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Paneles de genes “custom-made”
Tecnología HaloPlex by
Genycell Biotech España
GENYCELL BIOTECH, S.L. Garrido Atienza nº2, Par. 2 – Polígono Industrial Dos de Octubre
18320 SANTA FE – GRANADA – SPAIN
Tel. 902 194 353 / Fax. 958 513 149
SERVICIO NGS CLÍNICA HALO: OVERVIEW
1. DISEÑO DEL PANEL DE GENES Y DEL KIT DE CAPTURA
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2. PREPARACIÓN DE LA MUESTRA EN EL LABORATORIO
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El soporte técnico
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Una vez finalizado el protocolo de captura, se lleva a cabo un
BioAnalyzer con un chip High-Sensitivity DNA para comprobar que
el perfil de cada muestra se parece a esto:
Además de verificar que la
mayoría de los fragmentos se
encuentran entre 22bp5 y
575bp,
se
hará
una
cuantificación integrada de
cada muestra entre 175bp y
625bp.
Si se observa presencia de picos de pequeño tamaño (80bp y/o
130bp) se deberá realizar una segunda ronda de purificación con
beads magnéticas.
El valor de la cuantificación integrada del BioA en nM se usará
para diluir cada muestra a 2nM en un total de 100ul.
Ci Vi = Cf Vf
Ci = Concentración integrada del BioA en nM; Cf = 2nM; Vf = 100ul
Vi = Cf Vf / Ci
Vi = 200 / Ci = ul habrá que pipetear de cada muestra y completar
hasta 100ul con agua. Juntar en un POOL todas las diluciones.
Genycell Biotech comprobará la viabilidad de cada muestra y librería
y una vez se tenga la certeza de que todo está bien, se procederá a
hacer el pool. Genycell Biotech declina toda responsabilidad sobre
los resultados si se comprueba que la preparación del pool no se hizo
según los pasos establecidos en este documento.
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3. SECUENCIACIÓN
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4. ANÁLISIS DE DATOS
1 AÑO DE ALMACENAMIENTO
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ANTES DE EMPEZAR
1. REACTIVOS NECESARIOS
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El kit HaloPlex incluye:
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2. APARATAJE Y EQUIPAMIENTO NECESARIOS
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3. REACTIVOS Y EQUIPAMIENTO NECESARIOS PARA LAS VALIDACIONES
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4. REQUERIMIENTOS DEL gDNA
Estar disuelto en agua.
Ratio 260/280 entre 1.8 y 2.0.
Ratio 260/230 a partir de 1.8.
Comprobación de la integridad de la muestra mediante gel de agarosa.
Cuantificación por fluorometría (Qubit o PicoGreen).
Evitar cualquier presencia de inhibidores como EDTA..
5. PUNTOS CRÍTICOS
DIGESTIÓN: Mezclar bien las enzimas entre sí y en el orden indicado.
HIBRIDACIÓN: No mezclar todas las digestiones sino ir añadiéndolas de una
en una al tubo recolector que contiene la solución de inactivación.
Se desaconseja profundamente dejar que la hibridación dure más del tiempo
establecido en el protocolo.
CAPTURA con NaOH: Dejar las muestras en contacto con la NaOH más
tiempo del indicado en el protocolo puede tener consecuencias desastrosas.
PCR: El número de ciclos de la PCR viene indicado en el CoA el cual está en
el BOX 1 de reactivos del kit.
PURIFICACIÓN de productos de PCR: Si tras la purificación con las beads
magnéticas se observan picos a 80bp y 130bp de mucha intensidad, hacer un
segundo round. De hecho, se ha comprobado que hacer directamente dos
rondas de purificación con las beads magnéticas mejora visiblemente los
resultados. Tres o cuatro lavados con EtOH en vez de dos también son
aconsejables, cambiando el strip de posición en el imán para favorecer la
interacción de los reactivos.
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6. CONSEJOS ÚTILES
Nombrar cada PCR/incubación y pre-programar el termociclador con cada
una de ellas.
Pre-calentar la tapa del termociclador a 105ºC.
Intentar evitar las rampas de temperatura y favorecer el choque térmico.
Para los cálculos de volúmenes de NaOH y Ácido Acético, tener en cuenta
que en ambos casos MOLARIDAD = NORMALIDAD ya que en ambos el Nº de
Equivalentes = 1.
A la hora de trabajar con 12 muestras, es más cómodo hacerlo con 2 strips
de 8 tubos y cortarle a cada uno dos pocillos. Marcarlos bien con rotuladores
indelebles para saber cuál es el pocillo 1 y cuál el 12. OJO! Porque al añadir
EtOH puede que dichas marcas se borren.
En el paso 6 (Elución del DNA capturado) es CRÍTICO usar 50mM NaOH
preparada a partir de, al menos, 10M NaOH.
Dejar atemperar siempre las beads magnéticas antes de utilizarlas.
No se podrá seguir adelante con el proyecto (Secuenciación) si las muestras
NO CUMPLEN los parámetros de calidad del paso 9 (Validación y
cuantificación del DNA target).
Para hacer el pool habrá que calcular los ul necesarios para obtener 100ul
de solución 2nM de CADA UNA DE LAS MUESTRAS y luego juntar todos esos
“100ul” en un único eppendorf. Eso será el pool final a secuenciar.
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