Download identificación de fuentes de resistencia a roya común de maiz y

IDENTIFICACIÓN DE FUENTES DE RESISTENCIA A ROYA COMÚN DE MAIZ Y
ESTUDIO DE LA VARIABILIDAD PATOGENICA Y MOLECULAR DE POBLACIONES
DE Puccinia sorghi EN LA ZONA NÚCLEO.
Darino MA1; Rochi L1; Lia VV2; Kreff ED3; Dieguez MJ1; Pergolesi MF1; Ingala LR1 y Sacco F1.
1
Instituto de Genética “Ewald A.Favret” CICVyA-INTA CC25 (1712) Castelar, Buenos Aires Argentina.
Instituto de Biotegnología CICVyA-INTA CC25 (1712) Castelar, Buenos Aires Argentina.
3
Pioneer Hi-Bred International, Inc. Ruta 178, Km 11. CC18 Pergamino (B2700), Buenos Aires Argentina.
darino.martin@inta.gob.ar
2
Abstract
Common rust, incited by Puccinia sorghi Schwein is an important disease of maize (Zea mays L.)
causing weight grain reduction of about 3 to 8% for each 10% of leaf area affected. In Argentina,
little is known about the population structure of P. sorghi and resistance sources that can be used
in breeding programs. A set of maize lines was tested against different isolates of the pathogen in
greenhouse and against the natural pathogen population present in field conditions. Lines Rp3-A,
Rp-G5, Rp-G5JD, PIO68752, PIO19802, PIO28760, PIO1234 and PIO17570 resulted resistant or
moderately resistant against most of the isolates and in field trials. A subset of maize lines was
selected to study the pathogen variability. According to the virulence phenotypes, the isolates were
grouped into three groups, group1 Rp1-B, Rp1-D, Rp1-J and Rp-G; group2 Rp1-B and Rp1-D, and
group3 Rp1-D y PIO1234. Molecular analysis using AFLPs, showed significance differences between
group 1 and 3 indicating that the P. sorghi populations could be specialized by hosts that carry the
resistance genes that defined each groups .
Roya común - Common rust;
Fuentes de resistencia - Resistance sources
Variabilidad patogénica- Pathogen variability
Variabilidad molecular - Molecular variability
Introducción
El maíz (Zea mays L.) es uno de los cereales mas cultivados en el mundo. En la
Argentina ocupa un lugar destacado con una producción promedio anual de 25
millones de toneladas, siendo las provincias de Buenos Aires, Santa Fe y Córdoba las
principales productoras. La roya común ocasionada por el hongo biótrofo Puccinia
sorghi Schwein es una importante enfermedad del maíz que en la Argentina puede
ocasionar reducciones en el peso del grano de entre 3 a 8 % por cada 10 % de área
foliar afectada (Gonzalez et al. 1999). La resistencia frente a roya común puede ser
clasificada en raza específica y resistencia parcial o general. La resistencia raza
específica es usualmente controlada por genes denominados Rp, donde la respuesta
se traduce en la muerte celular de las células infectadas. Comienza en el estadio de
plántula y se mantiene durante todo el desarrollo de la planta. La resistencia parcial
resulta en una reducción del número y tamaño de pústulas, puede ser controlada por
múltiples genes y al igual que la resistencia raza especifica se la puede observar
durante todo el desarrollo de la planta (Hooker, 1985). Hooker y colaboradores
durante las décadas del 50´ al 70´, caracterizaron más de 20 genes Rp. La mayoría
fueron mapeados en el cromosoma 10 en una región designada complejo rp1.
Mediante eventos de recombinación entre estos genes, se obtuvieron líneas con
combinaciones que pueden ser manipuladas como un único gen (Hulbert, 1997). En la
Argentina no existen reportes en donde el set de genes Rp y sus combinaciones hayan
sido extensamente evaluados en diferentes localidades pertenecientes a la zona
núcleo de cultivo y no hay información actual acerca de posibles fuentes de resistencia
que puedan ser utilizadas en programas de mejoramiento.
La estructura poblacional de distintas especies del genero Puccinia ha sido estudiada.
Kolmer, (1991) estudió la estructura poblacional de la roya anaranjada del trigo,
Puccinia triticina, en Canadá. Mediante la utilización de líneas portadoras de genes
individuales de resistencia y marcadores moleculares del tipo AFLP, determinó la
existencia de especialización por parte del patógeno hacia los genotipos de resistencia
que están siendo utilizados en las variedades comerciales al momento de realizar el
estudio. Para el caso de P. sorghi no existen reportes acerca de estudios de estructura
poblacional. Los mismos permitirían comprender si existen poblaciones o grupos de
razas.
Los objetivos del presente trabajo consistieron en la identificación de fuentes de
resistencia a la enfermedad mediante evaluaciones a campo y con aislamientos del
patógeno en invernáculo sobre un set conformado por genes Rp, algunas de sus
combinaciones y líneas endocriadas pertenecientes a la compañía Pioneer Hi-Bred
International, Inc. Además, se caracterizó la variabilidad patogénica y molecular de las
poblaciones de P. sorghi presentes en la zona núcleo de cultivo de maíz en la
Argentina.
Materiales y Métodos
Sesenta y cinco aislamientos de P. sorghi fueron colectados durante 2010 a 2012
sobre un set de 32 líneas de maíz que fue sembrado en 27 localidades pertenecientes
a la zona núcleo de cultivo de maíz. El set consistió en líneas isogénicas de maíz
portadoras de genes Rp individuales: Rp1-A, B, C, D, J, K, M; Rp-G; Rp3-A, algunas
de sus combinaciones, Rp-5D, Rp-G5, Rp-GI, Rp-GDJ, Rp-G5JD, Rp1-JC and Rp1-FJ y
líneas endocriadas PIO68752, PIO28427, PIO15600, PIO36420, PIO20046, PIO19802,
PIO28760, PIO16310, PIO1234, PIO74876, PIO17570 y PIO18192 pertenecientes a la
compañía Pioneer Hi-Bred International, Inc, (Pioneer). Los aislamientos fueron
multiplicados en invernáculo y utilizados para evaluar la respuesta a roya del set
descripto en el estadio de plántula (estadio vegetativo, V2). La respuesta a roya del
set también fue evaluada en las distintas localidades pero en planta adulta (estadio
reproductivo R1). En ambas condiciones evaluadas, la respuesta a roya se clasificó
según la escala de Stakman y se definieron 4 categorías: resistente entre 0; - 11+,
moderadamente resistente 11+2- - 1+2, moderadamente susceptible 22+ - 2++3 y
susceptibles 2++34 - 4. Para cada una de las líneas se calcularon las frecuencias del
tipo de infección según las 4 categorías mencionadas. Las frecuencias tanto para las
evaluaciones con los aislamientos como con las localidades, consistieron en la suma de
aislamientos o localidades con tipos de infección comprendidos dentro de cada
categoría sobre el número total de aislamientos o localidades evaluadas cada año. Las
líneas se agruparon en función de su respuesta a roya y se calculó un valor promedio
para: cada una de las frecuencias, el número de aislamientos y localidades en las que
fueron evaluadas. Para el estudio de la variabilidad patogénica, se seleccionó un
subset de 11 líneas de maíz con distintos genes de resistencia. Se establecieron
relaciones de disimilitud entre los aislamientos en función de virulencias comunes a los
distintos genes del subset. En el caso del estudio de la variabilidad molecular, se
seleccionaron 40 aislamientos y mediante el empleo de marcadores moleculares AFLPs
se evaluaron 76 loci polimórficos. La distancia Euclidiana fue utilizada para la
construcción de ambas matrices de disimilitud y los agrupamientos se realizaron
mediante UPGMA. El test de Mantel se utilizó para establecer la existencia de
correlación entre ambas matrices, el valor de correlación se calculó mediante 999
permutaciones. A partir de los agrupamientos obtenidos mediante análisis de
variabilidad patogénica, se realizó un análisis de AMOVA pero empleando los datos
moleculares de los aislamientos de cada grupo seleccionados. A partir del AMOVA se
calculó mediante 999 permutaciones el índice PhiPT, que permite medir el grado de
diferenciación entre grupos.
Resultados y Discusión
Las líneas Rp1-A, B, C, D, M, Rp-D5, PIO20046 y PIO16310 resultaron susceptibles o
moderadamente susceptibles para la mayoría de los aislamientos y localidades
evaluadas. Si bien los genes Rp-G, Rp1-K resultaron moderadamente resistentes o
resistentes en ambas condiciones evaluadas durante los tres años, en el año 2012 se
observó un aumento en las frecuencias de moderada susceptibilidad. El gen Rp1-J
resultó resistente o moderadamente resistente a más de la mitad de los aislamientos
evaluados. En las evaluaciones a campo solo en el 2010 resultó resistente mientras
que en los años 2011 y 2012 resultó en su mayoría moderadamente susceptible. Para
el gen Rp3-A se observó un comportamiento similar al de los genes Rp-G y Rp1-K,
pero solo se observó un aumento en la frecuencia de moderada susceptibilidad en las
evaluaciones a campo del año 2012. Las líneas con combinaciones de genes Rp, RpG5 y Rp-G5JD, resultaron resistentes o moderadamente resistentes a la mayoría de
los aislamientos y localidades durante los tres años. Mientras que las líneas Rp-GI y
Rp-GDJ si bien resultaron resistentes o moderadamente resistentes en ambas
condiciones evaluadas durante 2010 y 2011, en el año 2012 resultaron principalmente
susceptibles o moderadamente susceptibles. Para las líneas Rp1-FJ y Rp1-JC se
observó un comportamiento similar al gen Rp1-J. Las líneas, PIO28427, PIO15600,
PIO36420, PIO74876 resultaron susceptibles o moderadamente susceptibles para la
mayoría de los aislamientos, pero en las evaluaciones a campo exhibieron frecuencias
de resistencia o moderada resistencia indicando la existencia de genes de resistencia
no detectados en el estadio de plántula. Las líneas PIO68752, PIO19802, PIO28760,
PIO1234 y PIO17570 se comportaron resistentes o moderadamente resistentes en
ambas condiciones evaluadas (Tabla 1). La respuesta de resistencia observada en el
estadio de plántula indicó la existencia de genes de expresión en plántula, cuya
respuesta de resistencia no se encontró correlacionada con la de los genes Rp y sus
combinaciones, indicando que estas líneas serían portadoras de genes de resistencia
no identificados hasta el momento (Información no mostrada).
Para el estudio de la variabilidad patogénica se seleccionaron las líneas Rp1-B, Rp1-D,
Rp-G, Rp1-J, Rp1-K, Rp3-A, PIO19802, PIO28760, PIO1234, PIO17570 y PIO68752
por tratarse de líneas que resultaron polimórficas frente a los aislamientos,
permitiendo que puedan ser utilizados como caracteres para el agrupamiento de los
mismos (Información no mostrada). Los análisis de variabilidad patogénica indicaron
la existencia de por los menos 26 razas. Por otra parte los 65 aislamientos se
agruparon en función de virulencias comunes en tres grupos, grupo 1: Rp1-B, Rp1-D,
Rp1-J y Rp-G; grupo 2: Rp1-B y Rp1-D y grupo 3: Rp1-D y PIO1234 (Fig. 1). Los
grupos 1 y 3 se diferenciaron significativamente a nivel molecular (PhiPT= 0.067,
P=0.008). Los agrupamientos obtenidos mediante marcadores AFLPs y virulencias
comunes no se encontraron correlacionados (R= 0,156 P=0,006).
Tabla 1. Frecuencias relativas promedio para los grupos de líneas evaluadas en ambas condiciones
Evaluaciones en invernáculo
Evaluaciones a campo
Grupo de
Nro.
Nro
líneas
Año
promedio
de
0; - 11+2 22+ - 2++34
0; - 11+2- 22+ - 2++34 promedio de
evaluadas
aislamientos 11+ - 1+2 2++3
localidades
11+ - 1+2 2++3
–4
–4
Rp1-A, B,
C, D, M,
Rp-D5,
PIO20046,
PIO16310
2010
0.64
0.32
26
2011
0.37
0.63
26
2012
0.50
0.50
12
0.02
0.14
0.32
0.19
0.30
0.46
0.04
0.19
0.24
0.06
0.2
0.27
0.21
0.16
0.38
0.11
0.07
0.15
0.12
0.08
26
26
13
26
26
13
26
26
13
26
26
13
26
26
13
0.62
0.22
0.11
0.65
0.27
0.08
0.82
0.44
0.39
0.65
0.47
0.16
0.47
0.27
0.15
0.03
0.25
0.57
0.42
0.04
0.35
0.46
0.14
0.29
0.28
0.15
0.24
0.24
0.20
0.42
0.39
0.02
0.24
0.03
0.82
0.68
0.35
0.43
0.31
14
0.45
0.55
10
0.6
0.37
9
0.18
11
0.19
0.13
8
0.38
0.27
7
0.93
0.07
14
Rp1-J
0.40
0.60
10
0.22
0.67
0.11
9
0.97 0.03
14
Rp-G5,
0.08
0.8
0.15
0.05
8
Rp-G5JD
0.09
0.28 0.44
0.28
9
0.14
0.93 0.07
14
Rp-GI,
0.09
0.65 0.35
10
Rp-GDJ
0.33
0.16 0.28
0.56
9
0.12
0.40 0.57
0.03
14
Rp1-JC,
0.15
0.25
0.2
0.55
10
Rp1-FJ
0.08
0.45
0.55
9
(Continua en la página siguiente)
Las líneas PIO18192, PIO10189, PIO38360, PIO69383 y PIO43601 no fueron incluidas en el análisis por
presentar bajos niveles de germinación en ambas condiciones evaluadas.
Rp-G,
Rp1-K
2010
2011
2012
2010
2011
2012
2010
2011
2012
2010
2011
2012
2010
2011
2012
0.01
Tabla 1. (Continuación de la página anterior)
2010 0.77 0.19
0.04
Rp3-A
2011 0.23 0.73
0.04
2012 0.54 0.46
PIO28427,
2010 0.01 0.04
0.67
0.28
PIO15600,
2011
0.01
0.71
0.28
PIO36420,
2012
0.69
0.31
PIO74876
PIO68752,
2010 0.5
0.16
0.25
0.09
PIO19802,
2011 0.47
0.2
0.28
0.05
PIO28760,
PIO1234,
2012 0.46 0.32
0.19
0.03
PIO17570
26
26
13
26
0.36
0.10
0.22
0.09
0.50
0.80
0.33
0.6
0.14
0.10
0.45
0.24
0.07
14
10
9
14
22
0.1
0.20
0.65
0.05
10
13
0.03
0.28
0.64
0.05
9
26
0.5
0.41
0.09
14
26
0.62
0.22
0,16
10
13
0.58
0.31
0.11
9
Figura 1. Dendrograma basado en las respuestas de virulencia/avirulencia de 65 aislamientos en 11
líneas de maíz. G1, G2 y G3 representan los grupos 1,2 y 3 respectivamente. * indica los
aislamientos seleccionados para el análisis molecular. La distancia promedio entre pares de
aislamientos fue 0,377 con valores mínimos y máximos comprendidos entre 0 y 0,9
respectivamente. Los valores de bootstrap se encontraron comprendidos entre 13% y 76%.
Conclusiones
Ninguna de las líneas portadoras de genes Rp, sus combinaciones o líneas
pertenecientes a la compañía Pioneer resultaron resistentes a todos los aislamientos
evaluados. Sin embargo combinaciones de genes pertenecientes a las líneas Rp3-A,
Rp-G5JD, Rp-G5, PIO68752, PIO19802, PIO28760, PIO1234 y PIO17570 pueden
resultar en resistencias más durables y proteger frente a todos los aislamientos
evaluados. La diferenciación observada a nivel molecular de los grupos 1 y 3 indicaría
la existencia de razas especializadas sobre híbridos que poseen los genes de
resistencia que determinan cada grupo. La falta de correlación entre las matrices
obtenidas mediante marcadores AFLPs y virulencias comunes, indicaría que la
composición genética de los hospedantes es un factor de selección decisivo para la
supervivencia de las razas independientemente del origen de las mismas.
Bibliografía
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Kolmer, J.A. 2001. Molecular polymorphism and virulence phenotypes of the wheat leaf rust fungus Puccinia
triticina in Canada. Can. J. Bot. 79: 917–926 (2001)
Hooker, A. L. Corn and sorghum rusts. 1985. In: The Cereal Rust, vol. 2. A. Roelfs and W. Bushnell, eds.
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Hulbert, S. 1997. Structure and evolution of the rp1 complex conferring rust resistance in maize. Annual review
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