Download Inhibitory effect of Hop Acids

efficient by nature
Optimising Bioethanol Production :
How to minimise infection risk
naturally
2nd European Bioethanol Technology Meeting,
April 26, 2006
BetaTec Hop Products
Dipl.-Ing Lilith Rückle
mailto: Lilith.Rueckle@johbarth.de
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1
efficient by nature
How to minimise infection risk in
bioethanol production
• Effects of lactobacilli on ethanol fermentation
• How to protect the yeast from stress factors
• Hop Acids as Natural Fermentation Aid
• Hop Acids in Bioethanol Production - Dosing
Strategies
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2
efficient by nature
Effects of lactobacilli on
ethanol fermentation
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3
efficient by nature
Most common bacteria found
in mash
•
•
•
•
•
•
•
> 90 % Lactobacillus ssp.
Bacillus ssp.
Weissella ssp.
Pediococcus ssp.
Streptococcus ssp.
Acetobacter ssp.
Clostridia ssp.
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Gram+
Gram+
Gram+
Gram+
Gram+
GramGram+
4
efficient by nature
Competition for sugars between
bacteria and yeast
Glucose
Yeast
2 CO2
2 Ethanol
Bacteria
Lactic Acid Acetic
Ethanol
AcidCO2
Loss in ethanol yield!
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efficient by nature
The rat race for essential growth
factors: Vitamins, FAN etc.
Yeast
Bacteria
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Bacteria duplicate 8 - 9 x faster than
yeast
Yeast
Bacteria
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efficient by nature
Fast bacteria growth affects
yeast health
Yeast
Bacteria
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Bacteria produce toxic
metabolites
Glucose
Yeast
Bacteria
Toxic for yeast !
2 CO2
2 Ethanol
Lactic Acid Ethanol
CO2
Loss in ethanol yield!
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efficient by nature
Infections are expensive
•
Losses in ethanol yield due to lactic acid formation
•
Lactic acid affects yeast performance and results in extended
or stuck fermentation
•
Lactic acid concentration determines the amount of backset
used for mashing
•
Reduced quality of ethanol
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However, there is good news....
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efficient by nature
A yeast cell is approximately 50 x the
size of a bacteria cell.
Yeast
Bacteria
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efficient by nature
Fast yeast growth does not
leave sufficient nutrients for
bacteria
Yeast
Bacteria
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Healthy, fast growing yeast helps
to inhibit bacteria growth and
achieve maximum ethanol yields
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efficient by nature
Growth curve of microorganisms
in a batch fermentation system
Number of viable cells
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Protect the yeast from stress
factors!
→ Good yeast propagation management
→ Inhibit bacteria from proliferating and excreting toxic metabolites
→Avoid high osmotic pressure: SSF
→ Avoid nitrogen starvation: Supply yeast nutrients and FAN
→ Avoid carbon starvation in the stationary phase: Fermentation
period
→ Avoid high fermentation temperatures
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→ Avoid combination of stress
factorsGmbH
with high ethanol content 16
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efficient by nature
Yeast propagation
management
• High yeast inoculum
• Acclimatization of yeast to the fermentation substrate
• Addition of yeast nutrients (FAN source)
• Transfer of yeast in the exponential growth phase
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efficient by nature
Yeast propagation
management
• Frequent preparation/ addition of new ADY (weekly)
• Frequent cleaning of yeast propagators /
prefermenters
• Acid washing of yeast in combination with hop acids
during yeast recycling
• Addition of hop acids as natural fermentation aid
during the propagation cycle
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Hop Acids as Fermentation Aid
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Hops are a valuable component of beer and
have been used in brewing since the middle
ages
• bittering
• aroma
• conservation
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Antibacterial Hop Compounds
OH
OH
O
O
R
HO
HO
R
O
HO
O
β-acids
α-acids
•
In general, β-acids tend to be more antibacterial than α-acids.
•
α-acids are more soluble in water than β-acids.
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efficient by nature
H+
Inhibitory effect of Hop Acids
H+
H+
(Low pH)
H+
H+
(Higher pH)
Cell
H+
pH
- gr
adi
en t
H+
H+
H+
Glucose
H+
H+
H+
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H+
(Low pH)
H+
(Higher pH)
Cell
H+
Hop-H
HopH
HopH
Ho
pH
H+
Inhibitory effect of Hop Acids
H+
HopH
H+
Hop¯
H+
H+
H+
H+
H+
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HopH
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efficient by nature
H+
Inhibitory effect of Hop Acids
H+
Ho
pH
(Low pH)
HopH
H+
(Higher pH)
H+
Cell
H+
H+
H+
Hop¯
HopH
H+
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HopH
H+
Hop¯
H+
HopH
H+
H+
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efficient by nature
H+
Inhibitory effect of Hop Acids
H+
(Low pH)
H+
(Low pH)
Cell
HopH
HopH
Hop¯ H+
HopH
H+
H+
H+
H+
H+
H+
H+
H+
H+
Glucose
H+
H+
H+
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HopH
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efficient by nature
Hop Acids shield the yeast against
competition for nutrients with bacteria
Yeast
Bacteria
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Hop Acid as Fermentation Aid
- Dosing strategies
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efficient by nature
Choose the appropriate hop
product for your process
Activity and solubility of hop acids depend on the pH value
• IsoStab™: Best between pH 2.5 and pH 4.0
→ Recommended for fermentation of starchy materials
→ Excellent synergistic effect in acid washing of yeast
• LactoStab™: Best between pH 3.0 and pH 5.0
→ Recommended for fermentation of sugar beet/ sugar cane
substrates
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Treatment of the yeast propagator in
batch fermentations
Sweet Mash
IsoStab™/ LactoStab™+ Sulfuric Acid
Fermenter
Sweet Mash
85 %
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efficient by nature
Example 1 for treatment of the propagation tanks in
continuous fermentation
IsoStab™/ LactoStab™ Dosing point
Sweet mash
20%
80%
100%
Prefermenter
Fermenter 1
Fermenter 2
60%
20%
60%
70%
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30
efficient by nature
Example for intermittent treatment of the
propagation tanks in continuous fermentation
100
Prefermenter
Fermenter 1
Fermenter 2
80
70
Concentration IsoStab
TM
[ppm]
90
60
50
40
30
20
10
0
1
3
5
7
9 11 13 15 17 19 21 23 25 27 29 31 33 35 37 39 41 43 45 47 49 51 53 55
Fermentation time [h]
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efficient by nature
Example 2 for treatment of the propagation tanks in
continuous fermentation
Sweet mash
IsoStab™/ LactoStab™ Dosing point
100%
100%
Prefermenter
Fermenter 1
Fermenter 2
40%
65%
65%
100%
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efficient by nature
Example for intermittent treatment of the
propagation tanks in continuous fermentation
90
Prefermenter
Fermenter 1
Fermenter 2
70
60
50
40
30
20
10
39
37
35
33
31
29
27
25
23
21
19
17
15
13
11
9
7
5
3
0
1
Concentration IsoStab
TM
[ppm]
80
Fermentation time [h]
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Hop acids are thermostable and can be dosed at an
point in your ethanol plant where infection occurs
100
Liquefaction
Saccharification
Fermenter 1
80
Example for treatment of the liquefaction tank
70
Concentration IsoStab
TM
[ppm]
90
60
50
40
30
20
10
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
Filling time of Fermenter [h]
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Forge ahead
on the way
to cleaner
fermentation
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Thank you very much!
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36
1
Biocidas Naturales para Fábricas de Azúcar de Caña
David Beddie, Miguel Pagliara Valz
Sumario
Un agente antibacterial de origen natural derivado del lúpulo, BetaStab®10 A, se ha desarrollado para
su uso en los molinos de caña. Este producto se ha utilizado durante varios años con éxito como
biocida en la Industria Azucarera de Remolacha. Siendo un producto de acción a niveles de partes por
millón (ppm), se constituye como una alternativa de costo efectivo a los biocidas químicos usuales.
BetaStab®10 A detiene en forma inmediata el crecimiento de bacterias que causan problemas, y puede
utilizarse en todas las areas del Ingenio, tales como los molinos, difusores, tazas y las rejillas del coshcush. Leuconostoc es la bacteria contaminante de mayor presencia en los molinos de caña, cuyo
metabolismo resulta en la formación de dextrana y la consiguiente pérdida de azúcar. Bacillus es otra
bacteria que comúnmente presenta problemas en los ingenios, y tiene la habilidad de romper la cadena
del azúcar y formar ácido láctico y ácido acético. Se muestran resultados de la actividad del lúpulo y
otros biocidas comunes en la lucha contra estas bacterias.
Además, se han desarrollado otros productos de origen natural para su uso en destilerías y plantas de
etanol para combustible.
Introducción
La planta del lúpulo (humulus lupulus) crece en varios países alrededor del mundo y se ha utilizado en
la producción de cerveza durante muchos miles de años. Durante los últimos ocho años, se han
aprovechado las propiedades antibacterianas del lúpulo, utilizándolo para el control de infecciones
bacterianas en las fábricas de azúcar de caña (Pollach) y las destilerías. Al igual que con las fábricas de
azúcar de remolacha, la contaminacion bacteriana de los molinos de caña y las pérdiadas asociadas con
esta contaminación, han sido bien documentadas (Trost, van der Poel). De particular importancia es la
formación bacteriana de la dextrana y los problemas asociados en la fábrica (Ravno).
2
Objetivos
Las pérdidas de azúcar por microorganismos en los molinos de caña, estan ubicadas en el orden de 0.1
a 1%. Muchas de estas pérdidas pueden ser evitadas con el uso de biocidas en conjunto con una buena
limpieza de los equipos. Para controlar contaminación microbiana, se disponen de un rango amplio de
biocidas, tales como carbamatos (Madsen), compuestos de amonio cuaternario (Richards),
glutyraldehido, formaldehido, dióxido de azufre, etc. El propósito de esta investigación es evaluar la
actividad relative de los biocidas naturals y los biocidas químicos sintéticos contra contaminantes
bacterianos claves hallados en los molinos de caña, con el objetivo de desarrollar nuevos y efectivos
biocidas para los molinos de caña.
Métodos
Cepas Bacterianas: Leuconostoc mesenteroides subsp. dextranicum (DSM20187), Leuconostoc mesenteroides
subsp. mesenteroides (DSM20343) and Bacillus stearothermophilus (DSM22) se obtuvieron de la colección de
cultivos Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ) GmbH en Alemania.
Medios de Cultivo: Cultivos de L. mesenteroides fueron incubados a 25°C bajo aereación en Man Rogosa Sharpe
medium (MRS) (Merck). Cultivos de B. stearothermophilus fueron incubados a 60°C bajo aereación en Brain
Heart Infusion medium (Oxoid).
Determinación de concentración minima inhibidora (MIC): La concentración minima inhibidora (MIC) se
determinó utilizando el ensayo de micro dilución para caldos. Brevemente, un cultivo de una noche se diluyó
apropiadamente para obtener OD600 = 1.0 (8 x 108 organismos), 30μl de este cultivo se agregó a 3ml caldo fresco
(dando una concentración final de aproximadamente 8 x 106 organismos) e incubado apropiadamente con
controles sin ingrediente activo pero el mismo volumen de 10% de solución de etanol.
La posterior
cuantificación del crecimiento producto de la incubación, se logró midiendo la densidad óptica a 600nm. El MIC
se calculó como la concentración mínima requerida para una caída del 90% del OD con respecto al control.
3
Resultados y Discusion
Leuconostoc species
Leuconostoc sp. es el principal causante de contaminación bacteriana en los molinos de caña, formando
dextrana. La formación de dextrana no solo provoca pérdidas de azúcar, sino también resulta en
resultados pobres en la clarificación y la filtración, problemas de viscosidad, un crecimiento pobre de
los cristales y flóculos en el azúcar producido.
La concentración minima inhibidora (MIC) para los beta acidos naturales del lúpulo y para los biocidas
de uso común contra el Leuconostoc se muestran en las figuras 1 y 2. Esta información demuestra que
en pruebas de laboratorio, menos
de 10ppm de beta ácidos se
MIC / ppm active ingredient
250
requieren
para
reducir
la
200
población bacteriana en un 90%.
150
Este MIC es mucho menor que en
otros
100
biocidas
sintéticos.
La
experiencia ha mostrado que en
50
las fábricas de azúcar, valores
típicos de 0.5-3ppm de beta ácidos
Sulfur
dioxide
Quat
Formalin
Carbamate
Beta acids
0
son suficientes para minimizar
infecciones en el tandem de
molinos.
Figure 1 – MIC de biocidas contra Leuconostoc mesenteroides subsp. dextranicum
Se ha mostrado mediante prue-
250
MIC / ppm active ingredient
bas, que a diferencia de algunos
200
biocidas que requieren mucho
tiempo para ser efectivos, los
150
beta ácidos de lúpulo actúan en
100
forma inmediata, deteniendo el
crecimiento de bacterias y por lo
50
tanto, deteniendo también el
Sulfur
dioxide
Quat
Formalin
Beta acids
0
consumo
de
producción
azúcar
de
la
metabolitos
dañinos para la fábrica.
Figure 2 – MIC de biocidas contra Leuconostoc mesenteroides subsp. mesenteroides
y
4
Bacillus species
Bacillus stearothermophilus esta relacionado con el rompimiento de la cadena del azúcar en ácido
láctico y ácido acético, lo cual a su vez resulta en una caída de la pureza de los jugos. Esta bacteria
termofílica se presenta con
bastante incidencia en los
MIC / ppm active ingredient
1200
difusores de caña, los cuales
1000
se operan a altas temperaturas.
800
La figure 3 muestra que los
600
beta ácidos, carbamatos y
400
cuaternarios tienen actividades
200
similares contra el Bacillus
stearothermophilus. El lúpulo
Sulfur
dioxide
Quat
Formalin
Carbamate
Beta acids
0
no presenta problemas a altas
temperatures, por lo que son
efectivos en los difusores.
Figure 3 – MIC de biocidas contra Bacillus stearothermophilus
Producción de Etanol
Antibióticos como la Penicilina y la Monesina, pueden ser utilizados para control de infecciones
durante la fermentación de alcohol (Stroppa), sin embargo, el uso de antibióticos en la cadena
alimenticia esta siendo prohibido en muchos paises. El lúpulo ha sido utilizado en la producción de
cerveza por muchos siglos, por lo que es sabido que no tienen efectos negativos en el crecimiento de
levaduras. Trabajos recientes muestran que los compuestos derivados del lúpulo en concentraciones de
ppm (v.g. alpha y beta acidos) son muy buenos para mejorar el rendimiento de alcohol en la producción
de alcohol (Rueckle).
Nuevos productos naturales
Nuevos productos naturales se estan investigando para permitir el desarrollo de una familia de
productos naturales. Estos compuestos en forma conjunta con los ácidos del lúpulo, pueden utilizarse
para una estrategia de multi-agentes, especialmente útiles contra bacterias resistentes.
5
Conclusion
Existe un empuje continuo para eliminar el uso de químicos sintéticos del procesamiento de alimentos.
Siempre y cuando sean seguros y efectivos en el costo, los productos naturales son una excelente
alternativa a los químicos sintéticos. Los datos muestran que los beta ácidos del lúpulo son muy
activos contra los problemas bacterianos clave en las fábricas de caña de azúcar y por lo tanto son
alternativas viables a los biocidas químicos usuales.
References
Madsen, L.R.; Day, D.F. 2005. Mixed dithiocarbamates for the preservation of sugar cane juice. Int.
Sugar J. 107 (1282): 576-580.
Pollach, G.; Hein, W. 2002. Application of hop beta acids and rosin acids in the sugar industry.
Zuckerindustrie 127 (12): 921-930
Pollach, G.; Hein, W.; Hollaus, F. 1996. Use of hop products as bacteriostatic agents in the sugar
industry. Zuckerindustrie 121: 919-926
Ravno, A.B.; Purchase, B.S. 2006. Dealing with dextran in the South African sugar industry. Int. Sugar
J. 108 (1289); 255-269.
Richards, W. 1999. Biocides at Union Co-operative Limited. Proc.S. Afr. Sug. Technol. Ass. 73: 231234.
Rueckle, L.; Senn, T. 2006. Hop acids can efficiently replace antibiotics in ethanol production. Int.
Sugar J. 108 (1287): 139-147.
Stroppa, C.T.; Andrietta, M.G.; Andrietta, S.R.; Steckleberg, C.; Serra, G.E. 2000. Use of penicillin and
monensin to control bacterial contamination of Brazilian alcohol fermentations. Int. Sugar J. 102
(1214), 78-82.
Trost, L.W.; Steele, F.M. 2002. Control of microbiological losses prior to cane delivery, and during
sugar processing. Int. Sugar J. 104 (1239): 118-123
Van der Poel, P.W.; Schiweck, H.; Schwartz, T. 1998. Sugar Technology – beet and cane sugar
manufacture. Berlin, Bartens. 1001-1004