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Ingeniería Genética
Plataformas para el clonado molecular
Mariano N. Belaich, Vanina A. Rodríguez, Facundo Temprana
Universidad Nacional de Quilmes
Ingeniería genética
Construcciones
genéticas
Construcciones genéticas
La generación de construcciones genéticas nos introduce en el clonado
molecular.
El clonado molecular consiste en multiplicar copias idénticas de una
molécula.
En nuestro caso, las moléculas son ácidos nucleicos, y la multiplicación la
logramos utilizando materia viva.
Construcciones genéticas
Plano
Softwares
Plataforma
Vectores de clonado
Insumos
Ácidos nucleicos naturales y
artificiales
Herramientas
Enzimas
Equipamiento
Electroforesis/incubadores/PCR
Procedimientos
Estrategias y protocolos
Construcciones genéticas
Plano
Softwares
Plataforma
Vectores de clonado
Insumos
Ácidos nucleicos naturales y
artificiales
Herramientas
Enzimas
Equipamiento
Electroforesis/incubadores/PCR
Procedimientos
Estrategias y protocolos
Clonado molecular
Identificar objetivo
In silico
Diseño in silico
Aislar la plataforma
Aislar el inserto
Apertura de la plataforma
In vitro
Compatibilización de extremos
Ligación
Transferencia horizontal
Selección de ORG/plataforma
Selección de ORG/plataforma Recombinante
In vivo
Plataformas de clonado
Denominamos plataforma o vector de clonado a las moléculas de
ácidos nucleicos con la capacidad de multiplicar en algún
organismo, permitiendo a su vez la posibilidad de insertarles
secuencias que no le son propias. Deben ser de dsDNA o tener
intermediarios que lo sean.
REQUISITOS
Replicación dentro de Recepción de secuencias
células adecuadas
heterólogas
Sistema de selección
para recombinantes
Plataformas de clonado
Plataformas de clonado
Plásmidos
Virus
Cromosomas
artificiales
Moléculas de dsDNA, generalmente circulares, propias de
bacterias y algunos eucariotas como las levaduras
Moléculas de ácidos nucleicos protegidos por proteínas
y/o membranas lipídicas que parasitan a los organismos
Moléculas de dsDNA artificiales que poseen los
componentes mínimos indispensables para comportarse
como cromosomas de un organismo particular
Plataformas de clonado: Plásmidos
Los plásmidos son moléculas de dsDNA extracromosómicas,
generalmente circulares covalentemente cerradas, con la capacidad de
replicación autónoma.
Plataformas de clonado: Plásmidos
Los plásmidos son extracromosómicos porque…
no codifican factores esenciales para la vida.
La capacidad de replicación autónoma de los plásmidos significa que…
codifican maquinaria proteica que controla cuándo y
cuánto replica
Plataformas de clonado: Plásmidos
Elementos extracromosómicos
CURADO
Plataformas de clonado: Plásmidos
Elementos extracromosómicos
Plataformas de clonado: Plásmidos
Elementos extracromosómicos
Plataformas de clonado: Plásmidos
Elementos extracromosómicos
Plataformas de clonado: Plásmidos
Elementos extracromosómicos
Plataformas de clonado: Plásmidos
Elementos con capacidad de replicación autónoma
Maquinaria de Replicación
Generalmente utilizan la de la célula
hospedadora
Inicio de la Replicación
Controlado por secuencias genéticas
propias
Control del número de copias
Controlado por secuencias genéticas
propias (Relajado o estricto)
Partición en células hijas
Generalmente, controlado por secuencias genéticas propias
Plataformas de clonado: Plásmidos
Sistemas de partición de plásmidos
Sin mecanismo
Plataformas de clonado: Plásmidos
Sistemas de partición de plásmidos
Por medio de
funciones par
Plataformas de clonado: Plásmidos
Sistemas de partición de plásmidos
Por medio de
Toxina/antídoto
Plataformas de clonado: Plásmidos
Componentes de un plásmido mínimo
En este esquema el plásmido posee un ORI ColE1
Plataformas de clonado: Plásmidos
Componentes de un plásmido mínimo
Genes que codifican ventajas
Genes que codifican resistencias a antibióticos (
antR)
Sustancias producidas por organismos que matan (bactericida) o
limitan el crecimiento (bacteriostático) de las bacterias.
Actualmente se producen mediante síntesis química.
Plataformas de clonado: Plásmidos
Componentes de un plásmido mínimo
Ejemplos de antibióticos utilizados
Kanamicina
(afecta la traducción)
Gen de resistencia
kan R
(proteína que fosforila a la droga)
Cloranfenicol (afecta la traducción)
cat R (proteína que acetila a la droga)
Tetraciclina (afecta la traducción)
tet R (bomba de membrana que expulsa la
droga)
Ampicilina (afecta la síntesis de pared)
ampR
(proteína que hidroliza la droga)
Plataformas de clonado: Plásmidos
Historia de su aplicación en el clonado molecular
Los plásmidos son excelentes plataformas para el clonado molecular dado
que pueden ser multiplicados en bacterias y seleccionados verticalmente
debido a que aportan ventajas (por ejemplo, resistencia a antibióticos).
Las bacterias son organismos fáciles de multiplicar en condiciones de
laboratorio, pudiéndose obtener altas cantidades de biomasa en cortos
tiempos y con bajos costos.
Escherichia coli es la bacteria Gram negativa más estudiada, existiendo
cepas que son completamente inocuas para el ser humano.
La combinación de plásmidos y Escherichia coli resulta ser la alternativa
más simple y utilizada en el clonado molecular como sistema de plataforma
para la construcción de secuencias quiméricas de interés.
Plataformas de clonado: Plásmidos
Historia de su aplicación en el clonado molecular
Placa de medio de cultivo
más antibióticos.
Plataformas de clonado: Plásmidos
Historia de su aplicación en el clonado molecular
Placa de medio de cultivo
más antibióticos.
UFC (Unidad formadora de Colonia)
Plataformas de clonado: Plásmidos
Historia de su aplicación en el clonado molecular
1974
1977
1982
pMB1
pBR322
pUC18
1985
1988
1992
pUC118 pBlueScript pZErO
Existen otros muchos plásmidos, pero estos muestran cómo fueron
incorporándose diferentes componentes de secuencia con fines particulares.
Plataformas de clonado: Plásmidos
Historia de su aplicación en el clonado molecular: pMB1
1974
1977
1982
pMB1
pBR322
pUC18
1985
1988
1992
pUC118 pBlueScript pZErO
Este plásmido deriva de un aislamiento clínico. Posee múltiples resistencias a
antibióticos y un origen estrechamente relacionado con el ColE1 (15-20 copias).
Plataformas de clonado: Plásmidos
Historia de su aplicación en el clonado molecular: pBR322
1974
1977
1982
pMB1
pBR322
pUC18
1985
1988
1992
pUC118 pBlueScript pZErO
Este plásmido es el primer vector comercial. Posee resistencias a antibióticos y un
origen de replicación ColE1 (15-20 copias).
Plataformas de clonado: Plásmidos
Historia de su aplicación en el clonado molecular: pBR322
La molécula posee sitios de reconocimiento a Endonucleasas de Restricción
dentro de todas las secuencias indicadas
Plataformas de clonado: Plásmidos
Historia de su aplicación en el clonado molecular: pUC18
1974
1977
1982
pMB1
pBR322
pUC18
1985
1988
1992
pUC118 pBlueScript pZErO
Este plásmido surge a partir del pBR322, incorporando un nuevo sistema para la
selección de construcciones recombinantes.
Plataformas de clonado: Plásmidos
Historia de su aplicación en el clonado molecular: pUC18
El clonado molecular se realiza en el MCS, interrumpiendo de este modo el gen
selector de recombinantes. El ORI fue mutagenizado para generar más copias
(alrededor de 700).
Plataformas de clonado: Plásmidos
Historia de su aplicación en el clonado molecular: pUC18
Placa de medio de cultivo
más antibióticos y más X Gal
UFC azules indican actividad
Beta-galactosidasa
Plataformas de clonado: Plásmidos
Historia de su aplicación en el clonado molecular: pUC118
1974
1977
1982
pMB1
pBR322
pUC18
1985
1988
1992
pUC118 pBlueScript pZErO
Este plásmido surge a partir del pUC18, incorporando un ORI de fago filamentoso,
lo cual permite la obtención de las cadenas nucleotídicas por separado.
Plataformas de clonado: Plásmidos
Plásmidos particulares en función de su aplicación: pUC118
Es un vector prácticamente idéntico al predecesor pUC18. La diferencia radica en
la presencia de secuencias correspondientes al origen de replicación de los fagos
filamentosos.
Plataformas de clonado: Plásmidos
Historia de su aplicación en el clonado molecular: pBlueScript
1974
1977
1982
pMB1
pBR322
pUC18
1985
1988
1992
pUC118 pBlueScript pZErO
Este plásmido surge a partir del pUC118, incorporando secuencias promotoras de
fagos flanqueando al MCS. Las mismas sirven para generar transcriptos in vitro, o
para amplificar el inserto con primers universales mediante PCR.
Plataformas de clonado: Plásmidos
Plásmidos particulares en función de su aplicación: pBlueScript
Es un vector prácticamente idéntico al predecesor pUC118. La diferencia radica en
la presencia de secuencias promotoras de fagos a los flancos del MCS.
Plataformas de clonado: Plásmidos
Historia de su aplicación en el clonado molecular: pZErO
1974
1977
1982
pMB1
pBR322
pUC18
1985
1988
1992
pUC118 pBlueScript pZErO
Este plásmido cambia el gen de selección (resistencia a kanamicina) y el gen
selector de recombinantes (secuencia codificante para una toxina).
Plataformas de clonado: Plásmidos
Historia de su aplicación en el clonado molecular: pZErO
Es un vector de clonado que introduce un nuevo mecanismo para la selección de
construcciones recombinantes. Si el plásmido no es interrumpido en el MCS, se
codifica la toxina CddB, la cual no permite que la bacteria replique. Es un plásmido
asesino.
Plataformas de clonado: Plásmidos
Plataformas de clonado: Plásmidos
Plásmidos particulares según aplicación
Existen plásmidos que aportan funciones diferenciales a las secuencias
insertadas, en función de las secuencias que rodean al MCS.
Por ejemplo…
Plásmidos para expresión de proteínas
Plásmidos para el análisis de promotores
Plataformas de clonado: Plásmidos
Plásmidos particulares según aplicación: Plásmidos de expresión
Plataformas de clonado: Plásmidos
Plásmidos particulares según aplicación: Plásmidos para
análisis de promotores
Plataformas de clonado: Plásmidos
Plásmidos particulares según aplicación: Plásmidos para
análisis de promotores
Reporter genes
(genes indicadores)
Codifican proteínas de fácil detección, ya
sea por su actividad enzimática o por
alguna propiedad fisicoquímica
GFP (Green Fluorescence Protein)
DsRED
B-galactosidasa
Luciferasa
Plataformas de clonado: Plásmidos
Plásmidos particulares según aplicación: Plásmidos para
análisis de promotores
GFP (Green Fluorescence Protein) y variantes
Plataformas de clonado: Plásmidos
Plásmidos particulares según aplicación: Plásmidos para
análisis de promotores
DsRED
Plataformas de clonado: Plásmidos
Plásmidos particulares según aplicación: Plásmidos para
análisis de promotores
Luciferasa
Plataformas de clonado: Virus
Los virus son entidades formadas por las mismas macromoléculas que
los organismos.
Poseen un genoma, el cual se encuentra protegido por una cápside
proteica y/o una envoltura membranosa.
La principal diferencia con los organismos es que no son capaces por sí
solos de transformar y almacenar la energía.
Poseen la capacidad de multiplicar cuando ingresan a la célula
hospedadora adecuada.
Plataformas de clonado: Virus
En el clonado molecular en bacterias, los virus más utilizados son el fago
lambda y el fago P1
Micrografía electrónica de fagos
Esquema de Fagos icosaédricos
Plataformas de clonado: Virus
Placa de medio de cultivo
conteniendo bacterias que
han sido infectadas
Plataformas de clonado: Virus
Placa de medio de cultivo
conteniendo bacterias que
han sido infectadas
UFP (Unidad Formadora de
Placas)
Plataformas de clonado: Virus
Ciclo lítico del fago lambda
Adsorción
Inyección DNA
Lisis
Replicación DNA viral
Ensamblado
Síntesis de cápsides
Plataformas de clonado: Cósmidos y
Fósmidos
Existen plataformas de clonado basadas en el genoma del fago lambda,
las cuales después de ligar las moléculas de interés requieren de una
encapsidación in vitro.
Por otro lado, existen los cósmidos y los fósmidos. En ambos casos, son
plásmidos que replican como tales en Escherichia coli, pero al poseer la
región COS del fago lambda pueden ser encapsidados in vitro.
Plataformas de clonado: Cromosomas
artificiales
Los cromosomas artificiales son fragmentos de dsDNA que contienen los
requerimientos de secuencia mínimos y necesarios para comportarse y
segregarse como moléculas genómicas.
BAC (Bacterial Artificial Chromosome)
Son moléculas de cccdsDNA que contienen ORI plasmídicos de control
estricto (1-2 copias).
YAC (Yeast Artificial Chromosome)
Son moléculas de cccdsDNA que contienen ORI plasmídico relajado y ORI
de levaduras estricto. Poseen secuencias teloméricas y centroméricas para
comportarse como un cromosoma en levaduras.