiensis probablemente se debió a que
existe un porcentaje de similitud entre las secuencias del gen nodA
pero la región donde los oligonucleótidos fueron diseñados no es una
posición conservada en la secuencia de éstas dos cepas. Sin embargo,
las especies nodulantes B. nodosa y B. tuberum no mostraron señal de
hibridación. En el caso de B. nodosa se podría sugerir que la falta de
señal de hibridación se debe a que posee un sistema de nodulación
diferente que no involucra el gen nodA como es el caso de
Bradyrhizobium, mencionado anteriormente. En el caso de B. tuberum,
podría tratarse de un artefacto ya que la comparación de la secuencia
nucleotídica del gen nodA de B. tuberum y B. phymatum obtenida en esta
investigación mostró un 75 % de similitud. Para corroborar estos
resultados sería necesario repetir los ensayos de hibridación.
Las cepas tipo de B. mimosarum y B. nodosa fueron seleccionadas para
realizar ensayos de inoculación en 14 especies diferentes de
leguminosas. Las plantas cultivadas en arena de río no mostraron la
formación de nódulos en sus raíces por lo que se asumió que el soporte
utilizado presentaba una influencia negativa para la nodulación. La
arena de río es un material de consistencia muy rígida. No obstante, el
experimento fue repetido utilizando como soporte la vermiculita cuya
consistencia es más suave. En esta ocasión las plantas leguminosas se
inocularon con B. mimosarum, B. nodosa y Burkholderia MPA6.4. Los
resultados mostraron que Leucaena sp. fue nodulada por las tres cepas
de Burkholderia, en tanto que Mimosa sp. solo por B. nodosa y
Burkholderia MPA6.4. Prosopis laevigata fue nodulada por Burkholderia
MPA6.4, Acacia cochliacantha por B. nodosa y Gliciridia sepium por B.
nodosa y B. mimosarum. No obstante, los nódulos obtenidos fueron muy
pequeños, blancos y en un número muy pequeño (1 a 5 nódulos por
planta), lo cual, sugeriría que no estaban llevando a cabo la fijación
de nitrógeno. Desafortunadamente, las plantas de Mimosa pigra murieron
al final del experimento por lo que no pudo ser determinada la
capacidad de nodulación por las distintas especies de Burkholderia
analizadas. Los ensayos de nodulación en planta requieren ser repetidos
para
confirmar
los
resultados
obtenidos,
los
cuales,
muestran
presuntivamente que las especies de nodulantes de Burkholderia tienen
un rango de hospedero mayor a lo conocido actualmente. Sin embargo, es
importante mencionar que dada la característica de los nódulos no se
podría afirmar que la nodulación en estas plantas sea efectiva en
términos de fijación de nitrógeno. Además, tanto la incapacidad para
amplificar el gen nodA en B. nodosa, así como demostrar su presencia
mediante análisis de hibridación sugieren la presencia de un sistema
alternativo para llevar a cabo la nodulación. B. nodosa fue aislada de
nódulos de Mimosa scabrella (Chen et al. 2007), y según los resultados
obtenidos durante esta investigación puede nodular Leucaena sp., Mimosa
sp., A. cochliacantha y G. sepium. Este resultado muestra que la
bacteria realmente posee la capacidad para nodular por lo que sería
interesante construir mutantes impedidas en la nodulación y determinar
por análisis de secuencia cuales son los genes involucrados en dicho
evento.
Impacto
Los resultados de este proyecto de investigación contribuyeron
conocimiento básico sobre la capacidad de diferentes especies
Burkholderia para nodular plantas leguminosas. Así mismo, se muestra
posibilidad de un nuevo mecanismo involucrado en la nodulación de
nodosa.
al
de
la
B.
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