Download que causan pérdidas

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Genes
que causan pérdidas
Estructura tridimensional del sitio activo de la polifenol oxidasa (PPO) de batata (Ipomoea batatas). El átomo
central de cobre (azul claro) se encuentra unido a dos residuos de histidina. Tomada de Mercerón (2005), “Enzimología aplicada a los procesos industriales”.
El Astrolabio
17
ARTÍCULO
oRIGINAL
AISLAMIENTO Y SECUENCIACIÓN DE UN FRAGMENTO
DE DNA GENÓMICO CORRESPONDIENTE A LA
REGIÓN 3’DE UN CANDIDATO A GEN ppo DE LULO
(Solanum quitoense Lam.)
Mauricio Pulido Jiménez1 y Víctor Manuel Núñez Zarante2
1. Director CEBM, Gimnasio Campestre.
2. Investigador Centro de Biotecnología y Bioindustria, CORPOICA.
Correspondencia para el autor: centrobiomol@campestre.edu.co
Recibido: 16 de abril de 2010
Aprobado: Mayo 20 de 2010
RESUMEN
SUMMARY
Se aisló y determinó la secuencia nucleotídica de un fragmento de DNA genómico
correspondiente a la región 3’ de un candidato a gen ppo de lulo (Solanum quitoense
Lam.). El contenido de guaninas-citosinas
del fragmento es de 45.13%, valor que está
dentro del rango que ha sido determinado
previamente para los genomas de papa y
tomate. En el segmento de DNA estudiado
se identificó un marco de lectura abierto de
252 aminoácidos. La secuencia caracterizada
presenta valores de similitud superiores al
75% y 66% a nivel de nucleótidos y aminoácidos respectivamente con los genes ppo y
las proteínas PPO de papa, tomate, tabaco
y berenjena.
A nucleotide sequence of a genomic DNA
fragment that corresponds to the 3´ region
of lulo (Solanum quitoense Lam.) ppo gene
candidate was isolated and determined.
The guanine-cytosine content for this fragment is 45.13%, which is within the rank
that has been previously determined for
potato and tomato genomes. The study of
this DNA segment led to the identification
of an open reading frame of 252 amino
acids. The characterized sequence shows
similarity values upperwards of 75% and
66% at a nucleotide and amino acid level respectively with ppo genes and PPO proteins
of potato, tomato, tobacco and eggplant.
Pa l a b ra s c l a v e : Pa r d e a m i e n t o
enzimático, polifenol oxidasa, Solanum
quitoense, gen ppo, porcentaje de
identidad.
Key words: Enzymatic browning,
polyphenol oxidase, Solanum quitoense,
ppo gene, identity percentage.
Investigación y Ciencia del Gimnasio Campestre
18
INTRODUCCIÓN
El pardeamiento enzimático es el fenómeno
bioquímico responsable del deterioro del
color (pigmentación) que se observa en la
corteza y la pulpa de la gran mayoría de frutas y verduras económicamente importantes.
Este tipo de daño limita de manera significativa la posibilidad de comercialización del
producto, ya sea para el consumo en fresco
o para el procesamiento industrial (McEvily,
et al., 1992). La pigmentación antes mencionada es provocada por la actividad de una
familia de enzimas denominadas polifenol
oxidasas (PPO) que están confinadas dentro
de los plastidios de las células vegetales
y se liberan al citoplasma una vez se ha
producido daño en la estructura celular de
los tejidos como consecuencia del impacto
mecánico ocasionado durante la recolección
de la cosecha y la manipulación poscosecha
de los frutos (Vaughn y Duke, 1981; Vaughn,
et al., 1988). El método más ampliamente
utilizado para controlar el pardeamiento
enzimático en la mayoría de alimentos
frescos o procesados es la adición de agentes químicos antioxidantes tales como los
sulfitos, los compuestos tiólicos (Martínez
y Whitaker, 1995), la tropolona y el ácido
salicilhidroxámico (Fuerst, et al., 2006). Sin
embargo, estudios recientes efectuados por
la Administración de Drogas y Alimentos de
los Estados Unidos (FDA) han demostrado
que dichas sustancias representan un riesgo
considerable para la salud humana. Por tal
razón, la búsqueda de alternativas de naturaleza biotecnológica a éste problema ha
cobrado gran importancia a nivel mundial.
Para implementar una de estas opciones,
conocida como silenciamiento de genes
mediante RNA antisentido, se requiere aislar un gen o parte de un gen que codifique
una PPO. Puesto que en todas las especies
vegetales cultivadas por su valor nutricional
e industrial se han encontrado genes que
El Astrolabio
codifican PPOs (Newman, et al., 1993; Thygesen, et al., 1995; Goldman, et al., 1998),
se presumía que el deterioro del color que
se observa en lulo (Solanum quitoense Lam.)
era pardeamiento enzimático. Sin embargo,
no se tenían evidencias de la existencia de
genes ppo en dicha especie. Recientemente
Pulido y Núñez (2009) identificaron la región 5’ de uno de ellos. En este trabajo se
reportan el aislamiento y la secuenciación
de un fragmento de DNA correspondiente a
la región 3’ del mismo.
MATERIALES Y MÉTODOS
Material vegetal: El tejido empleado en el
estudio se obtuvo de plantas de lulo (Solanum quitoense Lam., accesión ILS 388)
y papa (Solanum tuberosum L., variedad
Millenia). Semillas de lulo provenientes de
los bancos de germoplasma de CORPOICA se
sembraron en macetas con turba como sustrato; tanto la germinación de las semillas
como el desarrollo de las plántulas se dieron
bajo condiciones de invernadero. El material
vegetal de papa se colectó de plantas pertenecientes a la Colección Central Colombiana
que se encontraban en el campo.
Cultivo de Escherichia coli cepa DH5α: La
bacteria se cultivó en medio Luria-Bertani
(LB) líquido a 37 oC y agitación (250 r.p.m)
durante 8 horas.
Extracción y purificación de DNA genómico
de lulo, papa y E. coli: El DNA genómico de
lulo y papa se aisló a partir de hojas jóvenes, empleando el protocolo reportado por
Doyle y Doyle (1990). El DNA genómico de E.
coli se extrajo utilizando el procedimiento
reportado por Chen y Kuo (1993).
Evaluación de la integridad y cuantificación
de los DNAs genómicos: Alícuotas de los
DNAs y del marcador de masa molecular High
19
DNA Mass Ladder (Invitrogen, USA) fueron
sometidas a electroforesis en gel de agarosa
1%. El gel se fotografió y la imagen se analizó
con el programa GeneTools (Syngene, USA).
Diseño de los iniciadores para PCR: Las
secuencias nucleotídicas de los genes ppo
previamente reportadas en tomate, papa,
tabaco, batata, durazno, manzana, pera y
haba se alinearon utilizando el programa
Clustal X versión 2.0.9 (Larkin, et al., 2007)
con el fin de identificar la región hacia el
extremo 3´ que mostrara el mayor grado de
conservación posible. Una vez determinada
dicha región, se utilizaron el gen ppo-F de
tomate (como gen de referencia) y el programa Oligo versión 6.71 (Rychlik y Rhoads,
1989; Rychlik, et al., 1990) (Molecular
Biology Insights, Inc., USA) para diseñar los
iniciadores que permitieran amplificar un
fragmento de aproximadamente 920 pares
de bases a partir de DNA genómico de lulo.
La especificidad del posicionamiento de los
iniciadores sobre la región seleccionada se
verificó analizándolos con el programa BLAST
(Altschul, et al., 1990).
Amplificación por PCR de la región 3´ del
gen ppo de lulo: Para determinar las condiciones óptimas que permitieran la amplificación de un fragmento ubicado hacia el
extremo 3´ del gen ppo de lulo se ensayaron
diversas concentraciones de iniciadores, sulfato de magnesio (MgSO4) y DNA; de otro lado
se evaluaron programas de amplificación con
diferentes temperaturas de alineamiento y
períodos de extensión. Una vez estandarizadas las condiciones de amplificación, el
producto de PCR se sometió a electroforesis
en gel de agarosa 1% para verificar su tamaño
y la especificidad de la amplificación.
Purificación y cuantificación del fragmento
amplificado: El fragmento amplificado por
PCR fue purificado empleando el sistema
Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System
(Promega, USA). La concentración del mismo
se determinó utilizando el método descrito
anteriormente.
Secuenciación del fragmento aislado: La
secuencia de nucleótidos del fragmento aislado se obtuvo empleando el método de terminación de cadena con dideoxinucleótidos
(Sanger, et al., 1977) y los mismos iniciadores
diseñados para producirlo (InfPPO-F y PPORv). El fragmento se secuenció dos veces
por cada extremo con el fin de confirmar las
secuencias logradas.
Secuencia consenso del fragmento aislado:
Las secuencias correspondientes tanto a la
cadena positiva como a la negativa del fragmento aislado fueron alineadas empleando
el programa CodonCode Aligner versión 2.0.4
(CodonCode Corporation, USA) para generar
una secuencia consenso definitiva.
Identificación de marcos de lectura
abiertos en el fragmento secuenciado: Para
identificar los posibles marcos de lectura
abiertos en el fragmento aislado se utilizó
el programa ORF Finder (NCBI, USA).
Análisis de similitud con genes ppo y
proteínas PPO previamente reportadas:
La secuencia de nucleótidos consenso y la
secuencia de aminoácidos derivada de la
primera fueron comparadas con las bases
de datos empleando el programa BLAST
(Altschul, et al., 1990) con el fin de
determinar el grado de similitud de éstas
respecto a los genes ppo y proteínas PPO
previamente reportados en otras especies.
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Iniciadores para PCR
Los trabajos sobre la estructura de los genes
ppo en papa (Hunt, et al., 1993), tomate
Investigación y Ciencia del Gimnasio Campestre
20
(Newman, et al., 1993) y otras especies señalan que el tamaño de estos oscila entre 1700
y 2000 pb. y que las secuencias que flanquean
los extremos 5´y 3´ muestran un alto grado
de divergencia incluso entre genes pertenecientes a la misma especie. Considerando la
variabilidad existente en los extremos de la
región que se pretendía amplificar y buscando
iniciadores cuyas características permitieran
un posicionamiento altamente específico
en los sitios previamente determinados, se
diseñaron oligonucleótidos con degeneración
en varias posiciones. Para amplificar por
PCR el fragmento de DNA localizado hacia el
extremo 3´ del gen ppo de lulo se diseñaron
los iniciadores InfPPO-F (5’-CAAWTGRTNACTAAKGCTCC- 3’) y PPO-Rv (5’- TTAACAATCCKCAAGCTTGAT -3’) (directo y reverso
respectivamente). Las características de los
iniciadores se presentan en la tabla 1.
El análisis BLAST hecho para los iniciadores
diseñados permitió determinar las posiciones en las cuales estos se ubicarían en los
genes ppo de otras especies y el tamaño del
producto de PCR que permitirían obtener
(Tabla 2).
Los resultados del anterior análisis demuestran que la posición de las secuencias sobre
las cuales se ubican los dos iniciadores varía
incluso en los genes ppo de la misma especie;
ello implica que la longitud de los fragmentos
que se pueden amplificar con estos iniciadores también presenta diferencias. Aunque el
tamaño de los genes ppo cambia, el análisis
muestra que también presentan variaciones
en otras regiones. De otro lado, el hecho
de que los iniciadores diseñados para este
estudio encuentren en el DNA de tomate,
papa y tabaco secuencias pertenecientes a
Iniciador
Longitud (pb.)
Posición degenerada
% G-C
Tm (oC)
InfPPO-F
20
nucleótidos 4, 7, 9 y 15
36.4
63.5
PPO-Rv
21
nucleótido 11
38.0
67.0
Tabla 1. Características de los iniciadores diseñados para amplificar el fragmento ubicado hacia el extremo 3´ del gen ppo de
lulo. Características de los iniciadores diseñados para amplificar el fragmento ubicado hacia el extremo 3´ del gen ppo
de lulo.
Especie
Gen
Tomate
Tomate
Tomate
Tomate
Tomate
Tomate
Papa
Papa
Papa
Papa
Tabaco
ppo-A
ppo-B
ppo-C
ppo-D
ppo-E
ppo-F
ppo-POT 32
ppo-POT 33
ppo-A
ppo-B
ppo
Lugar posicionamiento
iniciadores
881 - 1762
884 - 1771
869 - 1750
869 - 1756
878 - 1744
878 - 1738
887 - 1774
893 - 1780
866 - 1732
881 - 1747
886 - 1761
Tamaño producto PCR
(pb.)
901
908
901
908
887
881
908
908
887
887
896
Tabla 2. Sitios de posicionamiento de los iniciadores diseñados para este estudio sobre genes ppo de diferentes especies y
tamaño de los productos de PCR que permitirían generar.
El Astrolabio
21
genes ppo sobre las cuales puedan posicionarse de manera muy específica demuestra
que el método utilizado para el diseño de
éstos es muy efectivo. Aunque la evidencia
experimental sugiere que estos iniciadores
permitieron la amplificación exclusiva de un
fragmento correspondiente a un gen ppo de
lulo y surge la posibilidad de que pudieran
ser utilizados con el mismo fin en otras especies de dicotiledóneas, de ninguna manera
se propone el uso universal de ellos.
Amplificación de la región 3´de un gen
ppo de lulo
Los análisis de PCR virtual realizados con el
programa Oligo 6.71 señalaron que el tamaño
del producto de amplificación debía estar
entre 880 y 910 pb. Los iniciadores InfPPO-F y
PPO-Rv permitieron amplificar un fragmento
de aproximadamente 920 pb. (Figura 1) a
partir de los genomas de lulo y papa. Después
Reactivo
Agua
Buffer PCR
MgSO4
dNTP’s
Primer InfPPO-F
Primer PPO-Rv
Taq DNA Polimerasa
Platinum Hi-Fi
DNA
Volumen final
Figura 1. Productos de PCR de 920 pb. correspondientes
al gen ppo. M.P.M: Marcador de peso molecular; carril 1:
genoma de lulo; carril 2: genoma de papa; carril 3: genoma
de E. coli (control negativo); carril 4: blanco.
de evaluar diferentes concentraciones de
magnesio (1.0, 1.5, 2.0, 2.5, 3.0 y 3.5 mM)
con el fin de optimizar la amplificación del
fragmento, se determinó que el valor óptimo
era 2.0 mM. Los ensayos de estandarización
de la temperatura de alineamiento cubrieron el rango entre 54 y 60 oC. Los mejores
resultados se obtuvieron utilizando 58oC.
Concentración Inicial
10X
50 mM
2.5 mM
10 μM
10 μM
Concentración Final
1X
2 mM
0.2 mM
0.4 μM
0.4 μM
Volumen/Reacción
13.45 μL
2.5 μL
1.0 μL
2.0 μL
1.0 μL
1.0 μL
5 U/μL
-
0.25 μL
20 ng/μL
-
3.8 μL
25.0 μL
Tabla 3. Condiciones de reacción utilizadas en la amplificación por PCR del fragmento de 920 pb. perteneciente al gen ppo a
partir de DNA genómico de lulo.
Etapa
Desnaturalización Inicial
Amplificación
Desnaturalización
Hibridación
Extensión
Extensión final
Temperatura / Tiempo
94 oC X 3 min.
94 oC X 1 min.
58 oC X 45 segundos
72 oC X 75 segundos
72 oC X 7 min.
Número de Ciclos
1
45
1
Tabla 4. Programa de ciclaje utilizado para la amplificación por PCR del fragmento de 920 pb. del gen ppo a partir de DNA
genómico de lulo.
Investigación y Ciencia del Gimnasio Campestre
22
Las condiciones de reacción óptimas bajo
las cuales se logró amplificar el fragmento
se presentan en la tabla 3. El programa de
ciclaje utilizado se presenta en la tabla 4.
Secuencia del fragmento de gen ppo de lulo
El método de terminación de cadena con
dideoxinucleótidos (Macrogen, USA) permitió
determinar una secuencia de 800 nucleótidos
(Figura 2). La diferencia observada entre
el tamaño del fragmento amplificado por
PCR (920 pb.) y el resultado arrojado por el
procedimiento de secuenciación (800 pb.)
obedece a que la técnica no logra resolver
eficientemente los nucleótidos de los extremos de las cadenas de DNA que se producen
durante la reacción de secuencia. La longitud de las regiones que no se logra identificar
con claridad es de aproximadamente 120
nucleótidos.
1
para genes que codifican PPO (Tabla 5) en
tomate y papa oscila entre 41.67% y 43.64%;
en tabaco es 44.80%, levemente superior al
mostrado por las dos especies antes mencionadas, y para el caso de especies como
manzana, pera, durazno y batata (las tres
primeras pertenecientes a la familia Rosaceae y la última a la familia Convolvulaceae) los valores se encuentran entre 52.24
y 56.48% respectivamente. El valor más bajo
encontrado en la comparación corresponde
a haba (37.94%), especie perteneciente a la
familia Fabaceae.
La comparación de la secuencia de 800 pb.
encontrada en lulo con los genes ppo de otras
especies reveló valores de identidad elevados no sólo con los genes ppo de especies
pertenecientes a la familia Solanaceae sino
con las de familias filogenéticamente distantes (Tabla 6). El porcentaje de identidad
TTTTCGGTAA TCCTTACCCT CTTGGAACCG ATCCAAGTCC AGGAATGGGC ACTATCGAAA ATATTCCTCA CAATGCGGTC
81 CACGTCTGGG TGGGTGACCC ACGACAACCA AACGGAGAGG ACATGGGTAA TTTCTACTCA TCCGGTCTAG AACCGGCTTT
161 CTTTTGCCAC CACTCCAATG TGGACCGAAT GTGGAATGAA TGGAAAGCAA TCGGTGGGAA AAGAAGAGAT CTAGCCGACA
241 AAGATTGGTT GAACACAGAA TTCCTTTTCT ACGACGAAAA TCGCAAGCTG TTTCGCGTGA GAGTCCGAGA CTGTTTGGAC
321 AGTAAGAAAA TGGGATTCGA TTACGCACCA ATGCCCACTC CATGGCGTAA TTTTAAACCA TCAATCAGAA AGACAACAGC
401 AGGGAAACTG AATACCAGTT CCATTCCACC GGTTTCCAAG GTCTTTCCAA TCCCTAAACT AGACAGACCG ATTTCGTTTT
481 CCATCAATAG ACCAGCTTCG TCAAGGACTC AAGCTGAGAA AAATGAACAA GAGGAGATGC TAACATTCCA CAAGATACAA
561 CACAATGATA GACTGTACGT GAGATTTGAT GTTTTCCTGA ATGTGGACAA GACTGTGAAT GCGTTGGAGC TTGACCAGCC
641 AGAGTTCGCA GGGAGCTATA CTAGCTTACC GCATGTTCAT GGAGATGATA AGCCTCATGC TACGAGTGCT ACATTATCGC
721 TGGCGATAAC AGAATTGTTG GAGGATAATA ACCTGGAAGA TGAAGAGACTA TTGTGGTAAC TCTGGTTCCA AAAGTAGGT
Figura 2. Secuencia de nucleótidos correspondiente a la región 3´ del gen ppo identificado en lulo (800 pb).
El fragmento de 800 pares de bases está
constituido por 246 adeninas (30.75%), 175
citosinas (21.88%), 186 guaninas (23.25%) y
193 timinas (24.12%). El contenido de guaninas-citosinas (%GC) para este fragmento es
45.13%, valor que se encuentra dentro del
rango que ha sido determinado previamente
para los genomas de otras solanáceas como
papa y tomate, que oscila entre 40 y 45%
(Rensink, et al., 2005). El %GC específico
El Astrolabio
que arrojó el análisis BLAST, definido como
el grado de invariabilidad que presentan dos
secuencias (de nucleótidos o proteínas) al ser
comparadas, puede ser asumido como una
medida de la similitud existente entre las
mismas (Altschul, et al., 1990). La secuencia encontrada en lulo presenta valores de
similitud que oscilan entre 75 y 79% con los
genes ppo de papa, tomate, tabaco, berenjena (especies de la familia Solanaceae) y
23
Especie
Lulo
Tomate
Tomate
Tomate
Tomate
Tomate
Tomate
Papa
Papa
Papa
Papa
Tabaco
Batata
Batata
Durazno
Pera
Haba
Manzana
Manzana
Gen
ppo A
ppo B
ppo C
ppo D
ppo E
ppo F
ppo pot 32
ppo pot 33
ppo A
ppo B
ppo
ppo
ppo -1
ppo
ppo
ppo -1
ppo -1
ppo -2
Tamaño gen
(pb.)
Adenina
Citosina
Guanina
Timina
% G+C
800
1893
1791
1881
1776
1764
1758
1794
1800
1752
1767
1781
1767
1767
1794
1359
1821
1782
1782
246
530
519
529
513
498
491
517
537
501
507
491
420
419
485
350
602
463
462
175
379
370
365
366
379
365
366
376
367
367
409
523
525
512
351
353
462
472
186
420
399
437
409
374
382
401
377
378
377
389
475
478
437
367
338
475
459
193
564
503
550
488
513
520
510
510
506
516
492
349
345
360
291
528
382
389
45.13
42.20
42.94
42.63
43.64
42.69
42.49
42.75
41.83
42.52
42.10
44.80
56.48
56.76
52.90
52.83
37.94
52.58
52.24
Tabla 5. Contenido de nucleótidos y porcentaje de guaninas y citosinas (%GC) en genes ppo de especies económicamente
importantes pertenecientes a las familias Solanaceae, Rosaceae y Fabaceae.
caqui (de la familia Ebenaceae). Los valores
más elevados (79 y 78%) corresponden a los
genes ppo-A y ppo-B de papa y ppo-E de tomate respectivamente. Con valores de similitud entre 66 y 72% respecto al fragmento de
lulo se encuentran los genes ppo de especies
como nogal (Juglandaceae), albaricoque,
pera asiática, ciruela del Japón, membrillo,
fresno, manzana (Rosaceae), uva (Vitaceae),
álamo balsámico y álamo californiano (Salicaceae) y batata (Convolvulaceae).
En la tabla 6 se observa que los valores E
arrojados por el análisis BLAST se presentan
en orden numérico ascendente mientras que
los porcentajes de identidad se muestran en
aparente desorden. Ello responde al hecho
de que el valor E representa el número de
alineamientos que se puede esperar que ocurran por azar entre la secuencia en estudio y
cualquiera otra de las existentes en la base
de datos. Por lo tanto, entre más cercano
a cero sea el valor E, más significativo es
el alineamiento entre la secuencia que se
analiza y la secuencia relacionada (Altschul, et al., 1990). Los valores E más bajos
que arrojó la comparación de la secuencia
nucleotídica identificada en lulo con la base
de datos de genes correspondieron a los alineamientos con los genes ppo reportados en
papa, tomate, tabaco y berenjena, especies
cercanamente relacionadas con el lulo; sin
embargo, uno de estos valores E (2e -155)
pertenece al caqui, especie que hace parte
de una familia filogenéticamente distante
de las solanáceas.
El programa ORF Finder permitió determinar que dentro de la secuencia nucleotídica
identificada hay un marco de lectura abierto
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24
Descripción del gen
ppo-A Papa (Solanum tuberosum)
ppo-B Papa (Solanum tuberosum)
ppo-E Tomate (Solanum lycopersicum)
ppo Tabaco (Nicotiana tabacum)
ppo-F Tomate (Solanum lycopersicum)
ppo Caqui (Diospyros kaki)
ppo Berenjena (Solanum melongena)
ppo alelo POT33 Papa (Solanum tuberosum)
ppo-B Tomate (Solanum lycopersicum)
ppo alelo POT32 Papa (Solanum tuberosum)
ppo-C Tomate (Solanum lycopersicum)
ppo-A Tomate (Solanum lycopersicum)
ppo-D Tomate (Solanum lycopersicum)
ppo alelo POT72 Papa (Solanum tuberosum)
ppo-1 Nogal (Juglans regia)
ppo Potentilla fruticosa
ppo Rhamnus californica
ppo Uva (Vitis vinifera)
ppo Albaricoque (Prunus armeniaca)
ppo Cercocarpus betuloides
ppo Pera Yar (Pyrus bretschneideri)
ppo Cydonia oblonga
ppo Chamaebatia foliolosa
ppo Pera asiática (Pyrus pyrifolia)
ppo Álamo de California (Populus trichocarpa)
ppo Álamo balsámico (Populus balsamifera)
ppo Ciruela del Japón (Prunus salicina)
ppo Batata (Ipomoea batatas)
ppo Fresno de California (Sorbus californica)
ppo Pera común (Pyrus communis)
ppo Penacho de Apache (Fallugia paradoxa)
ppo Membrillo (Chaenomeles speciosa)
ppo-2 Manzana (Malus domestica)
Valor E
0.0
0.0
0.0
1e -169
1e -163
2e -155
2e -153
3e -152
5e -137
4e -132
7e -129
7e -129
2e -128
8e -122
5e -23
2e -20
3e -19
1e -18
4e -18
1e -17
5e -16
5e -16
5e -16
5e -16
7e -15
7e -15
7e -15
7e -15
2e -14
2e -14
2e -14
2e -14
3e -13
% Identidad
79%
79%
78%
76%
76%
78%
77%
77%
76%
75%
75%
75%
75%
76%
72%
71%
71%
70%
70%
71%
71%
71%
71%
71%
72%
68%
69%
66%
71%
71%
69%
71%
70%
Tabla 6. Niveles de similitud entre la secuencia de 800 pb. identificada en lulo y los genes ppo reportados en otras especies.
de 756 nucleótidos en la cadena positiva, que
se inicia en la posición 45 y se extiende hasta
la posición 800. La proteína deducida de este
segmento tiene 252 aminoácidos (Figura 3).
El análisis BLAST para la secuencia de aminoácidos deducida del fragmento estudiado
reveló valores de similitud que oscilan entre
El Astrolabio
66 y 78% con las proteínas PPO de papa,
tomate, tabaco y berenjena (Tabla 7). Tal
como ocurrió con el análisis del fragmento
de DNA, la sección de proteína derivada de
la secuencia identificada en lulo muestra
niveles de similitud menores con las PPO
de especies pertenecientes a las familias
Convolvulaceae, Rosaceae, Salicaceae, Vi-
25
1
MGTIENIPHNAVHVWVGDPRQPNGEDMGNFYSSGLEPAFFCHHSNVDRMWNEWKAIGGKRRDLADKDWLN
71 TEFLFYDENR KLFRVRVRDC LDSKKMGFDY APMPTPWRNF KPSIRKTTAG KLNTSSIPPV SKVFPIPKLD
141 RPISFSINRP ASSRTQAEKN EQEEMLTFHK IQHNDRLYVR FDVFLNVDKT VNALELDQPE FAGSYTSLPH
211 VHGDDKPHAT SATLSLAITE LLEDNNLEDE ETIVVTLVPK VG
Figura 3. Secuencia de aminoácidos deducida del fragmento identificado en lulo.
Descripción de la proteína
PPO-B Papa (Solanum tuberosum)
PPO-E Tomate (Solanum lycopersicum)
PPO-A Papa (Solanum tuberosum)
PPO-F Tomate (Solanum lycopersicum)
PPO Tabaco (Nicotiana tabacum)
PPO-POT33 Papa (Solanum tuberosum)
PPO-C Tomate (Solanum lycopersicum)
PPO-A Tomate (Solanum lycopersicum)
PPO-B Tomate (Solanum lycopersicum)
PPO Berenjena (Solanum melongena)
PPO-POT32 Papa (Solanum tuberosum)
PPO-D Tomate (Solanum lycopersicum)
PPO Caqui (Diospyros kaki)
PPO-POT72 Papa (Solanum tuberosum)
PPO Álamo (Populus trichocarpa)
PPO Camelia amarilla (Camellia nitidissima)
PPO-1 Trébol rojo (Trifolium pratense)
PPO-1 Batata (Ipomoea batatas)
PPO Uva (Vitis vinifera)
PPO Cydonia oblonga
PPO Pera (Pyrus pyrifolia)
PPO Ciruela (Prunus salicina)
PPO Diente de León (Taraxacum officinale)
PPO Nogal (Juglans regia)
PPO Manzana (Malus domestica)
PPO-2 Batata (Ipomoea batatas)
PPO Piña (Ananas comosus)
Valor E
2e -114
4e -114
4e -111
1e -110
8e -110
2e -104
8e -101
2e -100
3e -100
5e -100
3e -97
1e -96
1e -92
3e -83
3e -60
1e -58
6e -58
1e -57
2e -57
2e -56
3e -56
3e -56
5e -56
2e -55
2e -55
3e -55
3e -55
% Identidad
77
78
76
75
75
70
69
69
67
67
66
66
78
70
44
45
43
48
46
45
46
45
44
44
46
48
43
Tabla 7. Niveles de similitud entre la proteína hipotética deducida del fragmento de DNA identificado en lulo y polifenol oxidasas
reportadas en otras especies.
taceae, Juglandaceae, Fabaceae, Bromeliaceae y Asteraceae entre otras. Ello se explica
en función de la distancia filogenética que
hay entre la familia Solanaceae y las familias
antes referidas. Aunque la comparación de
los genes pone de manifiesto una mayor similitud entre el segmento de lulo y los genes
ppo A y B de papa, ppo-E de tomate, ppo de
tabaco y ppo-F de tomate respectivamente,
a nivel de proteínas se observa una pequeña
diferencia: el grado de similitud que existe
entre la proteína PPO de tabaco y la proteína de lulo es levemente menor al que hay
entre ésta última y las PPO A y B de papa y
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26
las PPO E y F de tomate. Esto responde al
hecho de que el tabaco pertenece al género
Nicotiana mientras que las especies antes
mencionadas están agrupadas en el género
Solanum. La notable semejanza entre la
sección de proteína deducida de la secuencia
nucleotídica encontrada en lulo y la PPO del
caqui (especie de la familia Ebenaceae que
a su vez pertenece al orden Ericales) puede
ser el reflejo de la relativa proximidad de
los órdenes Ericales y Solanales.
CONCLUSIONES
Los análisis BLAST efectuados a los iniciadores utilizados en este estudio demuestran
que la manera como fueron diseñados les
confiere la capacidad de amplificar exclusivamente el fragmento correspondiente a
la región 3´ de genes ppo, hecho que abre
la posibilidad de que estos sean empleados
para trabajos similares en otras especies de
dicotiledóneas. El análisis global de los resultados logrados por Pulido y Núñez (2009)
en la caracterización de la región 5´ de un
candidato a gen ppo en lulo junto con los
presentados en este estudio se constituye en
evidencia de que los fragmentos de DNA reportados corresponde a un gen ppo. De otro
lado, los porcentajes de similitud entre la
secuencia de lulo analizada y las secuencias
homólogas en otras especies (en términos
de nucleótidos y de aminoácidos) reflejan
de manera clara la distancia filogenética
existente entre los individuos comparados.
Si bien el examen de un fragmento de DNA
en términos de su secuencia de nucleótidos,
el nivel de homología respecto a otros genes
y la existencia de secuencias que codifiquen
para algún tipo de proteína pueden constituirse en evidencias de la existencia de
proteínas PPO en lulo, la prueba definitiva
consiste en expresar el gen aislado, purificar
la proteína obtenida y hacer pruebas de actividad sobre sustratos específicos que permiEl Astrolabio
tan determinar su capacidad para catalizar
las reacciones de oxidación de orto-difenoles
a orto-diquinonas (Cary, et al., 1992; Eicken,
et al., 1998).
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