Download VIABILIDAD Y ACTIVIDAD DE LA FLORA LACTICA (Streptococcus

TECNOLOGIA DE ALIMENTOS
Acta Científica Venezolana, 52: 46–54, 2001
VIABILIDAD Y ACTIVIDAD DE LA FLORA LACTICA
(Streptococcus salivarius ssp thermophilus y Lactobacillus
delbrueckii ssp bulgaricus) DEL YOGURT EN VENEZUELA
Ana Graciela Briceño 1 , Raúl Martínez2 y Karely García 1
1. Dpto. Procesos Biológicos y Bioquímicos. Edif. QYP.
Apartado: 89000, Zona Postal: 1080 A. Universidad Simón Bolívar.
Sartenejas Baruta. Edo. Miranda . Venezuela.
e-mail: abrice@usb.ve
2. Inst. de Ciencia y Tecnología de Alimentos. Universidad Central de Venezuela
Av. Suapure. Colinas de Bello Monte. Caracas. Venezuela.
Recibido: 25/1/00; Revisado: 2/11/00; Aceptado: 9/1/01
RESUMEN: La presencia de las bacterias lácticas en yogurt, activas y viables, en número no menor de 106 ufc/g de producto, es una
condición establecida en las normas nacionales e internacionales. En Venezuela se ha observado en los últimos años, para algunas
marcas comerciales, fluctuaciones significativas de los recuentos de las células viables de los microorganismos del yogurt, así como
su presencia en bajo número. El presente estudio estuvo orientado a la búsqueda de las posibles causas del problema en la industria
nacional, relacionado con la fabricación y el almacenamiento del yogurt. Se analizó un total de 105 muestras comerciales de yogurt natural
durante su vida útil y 32 muestras de yogurt preparadas a escala de laboratorio, según el esquema de fabricación nacional y las diferentes
condiciones de manejo del cultivo láctico liofilizado. Se determinó la población viable de la flora láctica y las posibles variaciones de pH
y acidez. La ausencia o el bajo número de esta flora detectada en algunas de las muestras comerciales de yogurt, obedece al uso de
cultivos de trabajo defectuosos en cuanto a la proporción de las cepas y a una población por debajo de 106 ufc/g. Los sucesivos repiques
y el tiempo de almacenamiento del cultivo madre, asi como la sobreacidificación del producto, producen daños subletales en las células
microbianas de los cultivos del yogurt. Los resultados sugieren que las prácticas de manufactura del yogurt, mas que el esquema de
procesamiento, afectan significativamente la supervivencia de la flora láctica. Palabras clave: Yogurt, flora láctica, viabilidad, fabricación
de yogurt.
VIABILITY AND ACTIVIVITY OF THE LACTIC BACTERIA (Streptococcus salivarius ssp thermophilus and Lactobacillus
delbrueckii ssp bulgaricus) OF YOGURT MADE IN VENEZUELA
ABSTRACT: National and international legislations have agreed that the population of lactic bacteria in yogurt must be viable and not
less than 106 ufc/g. In Venezuela, during last years, observations indicate that the number of viable cells in some commercial samples
show high variations, as low levels. This research attempted to find the origin of this problem in the local industry. For this purpose 105
commercial samples were analyzed during their shelf life and 32 samples of yogurt prepared in the laboratory following the flow diagram of
the local industry. The different conditions of freeze dried lactic culture, were also analyzed. These samples were evaluated for viable cell
count of lactic bacteria and possible variations of pH and acidity. The absence or low number of lactic bacteria detected in some commercial
samples is due to the use of inadequate working cultures that show imbalanced proportions of the two microorganisms, besides a low count
below 106ufc/g. The succesive propagation and storage time of mother culture, and the overacidification of the product, produce subletal
injury to the microbial cells of the yogurt starter culture. The data indicate that manufacturing practices significantly affect the survival of
the lactic flora. Key Words: yogurt, yogurt production, lactic bacteria, viability.
INTRODUCCION
A pesar de las controversias en cuanto a la definición de
yogurt, en términos de su composición química, procesamiento y microorganismos iniciadores utilizados en su fabricación, se define como el producto lácteo semisólido,
viscoso, obtenido de la coagulación de la leche producida durante el proceso de fermentación láctica16 . Generalmente la fermentación es llevada a cabo por Lactobacillus delbrueckii ssp bulgaricus y Streptococcus salivarius ssp hermophlilus, especies termófilas, homofermentativas, presentes en una relación simbiótica, llamada protocooperación.
La importancia de mantener el equilibrio ideal entre cocos y bacilos, constituye el secreto de la fabricación de un
yogurt de excelente calidad, razón por la cual es preciso
utilizar un cultivo iniciador puro y en equilibrio. Las dos
especies deben ser agregadas en proporción 1:1 y en el
producto final la proporción no debe exceder de 3 cocos:2
bacilos15 . Se sugiere que para mantener el equilibrio ideal
entre cocos y bacilos, la inoculación debe ser de 2 a 3%, la
incubación entre 42 a 45Æ C y el pH entre 4,5 a 4,714 . Cualquier modificación de estas condiciones favorece bien sea
el desarrollo de cocos o el de los bacilos, resultando así,
un desequilibrio entre las dos especies bacterianas.
La viabilidad y actividad de las bacterias lácticas presentes en el cultivo iniciador y en el producto final, están
determinadas por una serie de factores, entre ellos, la velocidad de multiplicación de los cultivos lácticos; la capacidad de producción de ácido láctico por el L. bulgaricus;
el contenido de sólidos totales; la temperatura y el tiempo
de incubación; la cantidad de inóculo utilizado; los residuos de antibióticos, de desinfectantes o detergentes; la
temperatura y tiempo de almacenamiento del yogurt y su
47
Flora láctica del yogurt en Venezuela
pH. Otros factores, como el número de pases o repiques
y el tiempo de almacenamiento de los cultivos de trabajo, afectan la relación simbiótica de los microorganismos
iniciadores en el producto final.
La norma venezolana COVENIN8 establece que las
bacterias lácticas del yogurt deben permanecer viables y
estar presentes en cantidad no menor a 106 ufc/g de producto, a partir del cuarto día de fabricación, hasta la fecha
de su vencimiento. En Venezuela, en los últimos años, se
ha observado en algunas marcas comerciales de yogurt
firme natural, fluctuaciones significativas de la población
láctica, que en algunos casos está por debajo del criterio
establecido en las normas oficiales. Esta situación no es el
resultado de la metodología empleada para su detección
y recuento4 . El objetivo del presente estudio está orientado a relacionar las condiciones de fabricación del yogurt
en Venezuela y su almacenamiento, con la viabilidad y la
actividad de las Bacterias Acido Lácticas empleadas para
su elaboración.
MATERIALES Y METODOS
MUESTRAS:
Yogurt comercial:
Se analizó un total de 105 muestras comerciales de yogurt firme natural. En 45 de estas muestras, adquiridas
en mercados de la localidad, procedentes de tres marcas
diferentes (A, B, y C) se evaluó la presencia de la población total de la flora láctica. Esta evaluación de realizó a
intervalos de 10 3 días en tres lotes de cinco muestras,
para cada una de las tres marcas comerciales. Las 60
muestras restantes de dos marcas comerciales, A y B y
adquiridas en un centro mayorista, se analizaron a los 0, 8
y 20 días de almacenamiento tanto para recuento diferencial de Bacterias Acido Lácticas, Streptococcus salivarius
ssp thermophilus y lactobacillus delbrueckii ssp bulgaricus, como para pH y acidez. Este análisis se efectuó en
tres lotes de 10 muestras cada uno para cada marca comercial seleccionada. Cada lote de reciente producción,
de igual fecha de vencimiento y analizados a diferentes
intervalos de tiempo.
Yogurt elaborado en condiciones de laboratorio:
Se elaboró yogurt firme natural en el laboratorio bajo el
esquema de fabricación nacional (Figura 1) en dos lotes
de producción, cada lote con cuatro muestras para cada
tiempo de almacenamiento del cultivo madre (0, 10, 15 y
20 días), obteniéndose un total de 32 muestras de yogurt.
Se empleó leche descremada de larga duración, estandarizada para sólidos totales en 16%7 e inoculada al 1% con
el cultivo madre obtenido y almacenado bajo las condiciones señaladas en la figura 2. Las muestras de yogurt se
almacenaron por 20 días a 5 1 Æ C y a los 0, 4, 12 y
20 días de almacenamiento se determinó la población de
Bacterias Acido Lácticas (BAL) y el pH y la acidez. Previo
Figura 1. Esquema industrial de fabricación de yogurt firme natural.
a la fabricación del yogurt firme a escala de laboratorio, se
procedió a la búsqueda de información sobre el esquema
de fabricación de este producto en las principales plantas procesadoras del país, a fin de reproducir su esquema
tecnológico a escala de laboratorio.
Cultivo láctico liofilizado:
Se utilizó el cultivo láctico liofilizado (Chr. Hansent’s Lab.
Danmark) con las cepas termofílicas Streptococcus salivarius ssp thermophilus y Lactobacillus delbrueckii ssp bulgaricus, en proporción 1:1, de propagación tradicional y
con una población de 5 - 10 x 108 ufc/g, según las especificaciones del fabricante. El cultivo liofilizado fue reconstituído por duplicado en leche descremada al 10%, a una
concentración del 1%, se incubó por 4 a 5 horas a 40 - 42
Æ C, hasta formarse el coágulo, a un pH de 4,0 - 4,5 y un
porcentaje de acidez, expresado como % de ácido láctico
48
Briceño, Martínez y García
torio y en los diferentes cultivos de trabajo, CM, CR y CI, se
evaluó la viabilidad de la población láctica diferencial, estreptococos y lactobacilos según norma COVENIN5 . Para
los estreptococos se utilizó el agar M17 (Merck) con glicerofosfato a pH 6,8 y para los lactobacilos, el agar reforzado para clostridios(ARC, BBL) pH 5,5. En todos los
casos, la población láctica total y la diferencial (cocos y bacilos) se reporta como unidades formadoras de colonias
por gramo de producto (ufc/g).
Las determinaciones de pH se realizaron con un pH
metro marca Coleman, modelo 39, calibrado con solución
buffer pH 4,0 y 7,0 y la acidez titulable se determinó como
porcentaje de ácido láctico, utilizando NaOH 0,1 N6 . Los
resultados obtenidos se analizaron mediante el análisis de
Varianza (ANOVA) de dos vías con réplicas, a un nivel de
significancia del 5%. En los casos donde se obtuvo diferencias significativas se aplicó la prueba de comparación
de medias de Duncan, a un nivel de significancia del 5%.
RESULTADOS Y DISCUSION.
Evaluación de la flora láctica y su actividad (pH y acidez)
en muestras comerciales de yogurt.
Figura 2. Diferentes condiciones de manejo del cultivo láctico
liofilizado.
Tabla I. Recuento de la flora láctica en muestras comerciales (A,
B y C) de yogurt de diferentes lotes de producción.
A
de 0,8 - 1%. El producto obtenido por este procedimiento
se consideró Cultivo Madre (CM) y a los 0, 10 y 20 días de
almacenamiento a 51Æ C se sometió a sucesivos pases
o repiques, denominándose el primero de ellos Cultivo de
Repique (CR), propagado el mismo día de su preparación
y al tercer día de almacenamiento. Con un segundo pase
del Cultivo de Repique de 0 y 3 días de preparación se obtuvo el Cultivo Industrial (CI), al primer día de preparación
y al quinto de almacenamiento (Figura 2). Para cada una
de las situaciones planteadas, CM (0, 10 y 20 días); CR
(0 y 3 días) y CI (0, y 5 días) se determinó la población
láctica presente y se realizaron determinaciones de pH y
acidez.
Recuento de bacterias ácido lácticas y determinaciones
de pH y acidez:
Para la enumeración de la población total de las bacterias ácido lácticas(BAL) en las muestras de yogurt, de tres
marcas comerciales diferentes se utilizó el agar de Man
Rogosa Sharpe (MRS), según la metodología descrita en
el “Compendium of Methods for the Microbiological Examination of Foods”3 . La presencia de la población de BAL,
fue confirmada mediante una coloración gram de un “pool”
de colonias desarrolladas en el agar MRS. En las muestras comerciales de yogurt de dos marcas diferentes, evaluadas a los 0, 8 y 20 días de almacenamiento, así como
en las muestras de yogurt elaboradas a escala de labora-
Lotes(a)
B
(ufc/g)
C
1Æ
2Æ
3Æ
2,1x105 5,9x108 3,0x107
1,5x106 2,0x108 1,4x105
3,0x107 9,6x108 9,0x104
(a) = Intervalo de tiempo de 10 3 días para cada lote.
(*): Valores promedio de cinco (5) réplicas por muestra para cada
lote de muestra analizada.
En la tabla I se muestran los valores promedio de cinco
réplicas por muestra. Se observa que no existe uniformidad en los recuentos de la población láctica para una
misma marca comercial, analizadas en diferentes lotes, ni
entre las diferentes marcas evaluadas. En las muestras de
la marca B, la población láctica se mantuvo por encima de
106 ufc/g, nivel establecido en las normas oficiales8 ; mientras que en las muestras de las marcas A y C, esta población estuvo por debajo de este límite. La falta de uniformidad en los recuentos de las BAL para una misma marca
comercial y la presencia de esta flora en bajo número, sugieren que la producción de yogurt en el país presenta
fallas relacionadas con las prácticas de manufactura, mas
que con el esquema de procesamiento. Resultados similares obtuvieron Hamann y Marth 10 al evaluar tres marcas
comerciales de yogurt firme natural y concluyeron que las
curvas de crecimiento de los microorganismos utilizados
en la fabricación del producto fueron diferentes para las
tres marcas analizadas.
Es importante destacar que en Venezuela, al inicio de
49
Flora láctica del yogurt en Venezuela
Tabla II. Recuento de la población láctica en dos marcas comerciales de yogurt durante su almacenamiento a 5 1 Æ C.
S. salivarius ssp thermophilus
0 días
8 días
L. delbrueckii ssp bulgaricus
(ufc/g)
20 días
0 días
8 días
20 días
Marca “A” 4,21010 (a) 4,7109 (b) 2,2108 (b) 5,61010 (a) 9,1109 (b) 1,5109 (b)
Marca “B” 5,9106 (a) 1,1106 (b) 3,4105 (b) 2,8109 (a) 5,0108 (b) 1,1108 (b)
(*)Valores promedios de 15 réplicas. Letras diferentes en la misma fila indican que hay diferencia
significativa (p< 0,005).
la década de los años 90, se evidenció un problema cíclicamente recurrente de supervivencia y de presencia en
bajo número de la flora láctica durante el período de vida
útil de muestras comerciales de yogurt, analizadas con fines de registro y control sanitario. Con esta problemática
surgieron varias teorías, relacionadas con el tipo de cultivo “Starter” utilizado, con las prácticas de manufactura
en la industria nacional, con las condiciones de almacenamiento del producto y con la metodología empleada para
la enumeración de los microorganismos del yogurt. Esta
información se logró en comunicación personal con representantes del organismo contralor oficial, Instituto Nacional de Higiene “Rafael Rangel” (datos sin publicar).
El valor límite de 106 ufc/g, establecido para los organismos del yogurt, además de la condición de viabilidad
de las células bacterianas durante la comercialización del
producto, son criterios de calidad que entre otros beneficios, le confieren una propiedad terapéutica al yogurt. Las
BAL empleadas para su fabricación, deben reunir ciertas
condiciones establecidas para ejercer la acción probiótica, entre otras, sobrevivir al tránsito estomacal, permanecer activos en presencia de sales biliares y colonizar el
intestino17 .
En la tabla II se presentan los resultados obtenidos del
recuento de la población láctica de dos marcas comerciales (A y B) de yogurt natural a los 0, 8 y 20 días de almacenamiento a 5 1Æ C. Del análisis estadístico se aprecia que existen diferencias significativas (p< 0,05) entre
los recuentos de S. salivarius ssp thermophilus y L. delbrueckii ssp bulgaricus para cada uno de los diferentes
tiempos de almacenamiento. Se observa que en ambas
marcas comerciales las bacterias lácticas disminuyen durante el almacenamiento refrigerado lo que concuerda con
otras investigaciones, en las que se describe una curva “típica” de crecimiento para la población de estreptococos
y lactobacilos, con un incremento inicial de esta población durante e inmediatamente después de la manufactura del producto y luego un descenso en el transcurso del
almacenamiento10 .
También se observa en estos resultados que los recuentos en la marca “A”, son superiores a los de la marca “B”
y por encima del valor límite establecido, 106 ufc/g. En el
caso de la marca “B”, el recuento de los estreptococos,
para el tiempo cero fue de 5,9 x 106 ufc/g y a los 20 días
de almacenamiento, de 3,4 x 105 ufc/g, valor inferior al límite oficial; mientras que el recuento de los lactobacilos
se mantuvo por encima de 106 ufc/g durante todo el período de almacenamiento. Esto sugiere que desde el inicio
del período de almacenamiento del producto de la marca “B”, existía un desbalance de la proporción de ambos
microorganismos.
El recuento de L. delbrueckii ssp bulgaricus en ambas
marcas comerciales es mayor con respecto a la población
de S. salivarius ssp thermophilus, esta situación concuerda con lo reportado por Torres18 quien señala que a medida que avanza el tiempo de almacenamiento disminuye
la población de Streptococos y se estabiliza el número de
lactobacilos, debido a que el crecimiento de los primeros
empieza a disminuir a valores de pH de 4,2 - 4,0 y el crecimiento de los lactobacilos se detiene en un rango de pH
de 3,8 - 3,5.
Los valores detectados al inicio del almacenamiento en
la marca “A”, de 1010 ufc/g para estreptococos, están un
ciclo log por encima del valor más alto reportado en otro
estudio2 para cuatro marcas comerciales de yogurt. Sin
embargo, el valor de 106 ufc/g para este mismo grupo de
bacterias en la marca “B”, se ubica dos ciclos log por debajo del valor mínimo reportado por el mismo autor. Con
estos resultados obtenidos en este estudio de viabilidad
y recuento de la flora láctica en yogurt comercial, se podría considerar que las marcas comerciales seleccionadas
al azar, representan casos extremos con respecto a valores reportados para otras marcas comerciales del mercado nacional. También se aprecia claramente que al inicio
del almacenamiento de las muestras de la marca “B” el recuento de la población de estreptococos es menor que la
de los lactobacilos, lo que podría atribuirse a un efecto de
la sobre-acidificación del producto.
Se ha reportado que la post-acidificación del yogurt durante el período de almacenamiento, afecta la viabilidad
de las bacterias ácido lácticas, particularmente a S. thermophilus, menos ácido tolerante en comparación con L.
50
Briceño, Martínez y García
Figura 4. Figura 4. Variación en el porcentaje de ácido láctico
durante el almacenamiento a 5 1 Æ C de yogurt comercial.
bulgaricus. Al aumentar la acidez, los estreptococos se lesionan, disminuye el recuento, hay un descenso del ácido
fórmico, factor estimulante para los lactobacilos y también
se produce el descenso de este grupo de bacterias2 .
Las diferencias detectadas en el recuento de la población láctica, entre las dos marcas comerciales analizadas,
pueden ser el resultado de varios factores que afectan la
viabilidad de esta población, tanto en el proceso de fabricación como durante su período de vida útil.
Existen reportes de los posibles cambios que pueden
ocurrir en la población láctica durante el almacenamiento
del yogurt a temperaturas de 0 a 10Æ C. Algunos autores9
reportan pocos cambios en el recuento de las bacterias
lácticas en yogurt a 5Æ C durante 28 días, aun cuando el
contaje de células disminuía marcadamente después de
14 días. Otros autores han observado que todos los tipos
de yogurt analizados, contenían más de 10 millones de
bacterias ácido lácticas viables por ml después de 40 días
de almacenamiento a 5Æ C; mientras que el número decrecía por debajo de 100.000 cel/ml cuando el producto era
almacenado 16 días a 22Æ C 12 .
Con el fin de correlacionar la viabilidad de las bacterias lácticas con las variaciones de pH y acidez durante
el almacenamiento del yogurt, se realizaron mediciones
periódicas de estos parámetros. En las figuras 3 y 4 se
muestran tales variaciones para muestras comerciales de
yogurt, marcas A y B. Se observa que a medida que transcurre el tiempo de almacenamiento ocurre una disminución del pH y un incremento de la acidez.
Dado que el pH de la leche no es una medida directa de
la acidez de la misma, es necesario determinar el grado
de acidez titulable, por lo tanto la variación de pH no tiene
por que ser igual a la variación de la acidez de la leche.
La acidez inicial representa la acidez natural de la leche
y considerando que la leche utilizada en la fabricación de
yogurt se estandariza para un nivel de sólidos totales, la
acidez titulable es una medida razonable y lógica de la
actividad de los cultivos iniciadores18 .
En las muestras de yogurt comercial, marca A, el pH a
tiempo cero fue de 4,3 y descendió a 4,1 al final del almacenamiento; mientras que para la marca B, el pH se
inició con un valor de 4,2 y disminuyó a los 20 días a 4,0.
El porcentaje de ácido láctico aumentó, en la marca A de
0,84% a 1,00% y para la B, de 1,47 a 1,51%. Al comparar estos valores con los reportados por otros autores2 no
se aprecian grandes diferencias y se mantiene la misma
tendencia durante el almacenamiento del producto.
Se ha reportado que la viabilidad del L. bulgaricus y S.
thermophilus en el yogurt depende del pH13 . El número
de estreptococos incrementa inicialmente hasta que el pH
disminuye a 4,0 0,05 y a partir de este valor la población
decrece, mientras que el número de lactobacilos tiende a
mantenerse constante o a incrementar durante los primeros 10 a 20 días, para luego disminuir.
El efecto del pH en la viabilidad de las bacterias ácido
lácticas se atribuye a que su pH intracelular se mantiene a
valores de 6,6 y cuando el pH del medio disminuye se origina un gradiente de pH a cada lado de la membrana celular. Para bombear protones de la parte externa, la bacteria
consume ATP, pero al final de la fase exponencial de crecimiento, la cantidad de ATP disponible no es suficiente,
desaparece el gradiente de pH y disminuye la actividad de
las enzimas proteolíticas, involucrando la inhibición de las
bacterias lácticas2 .
Los valores de acidez, obtenidos en este estudio, cumplen con los requisitos COVENIN8 , cuyo valor límite establecido es de 0,9% de ácido láctico y concuerdan con lo
reportado por Torres18 , quien determinó que los valores
en porcentaje de ácido láctico en un yogurt de reciente
preparado están entre 0,9 a 1,2% y que podría aumentar
durante el almacenamiento a 1,5%.
Al relacionar los valores de pH y acidez(figs. 3 y 4) con
los recuentos de la flora láctica en muestras comerciales
de yogurt (tabla 2), se observa que los valores más bajos de pH y más altos de acidez corresponden a la marca “B”, la cual presenta el menor contaje de la población
láctica evaluada. Con estos resultados se podría considerar la influencia de estos parámetros físico-químicos en la
Figura 3. Variaciones de pH durante el almacenamiento a 5
1Æ C de yogurt comercial.
51
Flora láctica del yogurt en Venezuela
Tabla III.Recuento de Streptococcus salivarius ssp thermophilus
en los cultivos de trabajo (CM, CR y CI) y durante el almacenamiento.
Tabla IV.Recuento de Lactobacilus delbruekii ssp bulgaricus en
los cultivos de trabajo (CM, CR y CI) y durante el almacenamiento.
Streptococcus salivarius ssp Thermophilus
(ufc/g)
CM
CR
CI
Lactobacilus delbruekii ssp bulgaricus
(ufc/g)
CM
CR
CI
0 días 3,4 10 10 (a) 0 días 2,7 10 10 (a) 0 días
5 días
3 días 1,7 10 10 (a) 0 días
5 días
10 días 1,2 10 8 (b) 0 días 1,1 10 8 (a) 0 días
5 días
3 días 7,6 10 7 (a) 0 días
5 días
20 días 6,7 10 5 (b) 0 días 5,7 10 5 (a) 0 días
5 días
3 días 3,8 10 5 (a) 0 días
5 días
10 108 (a)
10 (b)
10 108 (a)
10 (b)
9,710 7 (a)
1,710 6 (b)
6,310 7 (a)
1,010 6 (b)
5,310 5 (a)
2,410 4 (b)
9,710 4 (a)
6,610 3 (b)
2,5
2,7
1,0
2,2
0 días 6,9 10 10 (a) 0 días 5,7 10 10 (a) 0 días
5 días
3 días 5,1 10 10 (a) 0 días
5 días
10 días 2,2 10 8 (b) 0 días 2,0 10 8 (a) 0 días
5 días
3 días 1,7 10 8 (a) 0 días
5 días
20 días 1,9 10 6 (b) 0 días 1,7 10 6 (a) 0 días
5 días
3 días 1,3 10 6 (a) 0 días
5 días
10 108 (a)
10 (b)
10 108 (a)
10 (b)
1,710 8 (a)
3,210 6 (b)
1,310 8 (a)
6,510 6 (b)
1,510 6 (a)
3,810 5 (b)
2,710 6 (a)
2,510 4 (b)
5,2
4,7
4,5
4,2
(*)Valores promedios de 2 réplicas. Letras diferentes en la misma
columna para cada situación planteada, indican diferencia significativa a nivel del 5%.
CM: Cultivo Madre. CR: Cultivo de Repique. CI: Cultivo Industrial.
(*)Valores promedios de 2 réplicas.
Letras diferentes en la misma columna para cada situación planteada, indican diferencia significativa a nivel del 5%.
CM: Cultivo Madre. CR: Cultivo de Repique. CI: Cultivo Industrial.
viabilidad de las bacterias ácido lácticas. Este efecto podría asociarse al daño celular por un cambio de gradiente
que puede sufrir la célula bacteriana, en este caso, especialmente los estreptococos, debido a su menor ácido
tolerancia, lo que trae como resultado la alteración de la
relación simbiótica 1:1 establecida al inicio del proceso de
fermentación.
7 y 6 ciclos log, respectivamente. De acuerdo al análisis
estadístico, los contajes de la población láctica evaluada
presentan diferencias significativas (p<0,05)en todos los
cultivos de trabajo y a los diferentes tiempos de almacenamiento.
Del análisis de estos resultados se puede afirmar que
el número de pases o repiques a que es sometido el CM,
afecta la relación simbiótica entre ambas cepas del cultivo
industrial. Esto trae como consecuencia un desbalance de
la población láctica y la presencia en bajo número de estas
bacterias en el cultivo de trabajo y se partiría de un cultivo
de trabajo defectuoso que no cumple con el valor oficial
establecido de 106 ufc/g, lo que podría explicar la presencia en bajo número de la población láctica detectada ocasionalmente en el producto final y la poca uniformidad de
recuento para una misma marca comercial analizada. Por
esta razón se debe establecer como requisito para elaborar yogurt, el uso de un cultivo madre con menos de 10
días de almacenamiento refrigerado a 5 1Æ C.
Es de hacer notar que a medida que se efectúa la propagación del cultivo, la relación simbiótica 1:1 se altera hasta
alcanzar proporciones extremas de 1:100; lo cual no impide la formación del coágulo lácteo en 4 a 5 horas en cada
uno de los cultivos evaluados y bajo las condiciones señaladas en la literatura, de pH de 4,0 - 4,5 y porcentaje de
ácido láctico de 0,8 - 1,0%.
En la tabla V se resumen los resultados de las determinaciones de pH y acidez en los diferentes tipos de
cultivos de trabajo. Se observa que en un lapso de 20
días de almacenamiento refrigerado hubo disminución de
los valores de pH e incremento de la acidez, aun cuando
Evaluación de la flora láctica y de su actividad (pH y acidez) en los diferentes cultivos de trabajo (CM; CR y CI) y
en el yogurt elaborado en condiciones de laboratorio.
En las tablas III y IV se presentan los resultados promedio
de la población de estreptococos y lactobacilos, respectivamente, para cada uno de los sucesivos repiques(CM,
CR y CI). En el CM, tiempo cero, la población de Streptococcus salivarius ssp thermophilus presenta un contaje
inicial de 3,4 x 1010 ufc/g y para Lactobacillus delbrueckii
ssp bulgaricus de 6,9 x 1010 ufc/g . Con estos valores se
observa que en el CM recién preparado, se mantiene la
relación simbiótica de ambas bacterias en 1:1; sin embargo, a medida que transcurre el tiempo de almacenamiento, ésta se modifica tanto en el CM como en los cultivos de
repique y el industrial.
También se observa de estos resultados que a partir de
los 10 días de almacenamiento del CM, la población láctica sufre una reducción, de 2 a 3 ciclos log. En el caso
del CI con un tiempo de 5 días de elaborado, la reducción fue mayor, ya que el recuento final de estreptococos
fue del orden de 103 ufc/g, mientras que para Lactobacilos fue de 104 ufc/g, lo que representa una reducción de
52
Briceño, Martínez y García
Tabla VI. Comportamiento de la flora láctica durante el almacenamiento del yogurt elaborado con cultivo madre de diferentes días de almacenamiento.
S. salivarius ssp thermophilus
L. delbrueckii ssp bulgaricus
(ufc/g)
CM
CM
CM
CM
0 días
10 días
15 días
20 días
0 días
4 días
12 días
20 días
0 días
4 días
12 días
20 días
1,2x1010(a)
5,2x109(a)
1,9x108(a)
5,4x107(a)
3,4x109(b)
1,8x108(b)
9,2x106(b)
6,6x106(b)
7,0x108(b)
4,9x106(b)
8,0x104(b)
6,4x104(b)
5,2x107(b)
1,0x105(b)
4,3x104(b)
1,7x104(b)
2,5x1010(a)
1,6x1010(a)
2,5x109(a)
1,2x109(a)
1,0x1010(a)
1,4x109(b)
1,8x109(a)
6,0x108(b)
8,3x109(a)
8,7x108(b)
7,0x108(a)
1,5x108(c)
8,0x108(a)
6,8x108(b)
8,6x107(a)
6,9x107(c)
(*)Valores promedios de 2 réplicas.
Letras diferentes en la misma fila indican diferencia significativa a nivel del 5%.
CM: Cultivo Madre.
el análisis de varianza no reflejó diferencias significativas
(p>0,05). Estas variaciones de pH y acidez podrían afectar la viabilidad de las bacterias ácido lácticas durante el
período de vida útil del yogurt. Debido a que el coágulo
lácteo se origina por acción del ácido láctico lo cual involucra reducción de pH, que al llegar al punto isoeléctrico
de la caseína favorece la coagulación, la actividad de los
cultivos de trabajo medida en términos de acidez, no garantiza elaborar un yogurt con un contenido de bacterias
ácido lácticas superior a 106 ufc/g.
Tabla V. pH y ácido láctico en los cultivos de trabajo ( CM; CR y
CI ) y durante el almacenamiento.*
CM
pH
0 días 4,4
10 días 4,3
20 días 4,2
CR
% ácido
láctico
0,89
0,91
1,01
pH
CI
% ácido
láctico
0 días 4,5
0,75
3 días 4,3
0,73
0 días 4,4
0,72
3 días 4,3
0,69
0 días 4,3
0,55
3 días 4,3
0,54
pH
% ácido
láctico
0 días
5 días
0 días
5 días
4,3
4,4
4,6
4,4
0,77
0,72
0,63
0,59
0 días
5 días
0 días
5 días
4,5
4,4
4,5
4,6
0,66
0,63
0,77
0,75
0 días
5 días
0 días
5 días
4,3
4,5
4,4
4,3
0,7
0,68
0,72
0,7
(*)Valores promedios de 2 réplicas.
Letras diferentes en la misma columna para cada situación planteada, indican diferencia significativa a nivel del 5%.
CM: Cultivo Madre. CR: Cultivo de Repique. CI: Cultivo Industrial.
En la tabla VI se presentan los resultados de la dinámica de crecimiento de las BAL durante el almacenamiento
del yogurt, elaborado a escala de laboratorio, utilizando el
CM con diferentes tiempos de almacenamiento. En todos
los casos se observa disminución del recuento bacteriano, siendo más marcado para la población de S. salivarius
ssp thermophilus. Según el análisis de varianza de dos
vías con réplicas, a un nivel de significancia del 5%, no se
observaron diferencias significativas para los recuentos de
L. delbrueckii ssp bulgaricus, mientras que la población de
estreptococos si mostró diferencias significativas (p<0,05)
durante el almacenamiento.
En el producto elaborado con el CM a tiempo cero, el recuento inicial de estreptococos fue de 1,2 x1010 ufc/g y el
de lactobacilos de 2,5 x 1010 ufc/g ; al final del período de
almacenamiento, la población de estreptococos disminuyó
a 5,2 x 107 ufc/g y la de lactobacilos a 8,0 x 108 ufc/g. Sin
embargo, en el yogurt preparado con el CM de 10 días
de almacenamiento, la población inicial fue de 5,2x109 y
de 1,6x1010 ufc/g, para estreptococos y lactobacilos, respectivamente, notándose que al final del almacenamiento,
la población de estreptocos disminuyó a 1,0 x 105 y la de
lactobacilos a 6,8 x 108 ufc/g que para el caso de los estreptococos no cumple con las normas oficiales. Esta disminución y desproporción de la población bacteriana se
hace más evidente en el yogurt preparado con el CM de
20 días de almacenamiento.
Como se señaló anteriormente, al inicio del proceso de
fermentación crece el S. thermophilus y al final domina,
L. bulgaricus. Cuando el valor de pH del producto, inicialmente de 6,3 a 6,5, desciende por debajo de 5,5, el rápido
crecimiento de los estreptococos es reprimido y se favorece el de los lactobacilos, debido a la disminución de oxígeno y a la disponibilidad del formato. Hasta que el valor
de pH alcance 4,2, la población de estreptococos crecerá muy lentamente y por debajo de 4,2, el proceso será
dominado por lactobacilos1 .
Es de notar que al elaborar yogurt con un Cultivo Madre
de mas de 10 días de almacenamiento refrigerado, en el
cual ocurren cambios químicos importantes, como disminución de la lactosa, formación de ácido láctico, disminución del acetaldehído y alteraciones en el sabor y textura,
probablemente se obtendrá un producto final que refleje
dichos cambios, incluyendo la alteración de la proporción
53
Flora láctica del yogurt en Venezuela
Tabla VII. Valores promedio de pH y ácido láctico durante el almacenamiento del yogurt elaborado
con cultivo madre de diferentes días de almacenamiento.*
pH
Acido Láctico(%)
0 días 4 días 12 días 20 días 0 días 4 días 12 días 20 días
+
CM
CM
CM
CM
0 días
10 días
15 días
20 días
4,4(a)
4,5(a)
4,5(a)
4,0(a)
4,2(a)
4,2(a)
4,3(a)
3,9(a)
4,0(a)
4,1(a)
3,9(b)
3,8(a)
3,8(a)
3,9(a)
3,9(b)
3,8(a)
0,69(a)
0,67(a)
0,85(a)
1,37(a)
0,78(b)
0,88(b)
0,99(b)
1,40(a)
0,90(c)
1,35(c)
1,35(c)
1,52(b)
1,02(d)
1,40(c)
1,40(d)
1,59(c)
(*)Valores promedios de 2 réplicas.
Letras diferentes en la misma fila indican diferencia significativa a nivel del 5%.
CM: Cultivo Madre.
y la viabilidad de las bacterias ácido lácticas 11 .
Con estos resultados obtenidos a partir de muestras de
yogurt elaborado en condiciones de laboratorio, con CM
de 0, 10, 15 y 20 días de almacenamiento, se confirman
las observaciones realizadas en la parte correspondiente
al manejo del cultivo láctico liofilizado, en donde se demostró que el número de pases del cultivo de trabajo afecta
negativamente la presencia de la población láctica y además se pone de manifiesto el hecho de que no es posible
obtener un producto que garantice la viabilidad de las BAL
hasta el final de la vida útil, si no se parte de un cultivo con
recuentos superiores a 106 ufc/g y en proporción simbiótica de 1:1.
En la tabla VII se presentan los valores de pH y porcentaje de ácido láctico registrados en un lapso de 20 días
de almacenamiento. Se obseva en todos los casos una
disminución gradual de pH sin diferencias significativas (p
>0,05) y un aumento significativo progresivo de la acidez
(p<0,05). Estos valores reflejan la influencia del tiempo
de almacenamiento de los cultivos sobre la viabilidad de
las bacterias ácido lácticas, debido a un incremento en
la incidencia de los factores lesionantes, principalmente
la sobre-acidificación del producto, lo cual afecta notablemente la viabilidad del S. salivarius ssp thermophilus, por
su condición de menor ácido tolerancia. Por tanto, la determinación de estos factores físico químicos pudieran reflejar la condición de viabilidad de las bacterias ácido lácticas en el yogurt.
CONCLUSIONES.
1. Las prácticas de manufactura en la elaboración de yogurt firme natural en Venezuela presentan fallas que
se reflejan en la no uniformidad de los recuentos de
la flora láctica aún para una misma marca comercial.
2. La flora láctica presente en las muestras comerciales
de yogurt se mantuvo viable durante el período de vida útil, mostrando una ligera disminución hacia el final
del almacenamiento, siendo ésta más significativa para la población de estreptococos, lo que se relaciona
con la progresiva acidificacíon y reducción de pH, por
lo que se podría asociar la influencia de estos parámetros en la viabilidad de las BAL.
3. Los sucesivos pases y repiques del cultivo madre y de
los cultivos de trabajo, asi como el tiempo de almacenamiento de los mismos, afectaron notablemente la
relación simbiótica entre las cepas del cultivo iniciador, originando un desbalance y un bajo número de la
población láctica evaluada.
4. La actividad de un cultivo de trabajo medida en términos de pH y acidez no garantiza un producto final
con un contenido de BAL, balanceado y superior a
106 ufc/g, por lo que se recomienda realizar previo a
su uso un recuento diferencial de esta población en
cada uno de los cultivos de trabajo.
REFERENCIAS
1. Aguilera, M. Participación de las Bacterias ácido lácticas y
su crecimiento asociado en la elaboración del yogurt. Seminario de grado. Inst. Ciencia y Tecn. de Alimentos. Universidad Central de Venezuela. 1992.
3. American Public Health Association. Compendium of Methods for the Microbiological Examination of Foods. 3th Edition. Vanderzant, C and Splittstoesser, F. (eds) Washington,
DC. 1992.
2. Aldana, S. Estudio de algunos factores a considerar en el
recuento de las bacterias lácticas en yogurt. Trabajo especial de grado. Universidad Simón Bolívar. Venezuela. 1988.
4. Briceño, A. G. y Martinez, R. Comparación de metodologias para la detección y enumeración de bacterias ácido
54
Briceño, Martínez y García
lácticas en yogurt. Arch. Latinoamer. Nutr. 45:207-212,
1995.
5. COVENIN. Alimentos. Recuento de Lactobacillus bulgaricus y Streptococcus thermophilus Norma venezolana 10:3
- 008. Ministerio de Fomento, Caracas. 1986.
6. COVENIN. Leche fluída. Determinación de acidez titulable.
Norma venezolana 658 - 86. Ministerio de Fomento. Caracas. 1986.
7. COVENIN. Leche fluida. Determinación de sólidos totales.
Norma 932-82, Ministerio de Fomento, Caracas. 1982.
12. Lusiani, G. and Bianchi-Salvadori, B. Microbiological and
enzymatic control of yogurt. XX Int. Dairy Congr. E: 351.
Food Sci. Technol. Abstr. 10(11): 196, 1978.
13. Puhan, Z., Flueler, O. and Banhegyi, M. Mikrobiologischer
Zunstand, sowie Menge und konfiguration der Milchaasaure des industriell hergestellen joghurts in der Schweiz. Schweiz. Milchw. Forsch. 2: 37 - 45, 1973.
14. Rapacci, M. Curso de Tecnología del yogurt. Manual de
Apoyo. Pontificia Universidade Católica Do Paraná. CURITIBA. Brasil. 1994.
8. COVENIN. Yogurt. Norma venezolana 2393 - 86. Ministerio
de Fomento. Caracas. 1986.
15. Ray, B. Impact of bacterial injury and repair in food microbiology. It’s past, present, future. J. Food Prot. 49: 651655, 1986.
9. Davies, J. G. and McLachlan, T. Yogurt in the United Kingdom: chemical and microbiological analysis. Dairy Ind. 35:
139 - 144, 1974.
16. Tamine, A. and Deeth, H. Yogurt: technology and biochemistry. J. Food Prot. 43(12): 939 - 977, 1980.
10. Hamann, W. T. and Marth, E. Survival of Streptococcus
thermophilus and Lactobacillus bulgaricus in commercial
and experimental yogurts. J. Food Prot. 47: 781 - 786,
1984.
11. Laye, I., Karleskind, D. and Morr, C. Chemical, microbiological and sensory properties of plain nonfat yogurt. J. Food
Sci. 58: 991 - 995, 1993.
17. Teuber, M. The influence of fermentation on the nutritional
quality of dairy products . Facts and fiction. The world of
ingredients. Jan - Feb: 43 - 46, 1995.
18. Torres, A. Recuperabilidad de bacterias lácticas viables en
yogurt con frutas, en diferentes medios de cultivo. Trabajo
Especial de Grado. Universidad Simón Bolívar. Venezuela.
1989.