Download Arrays de Proteínas ZEPTOSENS

Institut de Recerca
Hospital Universitari Vall d’Hebron
Institut d’Investigació Sanitària de l’Instituto de Salud Carlos III (ISCIII)
Arrays de Proteínas
ZEPTOSENS
5 de Diciembre del 2012
Programa
1 Arrays de Proteínas
2 Servicio Arrays de Proteínas UAT: Tecnología Zeptosens
3 Flujo de trabajo de un ensayo con Reverse Protein Arrays
4 Optimización del Servicio en la UAT
5 Resultados y Análisis de Datos
7
7
6
7
Arrays de Proteínas
1
Definición
 Es una técnología de alto rendimiento que permite el estudio en forma simultánea y
masiva de miles de protéinas.
 Dispositivo que utiliza proteinas inmovilizadas de forma ordenada en soportes sólidos
(vidrio, bolas, pocillos) para ser posteriormente interrogadas con otras moléculas con el
fin de detectar interacciones específicas.
Ventajas
 Rápida, automatizada
 Muy sensible
 Económica, consume pequeñas cantidadades de muestra y reactivos
 Muchos datos a partir de un experimento
Áreas de aplicación:
1.- Diagnóstico: Descubrir nuevos biomarcadores; efecto de nuevos fármacos.
2.- Proteómica: Estudio de perfiles diferencial de protéinas
3.- Análisis funcional Proteico: Interacciónes proteina-proteina; propiedades de unión al ligando de
receptores; actividad enzimática.
4.- Caracterización de Anticuerpos: reactividad cruzada y especificidad; epitope mapping.
Arrays de Proteínas
1
Tipos de Arrays de Proteínas
Arrays de Proteínas
1
Necesidad de la técnica

El elevado grado de redundancia de las vías de señalización celular
pueden compensar vías de transducción anómalas.

La cantidad de mRNA a menudo no es un reflejo de los niveles de
expresión protéica.

El análisis del mRNA no proporciona información acerca de las
modificaciones post-transduccionales a las que están sometidas las
proteinas.

Los cambios genéticos pueden ser detectados en biopsias de tejido
tumoral, pero la sangre y otros fluidos corporales contienen poca o
ninguna cantidad de mRNA para propósitos diagnóstico.
Programa
1 Arrays de Proteínas
2 Servicio Arrays de Proteínas UAT: Tecnología Zeptosens
3 Flujo de trabajo de un ensayo con Reverse Protein Arrays
4 Optimización del Servicio en la UAT
5 Resultados y Análisis de Datos
7
7
6
7
2
Servicio Arrays de Proteínas UAT: Tecnología Zeptosens
2
Servicio Arrays de Proteínas UAT: Tecnología Zeptosens
Esta tecnología se basa en el Principio de
Conducción planar de ondas. Gracias al
diseño del vidrio donde se crean los arrays
podemos excitar solo la muestra y reducir el
ruido de fondo.
Arrays en fase Reversa
(RPA=Reverse Protein Array)
2
Servicio Arrays de Proteínas UAT: Tecnología Zeptosens
ZeptoMark RPA
Distribución Muestras en el chip:
• 1x32x4_3T_AAAAAA
• 3x32x4_3T_ABCABC
• 6x32x4_3T_ABCDEF
Tipo de Muestras que admite el chip:
•
•
•
•
Lisados proteicos de tejidos
Lisados proteicos de cultivos de células
Suero
Orina
2
Servicio Arrays de Proteínas UAT: Tecnología Zeptosens
Equipamiento
ZeptoGOG
Chip blocking Station
Arrayer- Cell Lysate Spotter
Nanoplotter 2.1
(80 chips/480 arrays)
Zeptoreader
Microarray Reader
Lysis buffer &
Spotting
Buffer
Zeptocarrier
1
Servicio Arrays de Proteínas UAT: Tecnología Zeptosens
Programa
1 Arrays de Proteínas
2 Servicio Arrays de Proteínas UAT: Tecnología Zeptosens
3 Flujo de trabajo de un ensayo con Reverse Protein Arrays
4 Optimización del Servicio en la UAT
5 Resultados y Análisis de Datos
7
7
6
7
Flujo de Trabajo
3
rd
3
Br
ad
fo
2
4
Te
st
d
e
1
8
7
6
Test de Bradford para la Normalización del lisado protéico a 2 mg/ml.
 Los pasos 1-3 los realiza el usuario y el resto el personal técnico de la UAT.
5
Flujo de Trabajo
3
Guía Experimental Arrays de Proteínas

Elaboración del Diseño experimental entre las partes implicadas en la realización del experimento.
Consideraciones:
• Aplicación
• Elección de Anticuerpos. Los anticuerpos los proveerá el usuario. Zeptosens dispone de una lista
validada de anticuerpos:
Zeptosens dispone de: list of validated antibodies:
http://www.zeptosens.com/en/pdf/ZeptoMARK_Reverse_Array_Validated_Antibodies_LR.pdf
• En caso de necesitar un Anticuerpo que no figure en la lista, se requerirá una validación previa del
mismo.
 La obtención del Lisado proteico la realiza el usuario. Consideraciones:
• Diferentes protocolos con diferentes tampones de lisis en función fuente proteica
• Si la fuente protéica es a partir de suero, se recomienda la realización del llamado proceso de depleción de
plasma, con el que se eliminan las proteinas más abundantes así como tb las inmunoglobulinas, previa al
espoteado de la muestra. (IgY/Supermix plasma depletion columns; Genway, from Sigma-Aldrich)
 La cuantificación proteica (así como el resto de la técnica) la realiza la parte técnica responsable de la
plataforma en la UCTS mediante Test de Bradford. Consideraciones:
• Se necesitan 2.5 µl de lisado proteico para la cuantificación.
• Para proceder al espoteado se recomienda empezar con un mínimo de 2 mg/ml de lisado proteico en un
volumen mínimo de 10 µl. En caso de no conseguir la mínima concentración recomendada es decisión del usuario la
continuación del procedimiento del experimento o la obtención de más lisado proteico con el fin de
cantidades recomendadas.
conseguir las
Programa
1 Arrays de Proteínas
2 Servicio Arrays de Proteínas UAT: Tecnología Zeptosens
3 Flujo de trabajo de un ensayo con Reverse Protein Arrays
4 Optimización del Servicio en la UAT
5 Resultados y Análisis de Datos
7
7
6
7
Optimización del Servicio en la UAT
4
 Fuente protéica:



Lisados celulares de MCF7 obtenidos por el personal técnico de la UCTS.
Lisados celulares de JIMT1 y KPL4 obtenidos por personal grupo Violeta (Onco).
Muestras humanas de orina obtenidas por personal grupo Ana Meseguer (dpt
Nefropatologia renal)
 Fuente de Anticuerpos Primarios (Validados previamente por western
Blot)


Comprados por la UCTS (AKT, p-AKT, P53, p-P53)
Cedidos por los usuarios
 Fuente de Anticuerpos Secundarios

Comprados por la UCTS
 El resto de reactivos necesarios, incluidos los arrays, son los que se
compraron por la UCT en el 2010.
Optimización del Servicio en la UAT
4
Obtención Lisado Proteico de MCF7
Test de Bradford
Lisado 1
+
+
~70% confluentes
=
1.4 mg/ml
Lisado Proteico
=
3 mg/ml
Lisado Proteico
450 µl Tampón
Lisis zeptosens
Lisado 2
+
~70% confluentes
+
+
~50% confluentes
75 µl/pocillo
Tampón Lisis
zeptosens
 MCF7 es una línia celular humana de cáncer de mama.
 Tampón de Lisis CLB1, Zeptosens#9000 (75 µl/10cm2 pocillo en placas de 6p y 450 µl en placa de 60cm2)
 Cuantificación proteica mediante Test de Bradford (recomendado por zeptosens)
 El lisado proteico tiene que estar normalizado a 2 mg/ml.
Optimización del Servicio en la UAT
4
EXPRESION PROTEICA DE PS6-240/244 EN MCF7
1A_Exp3
Humidificat/estufa
BSA-AlexaFluor647
Lisado 1
1.4 mg/ml
Lisado 2
2 mg/ml
L1
L1
L2
Chip-1
1/500
PS6-240/244
L2
L1
A
L2
1/500
P53-p
B
1/500
P4EBP16S
C
Mg/ml
2
0.
1
2
5
0. .15 0. 0.0
0
0.1 0.05
L1
1/250
PS6-240/244P D
1/250
AKT
E
1/250
P4EBP16S
F
L1
L2
2
0. .15 0.1 .05
0
0
Diluciones Lisado
(Mg/ml)
L2
Programa
1 Arrays de Proteínas
2 Servicio Arrays de Proteínas UAT: Tecnología Zeptosens
3 Flujo de trabajo de un ensayo con Reverse Protein Arrays
4 Optimización del Servicio en la UAT
5 Resultados y Análisis de Datos
7
7
6
7
Institut de Recerca
Hospital Universitari Vall d’Hebron
Institut d’Investigació Sanitària de l’Instituto de Salud Carlos III (ISCIII)
Resultados
y Análisis
de Datos
de Zeptosens
Arrays de Proteínas
ZEPTOSENS
5 de Diciembre del 2012
Ferran Briansó Castilla (UEB) ferran.brianso@vhir.org
Programa
1 Arrays de Proteínas
2 Servicio Arrays de Proteínas UAT: Tecnología Zeptosens
3 Flujo de trabajo de un ensayo con Reverse Protein Arrays
4 Optimización del Servicio en la UAT
5 Resultados y Análisis de Datos
7
7
6
7
Ferran Briansó Castilla (UEB) ferran.brianso@vhir.org
5
5.1 - Visualizado y análisis básico
de resultados (ZeptoView)
5.2 - Exportar resultados
5.3 - Análisis y representación de
datos “a medida” en la UEB
Resultados y Análisis de Datos
5
Árbol
del
experimento
(nodos
expandibles)
Visualización de resultados: Calcular datos a partir de las imágenes
Selector
de
imágenes
Panel
de visualización
de resultados
5
Visualización de resultados: Calcular datos a partir de las imágenes
Calcular resultados
5
Visualización de resultados: Calcular datos a partir de las imágenes
Configuración
de
parámetros
5
Selección
del
chip
Visualización de resultados: Árbol de selección de datos
5
Visualización de resultados: de un array en un chip
Selección
del
array
5
Visualización de resultados: “Base Module” (RNFI values)
Valores obtenidos por
cada dilución
5
Visualización de resultados: “Base Module” (RNFI values)
Visualización del
array completo
5
Visualización de resultados: “Reverse Array Module” (RFI values)
Valores calculados
por cada posición
5
Visualización de resultados: “Reverse Array Module” (RFI values)
Gráfico de
valores RFI
calculados
5
Visualización de resultados: “Concentration Series”
Series de concentración
(2 valores por cada dilución relativa)
5
5.1 - Visualizado y análisis básico
de resultados (ZeptoView)
5.2 - Exportar resultados
5.3 - Análisis y representación de
datos “a medida” en la UEB
Resultados y Análisis de Datos
5
Exportar resultados: tablas de RNFI
Desde el nodo de imágenes
exportar tablas RNFI
5
Exportar resultados: tablas de RNFI
5
Exportar resultados: tablas de RFI
Desde el nodo de imágenes
exportar tablas RFI
5
Exportar resultados: tablas de RFI
Exportar resultados: gráficos (?!?)
5
Parámetros gráficos
configurables caso a caso
(no en global?!?!)
5
5.1 - Visualizado y análisis básico
de resultados (ZeptoView)
5.2 - Exportar resultados
5.3 - Análisis y representación de
datos “a medida” en la UEB
Resultados y Análisis de Datos
5
Análisis avanzado y representación de datos “a medida”
5
Análisis avanzado y representación de datos “a medida”
Estudio de los valores obtenidos en cada serie
de 8 lecturas de cada posición del array
L1
L2
L1
L2
L1
0.2
L2
1
0.2 .15 0. 0.05
0
0.1 0.05
L1
L1
L2
0.2 0.15 0.1 .05
0
Diluciones Lisado
(Mg/ml)
L2
5
Análisis avanzado y representación de datos “a medida”
Construcción de la regresión lineal
y detección de valores extraños
5
Análisis avanzado y representación de datos “a medida”
según el nivel de confianza
(usualmente a 95%)
RFI = Valor predicho para
una RelDilution de 0.625
límite superior de la predicción puntual
límite superior de la predicción conjunta
recta de regresión a partir de los 8 valores
límite inferior de la predicción conjunta
límite inferior de la predicción puntual
lecturas reales a cada
dilución relativa
5
Análisis avanzado y representación de datos “a medida”
Representación gráfica agrupando por
experimentos,
chips,
arrays,
anticuerpo
factores secundarios
...
Que nos permitan comparar muestras
entre ellas, según condiciones experimentales...
5
Análisis avanzado y representación de datos “a medida”
5
Análisis avanzado y representación de datos “a medida”
Otras formas de
representación gráfica
5
Análisis avanzado y representación de datos “a medida”
Outputs (pdf, jpg...) hechos a medida
(y con calidad para ser publicados!)
Materiales disponibles en:
http://ueb.vhir.org/NGS2012