Download Patología Molecular Linfomas. Elias Campo

Patología molecular diagnóstica en neoplasias linfoides
Elias Campo
Anatomía Patológica, Hospital Clinic,Universidad de Barcelona
Introducción
Los linfomas no Hodgkin (LNH) son un grupo heterogéneo de enfermedades que
presentan unas características morfológicas, inmunofenotípicas, genéticas y moleculares que les
confiere diferente comportamiento biológico y clínico. Las alteraciones genéticas primarias más
frecuentes en estos tumores son las traslocaciones cromosómicas que dan lugar a la
disregulación de genes que poseen un potencial oncogénico. Estas traslocaciones son
relativamente específicas de los diferentes tipos de linfomas por lo que son de gran utilidad en
su diagnóstico. Por otra parte, la peculiar estructura y reordenamiento clonal del gen de la s
inmunoglobulinas en los linfocitos B y del receptor antigénico de las células T permiten estudiar
con relativa facilidad la clonalidad de estas neoplasias, una herramienta de gran utilidad en el
diagnóstico diferencial con procesos linfoproliferativos reactivos. Por otra parte, los estudiso de
clonalidad estan facilitando el reconocimiento de la complejidad de estas neoplasias con la
detección de dobles poblaciones clonales B o incluso de linfomas compuestos de línea B y T.
Finalmente en esta revisión analizaremos el impacto que probablemente va a tener el
diagnóstico de estas neoplasias las técncias genómicas de expresión de microarrays y el
desarrollo de microchips diagnósticos diseñados específicamente para neoplasias linfoides.
Traslocaciones en neoplasias linfoides
Las traslocaciones cromosómicas representan el mecanismo básico de activación oncogénica en
los LNH. Según el mecanismo de activación oncogénica se distinguen dos tipos de
traslocaciones:1) La más frecuente es la que yuxtapone la región codificante intacta de un
oncogen localizado en uno de los cromosomas a la región reguladora de la cadena pesada de las
Igs en la banda q32 del cromosoma 14 y 2) traslocaciones que dan lugar a un nuevo gen híbrido
formado por la fusion de dos genes diferentes asociados a los puntos de rotura implicados en la
traslocación. Este tipo de traslocación es la más frecuente en leucemias, pero en los últimos
años se han descrito también en LNH.
Estas traslocaciones cromosómicas se detectan
frecuentemente mediante técnicas convencionales de citogenética o FISH. La técnica de
Southern Blot inicialmente utilizada ha dado paso a técnicas basadas en la reacción en cadena
de la polimerasa (PCR) o de retrotranscripción y PCR (RT-PCR) que permiten la detección de
estas alteraciones de una forma más rápida y cómoda. Sin embargo, estas técnicas tienen una
serie de limitaciones de diversa índole como son: la existencia de diferentes puntos de
reordenamiento que requieren de un gran número de oligonucleótidos para su detección, al
presencia de diferentes genes que se reordenan con un único gen, por lo que son difíciles de
desarrollar estrategias mediante PCR y el tipo de material que se utiliza, DNA o RNA
parcialmente degradado extraído de material fijado e incluido en parafina. La generación de
anticuerpos monoclonales específicos para las proteínas implicadas en estas traslocaciones ha
permitido la rápida detección de estos productos por métodos simples de inmunohistoquimica.1
Asi pues, dependiendo de la traslocación que se requeira determinar en un caso concreto se
utilizará un abordaje técnico diferente.
t(14;18)(q32;q21) y reordenamiento de bcl-2
La t(14;18)(q32;q21) se encuentra en el 85 % de los linfomas foliculares (LF) y en el 30
% de los pacientes con linfoma difuso de célula grande (LDCG) 2 aunque puede detectarse
ocasionalmente en individuos sanos y en la linfocitosis B policlonal detectada en mujeres
fumadoras.3,4 En esta traslocación, el proto-oncogen bcl-2 en el cromosoma 18 se yuxtapone con
la cadena pesada de las Igs en el cromosoma 14. Los puntos de rotura están localizados
preferentemente en la región 3’ no codificante y se localizan básicamente en dos zonas, la
region MBR (major breakpoint region) en el exón 3 del gen bcl-2 y en la region mcr (minor
cluster region) ubicado a 25 Kb en el extremo 3’del exón 3. Sin embargo se han descrito otros
puntos de rotura en diferentes zonas del gen bcl-2. Recientemente, con los estudios de
microarrays se ha demostrado que la t(14,18) solo tiene lugar en los LDCG derivados del centro
germinal y estos enfermos tienen un mejor pronóstico que los LDCG con un perfil de célula B
activada.6 Los estudios inmunohistoquímicos han demostrado que la expresión de bcl-2 no es
específica de la presencia de la traslocación t(14;18). En tejido linfoide normal, la proteína bcl-2
se expresa en la zona del manto y no en el centro germinal, timocitos corticales y en células
activadas. A pesar de eso, existe una buena correlación entre presencia de la traslocación y la
expresión de bcl-2- Así, la expresión ectópica de bcl-2 en el centro germinal es de gran ayuda en
el diagnóstico diferencial de hiperplasia folicular y LF. No obstante, se ha descrito que en un
10% de LF se detecta la traslocación pero no se detecta la proteína bcl-2 y en un 25 % de
tumores se detecta expresión de la proteína sin presentar la traslocación, sin que se conozcan los
mecanismos implicados. Parte de estas discrepancias pueden ser debidas a la existencia de
mutaciones en el gen que afectan al dominio de reconocimiento por el anticuerpo o a los primers
utilizados en la PCR.5 Por otra parte, en un 10-30% de LF no se detecta ni la traslocación ni la
proteína sugeriendo que otros mecanismos patogenéticos deben participar en la evolución de
estas entidades.
t(11;14)(q13;q32), reordenamiento bcl-1 y sobreexpresión de Ciclina D1
La t(11;14)(q13;q32) es la traslocación característica de los linfomas de células del
manto (LCM). Se detecta por citogenética clásica en el 65% de casos de LCM, pero con
técnicas de FISH se observa prácticamente en todos los casos. Esta traslocación no es exclusiva
de los LCM ya que se ha descrito en casos esporádicos de leucemia linfática crónica (LLC)
atípica, y en el 5% de los mielomas multiples. La t(11;14) yuxtapone la región de unión de la
cadena pesada de las Igs en el cromosoma 14 a una region llamada bcl-1 (B-cell
lymphoma/leukemia 1) en el cromosoma 11q13, dando lugar a una sobrexpresión de Ciclina D1
o CCND1. Entre el 30-55% de estos reordenamientos tienen lugar en la región llamada major
translocation cluster (MTC) que es la que mayoritariamente se analiza mediante PCR. Ciclina
D1 no se expresa en células linfoides y mielodes normales, en cambio se expresa en los LCM. 7
La detección del reordenamiento Bcl-1/JH en la región MTC mediante PCR es una técnica
complementaria ya que solo dá resultados positivos en un 30-50 % de los casos. En cambio, la
detección de Ciclina D1 en el núcleo de una célula tumoral mediante inmunohistoquimica es
una herramienta de gran utilidad por su expresion practicamente constante en estos linfomas.
Por lo tanto, la detección de Ciclina D1 mediante inmunohistoquimica será la técnica de
elección para el diagnostico molecular del LCM. 8
Traslocaciones en linfomas de la zona marginal
En los linfomas marginales extranodales se estan identificando diversas traslocaciones
que implican diversos genes pero que todas ellas parecen activar las vias de supervivencia via
NFkB. La aparición de estas traslocaciones en los linfomas gástricos se asocian a la aparición de
resistencia al tratamineto antibiotico y a la progresión de la enfermedad. La distribución de las
diferentes traslocaciones varia según el tejido de origen. La t(11;18)(q21;q21) es la traslocación
más frecuente. Esta es una de las pocas traslocaciones halladas en linfomas donde se genera un
gen de fusión, e involucra al gen API2 en el cromosoma 11q21 y al gen MALT1, en el
cromosoma 18q21. API2 es un miembro de la familia de las proteínas inhibidoras de apoptosis
(IAP) que inhibe la actividad de las caspasas, y consecuentemente la apoptosis. MALT1 se
considera una para-caspasa que podría aumentar la función anti-apoptotica de API2 cuando se
fusiona con éste.9,10
Los linfomas MALT que presentan la traslocación presentan una mayor
diseminación pero no parecen transformase a linfomas de células grandes. La t(1;14)(p22;q32)
es menos frecuente y afecta al gen BCL10 que activa la vía antiapoptotica de NFk B.
Recientemente se ha descrito dos nuevas traslocaciónes en estos linfomas, la t(14;18)(q32;q21)
que implica al gen MALT1 y a la cadena pesada de las Igs. Esta traslocación se detecta en
linfomas MALT con localizaciones diferentes a los casos con t(11;18) 12 y la t(3;14) que activa
el gen FOXP3 cuya función en células B no es bien conocida.13 Mediante inmunohistoquímica,
los genes MALT1 y BCL10 se detectan en el citoplasma de las células linfoides normales,
mientras que en los linfomas MALT con la t(1;14)(p22;q32) presentan un patrón de BCL10
nuclear intenso y MALT1 citoplásmico débil. La positividad nuclear débil para BCL10 también
se ha descrito en los tumores con la t(11;18)(q21;q21) por lo que se ha sugerido que BCL10 y
API2-MALT pueden interactuar en la patogénesis de los linfomas MALT. Los casos con la
traslocacion t(14;18) tienen un patrón citoplásmico intenso de MALT1 y bcl-10. Finalmente
parece que los linfomas con la traslocación t(3;14) expresan intensamente FOXP3. 14 Esta
traslocaciones se detecta en linfomas extranodales de zona marginal de bajo grado pero no en
LDCG extranodales, linfomas de zona marginal nodales y linfomas marginales esplénicos. Estas
traslocaciones se suelen asociar a localizaciones precisas así la t(11;18) ocurre en linfomas
gástricos y pulmonares, la t(14;18) en linfomas de glándula salivar, anejos cutáneos y piel
mientras que la t(3;14) en linfomas tiroideos, anejos oculares y piel. 15
Reordenamientos ALK en los linfomas anaplásicos de célula grande (LACG)
La t(2;5)(p23;q35) se caracteriza por la generación de un gen de fusión entre la NPM
(nucleofosmina) en el cromosoma 5q35 con el gen ALK en el cromosoma 2p23. La proteína
ALK presenta actividad tirosin quinasa, participa en el desarrollo del sistema nervioso y solo se
detecta en células neuronales y neuroblastomas. NPM se expresa en todas las células normales y
participa en el transporte de ribonucleoproteinas desde el citoplasma al núcleo de las células.
Cuando existe la t(2;5)(p23;q35), ALK se detecta en el núcleo y en el citoplasma de las células
tumorales. La descripción de esta traslocación y la detección de ALK mediante
inmunohistoquimica permitió el reconocimiento del linfoma anaplásico de célula grande ALK
positivo. Recientemente los estudios citogenéticos y moleculares han demostrado que en la
patogénesis de los LACG participa ALK traslocándose con otros genes. Así, se han descrito
genes diferentes que se fusionan con ALK: tropomiosina (TPM3) en el cromosoma 1q25, gen
fusionado a TRK (TFG) en el cromosoma 3q11-12, 5’aminoimidazol-4-carboxamida
ribonucleotido formiltransferasa/IMP ciclohidrolasa (ATIC) en el cromosoma 2q35 dando lugar
a una inv(2)(p23;q35), la cadena pesada de la clatrina (CLTCL) en el cromosoma 22q11.2 y la
moesina (MSN) en el cromosoma Xq11-12 entre otros.
proteína ALK
16
La constante sobrexpresión de la
asociada a las traslocaciones hace que en la práctica se utilice la
inmunohistoquímica para detectar esta alteración molecular. A diferencia de la localización
nuclear y citoplasmática de la proteína NPM-ALK, las proteínas de fusión de las traslocaciones
variantes presentan una localización diferente que depende del gen implicado. El significado
biológico y clínico de estas traslocaciones variantes se desconoce, pero parece que presentan
una evolución clínica similar a la traslocación clásica NPM-ALK .
Estudios de clonalidad en linfomas
Las neoplasias linfoides son monoclonales y en la gran mayoría de estas proliferaciones
el reordenamiento de los genes de las Igs y del RCT precede a la transformación maligna (con la
excepción de algunas proliferaciones de células muy inmaduras). En consecuencia, todas las
células derivadas de una misma célula progenitora maligna compartirán un ADN reordenado en
forma similar y expresarán los mismos receptores (una Ig o un RCT idénticos). Por esta razón,
el análisis de las Igs o del RCT mediante la técnica de PCR nos permitirá detectar clonalidad de
poblaciones de células linfoides B o T.
Las inmunoglobulinas (Igs) y los receptores de células T (RCT) son las moléculas
responsables del reconocimiento antigénico por parte de los linfocitos B y T respectivamente.
La diversidad de moléculas de Igs y RCT se consigue mediante un proceso de reordenamiento
genético por el cual se evita que la codificación de cada una se estas moléculas se haga por
genes separados e independientes que ocuparían una porción importante del genoma humano.
En su lugar, existe un número limitado de regiones de DNA denominadas Variable (V),
Diversidad (D) y Unión (J) que codifican la porción variable de las Igs y del RCT y que se unen
de forma aleatoria dando lugar a una combinación diferente y especifica para cada clon de
linfocitos B o T. Una vez seleccionados, el espacio ocupado se reduce a 1000 pb y de estos sólo
350 pb corresponden a los genes VDJ elegidos. De este modo cada linfocito tendrá una sola
versión de todas las posibles combinaciones de los genes V, D y J y, durante una respuesta
inmune, sólo los linfocitos portadores de los reordenamientos V-D-J más afines a los antígenos
presentados entrarán en proliferación o expansión clonal. Además, esta diversidad de la región
variable es aún mayor que la descrita ya que se ha demostrado que en los sitios de unión de los
genes V–D por una parte y D-J por otra, existe la incorporación de entre 1 a 20 nucleótidos,
denominados n, formando una estructura VnDnJ; esto significa que además de las múltiples
combinaciones V, D y J, el largo de la región variable puede variar en 40 pb.
Diagnóstico de clonalidad en linfomas B
En 1983,se aplicó por primera vez el concepto de reordenamiento genético como
herramienta para identificar monoclonalidad en hemopatías de tipo B mediante la técnica de
Southern blot.17 La gran cantidad de ADN requerido para el estudio y el uso de radioactividad
han restringido su utilización clínica. Desde 1989, y aplicando las técnicas de PCR, se han
desarrollado nuevas estrategias moleculares basadas en la amplificación de la región VnDnJ de
la cadena pesada de las Igs, con cebadores que hibridan con secuencias consenso del gen V, por
un lado y secuencias consenso del gen J por el otro, flanqueando así la región de VnDnJ. Las
dos principales ventajas son que la muestra requerida es muy pequeña (solamente 1 nanogramo
de ADN) y que, con el conjunto de oligonucleótidos que se emplean, es posible detectar más del
95% de clonalidades. Además, el ADN a estudiar puede ser obtenido de muestras previamente
fijadas en formol e incluidas en parafina. La técnica de PCR permite amplificar el ADN de cada
uno de los clones de células B presentes en la muestra estudiada y, en consecuencia, permite
discriminar una población B monoclonal de una proliferación B policlonal reactiva.18 En una
proliferación B policlonal reactiva o hiperplasia linfoide existirán múltiples versiones de
VnDnJ, en parte debido a los distintos n incorporados en las uniones V-D y D-J, por lo que
observaremos unas bandas en escalera (en gel de acrilamida) o múltiples picos (en electroforesis
capilar). En cambio, en una proliferación B monoclonal habrá sólo una o dos versiones de
VnDnJ, indicando que la población linfocitaria analizada tiene un mismo reordenamiento
genético en todas las células, observándose una o dos bandas (en un gel de acrilamida) o uno o
dos picos (en electroforesis capilar)
Diagnóstico de clonalidad en linfomas T
El RCT presenta una serie de reordenamientos de las regiones VDJ o VJ parecidos a los
que tienen lugar en las Igs, pero estos al igual que ocurre en las Igs presentan un orden
secuencial, primero se reordena la cadena delta (TCRδ; 14q11), posteriormente la gamma
(TCRγ;7q15) y finalmente la beta (TCRβ;7q34) y la alfa (TCRα;14q11). Las técnicas de PCR
descritas se basan en el análisis de la cadena β y γ, aunque la cadena γ es la elegida por ser
menos compleja ya que tiene sólo 4 regiones V que contienen 11 genes y 5 regiones J. En
cambio la cadena β es mucho mas compleja y requiere la utilización de muchos
oligonucleotidos. Debido a que el reordenamiento TCRγ tiene lugar anterirormente al
reordenamiento del TCRβ, el análisis de la cadena gamma por PCR permite detectar clonalidad
T en el 90% de neoplasias T y puede ser de gran utilidad. 19 A diferencia de los que ocurre con
los linfomas de estirpe B, en los linfomas T no disponemos de un marcador como son las
cadenas kappa y lambda por lo que aunque haya la expresión anómala de antígenos T o un
incremento de una población T, solo el estudio de clonalidad permite confirmar los resultados
obtenidos por métodos inmunofenotípicos.
Micorarrays en Neoplasias linfoides
Las tecnologias de microarrays de DNA permiten el análisis de la expresión de millares de
genes simultanemanete. Esta tecnología esta produciendo un conocimineto importante que
puede tener una aplicación práctica importante.
La posible utilidad de esta técnología se
encuentra en el reconocimiento de perfiles de expresión específicos asociados con entidades ya
conocidas, el descubrimiento de nuevas entidades o tipos tumorales, el establecimiento de
nuevos parámetros pronósticos, el reconocimiento de nuevos mecanismos patogenéticos y la
posibilidad de identificar nuevas dianas terapéuticas en relación a las alteraciones moleculares
básicas de la neoplasia. Diversos estudios mediante microarrays han demostrado claramente la
especificidad de los diferentes perfiles de expresión de las neoplasias linfoides reconocidas
mediante los métodos diagnósticos convencionales. De esta manera, se ha definido el perfil de
expresión distintivo de la leucemia linfática crónica (LLC), linfoma de células del manto,
linfomas foliculares y linfomas de células grandes entre otros. Por tora parte, el analisis
sistemático de determinados tipos de neoplasias mediante microarrays puede permitir la
identificacion de nuevas entidades no reconocidas mediante los métodos convencionales
diagnósticos. Así, en los linfomas de células grandes de fenotipo B (LCG), se han reconocido al
menos dos tipos moleculares diferentes, uno con un perfil de expresión similar al de las células
linfoides del centro germinal del folículo, denominado tipo centro germinal B (CGB), al que
corresponden el 50% de todos los LCG, y un segundo grupo compuesto por un 30% de estos
tumores cuyo perfil de expresión es similar al de las células B activadas (ABC) con un relativa
abundancia de genes implicados en la síntesis y secreción de proteínas. Además de estos
parámetros, determinados patrones de expresión permiten establecer modelos predictivos de
supervivencia o respuesta a tratamiento. Estos grupos de genes son diferentes para cada tipo de
tumor indicando que los factores pronósticos son propios de cada enfermedad. Además de
generar modelos pronósticos de supervivencia los estudios de microarrays están permitiendo
valorar la respuesta a determinados tratamientos como rituximab en linfomas foliculares o
STI571 en leucemia mieloide crónica basados en el análisis del perfil de expresión del tumor
primario al diagnóstico.
Bibliografia
1.
Falini B, Mason DY. Proteins encoded by genes involved in chromosomal alterations in lymphoma
and leukemia: clinical value of their detection by immunocytochemistry. Blood. 2002;99:409-426.
2. Aster JC, Longtine JA. Detection of BCL2 rearrangements in follicular lymphoma. Am J Pathol.
2002;160:759-763.
3. Delage R, Jacques L, Massinga-Loembe M, Poulin J, Bilodeau D, Mignault C, et al. Persistent
polyclonal B-cell lymphocytosis: further evidence for a genetic disorder associated with B-cell
abnormalities. Br J Haematol. 2001;114:666-670.
4. Ladetto M, Drandi D, Compagno M, Astolfi M, Volpato F, Voena C, et al. PCR-detectable
nonneoplastic Bcl-2/IgH rearrangements are common in normal subjects and cancer patients at
diagnosis but rare in subjects treated with chemotherapy. J Clin Oncol. 2003;21:1398-1403.
5. Schraders M, de Jong D, Kluin P, Groenen P, van Krieken H. Lack of Bcl-2 expression in
follicular lymphoma may be caused by mutations in the BCL2 gene or by absence of the t(14;18)
translocation Pathol. 2005;205:329-35.
6. Rosenwald A, Wright G, Chan WC, Connors JM, Campo E, Fisher RI, et al. The use of molecular
profiling to predict survival after chemotherapy for diffuse large-B-cell lymphoma. N Engl J Med.
2002;346:1937-1947.
7. Campo E, Raffeld M, Jaffe ES. Mantle-cell lymphoma. Semin Hematol. 1999;36:115-127.
8. Campo E. Genetic and molecular genetic studies in the diagnosis of B-cell lymphomas I: Mantle
cell lymphoma, follicular lymphoma, and Burkitt's lymphoma. Hum Pathol. 2003;34:330-335.
9. Dierlamm J, Baens M, Wlodarska I, Stefanova-Ouzounova M, Hernandez JM, Hossfeld DK, et al.
The apoptosis inhibitor gene API2 and a novel 18q gene, MLT, are recurrently rearranged in the
t(11;18)(q21;q21)p6ssociated with mucosa-associated lymphoid tissue lymphomas. Blood.
1999;93:3601-3609.
10. Alpen B, Neubauer A, Dierlamm J, Marynen P, Thiede C, Bayerdorfer E, Stolte M. Translocation
t(11;18) absent in early gastric marginal zone B-cell lymphoma of MALT type responding to
eradication of Helicobacter pylori infection. Blood. 2000;95:4014-4015.
11. Willis TG, Jadayel DM, Du MQ, Peng H, Perry AR, Abdul-Rauf M, et al. Bcl10 is involved in
t(1;14)(p22;q32) of MALT B cell lymphoma and mutated in multiple tumor types. Cell.
1999;96:35-45.
12. Streubel B, Lamprecht A, Dierlamm J, Cerroni L, Stolte M, Ott G, et al. T(14;18)(q32;q21)
involving IGH and MALT1 is a frequent chromosomal aberration in MALT lymphoma. Blood.
2003;101:2335-2339.
13. Streubel B, Vinatzer U, Lamprecht A, Raderer M, Chott A. T(3;14)(p14.1;q32) involving IGH and
FOXP1 is a novel recurrent chromosomal aberration in MALT lymphoma. Leukemia. 2005 Feb
10; [Epub ahead of print]
14. Ye H, Gong L, Liu H, et al. MALT lymphoma with t(14;18)(q32;q21)/IGH-MALT1 is
characterized by strong cytoplasmic MALT1 and BCL10 expression.J Pathol. 2005;205:293-301
15. Streubel B, Simonitsch-Klupp I, Mullauer L,et al. Variable frequencies of MALT lymphomaassociated genetic aberrations in MALT lymphomas of different sites.Leukemia. 2004;18:1722-6.
16. Duyster J, Bai RY, Morris SW. Translocations involving anaplastic lymphoma kinase (ALK).
Oncogene. 2001;20:5623-5637.
17. Arnold A, Cossman J, Bakhshi A, Jaffe ES, Waldmann TA, Korsmeyer SJ. Immunoglobulin-gene
rearrangements as unique clonal markers in human lymphoid neoplasms. N Engl J Med.
1983;309:1593-1599.
18. Van Krieken JH, Langerak AW, San Miguel JF, Parreira A, Smith JL, Morgan GM, et al. Clonality
analysis for antigen receptor genes: Preliminary results from the biomed-2 concerted action PL 963936. Hum Pathol. 2003;34:359-361.
19. Hodges E, Krishna MT, Pickard C, Smith JL. Diagnostic role of tests for T cell receptor (TCR)
genes. J Clin Pathol. 2003;56:1-11.
20.
Rosenwald A, Wright G, Chan WC, Connors JM, Campo E, Fisher RI, et al. The use of molecular
profiling to predict survival after chemotherapy for diffuse large-B-cell lymphoma. N Engl J Med.
2002;346:1937-47.
21.
Bohen SP, Troyanskaya OG, Alter O, Warnke R, Botstein D, Brown PO, Levy R. Variation in
gene expression patterns in follicular lymphoma and the response to Rituximab. Proc Natl Acad
Sci U S A. 2003;100:1926-30.