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ab177848
Anti-Chikungunya Virus
IgM Human ELISA Kit
Instrucciones de uso
Para la medida cuantitativa de IgM frente al Chikungunya Virus en
suero (citrato) y plasma humano.
Este producto es sólo para uso en la investigación y no está diseñado
para uso diagnóstico
Version 3 Last Updated 21 July 2016
Tabla de Contenidos
INTRODUCCIÓN
1.
2.
ANTECEDENTES
DESCRIPCIÓN DEL ENSAYO
2
4
INFORMACION GENERAL
3.
4.
5.
6.
7.
8.
PRECAUCIONES
CONSERVACIÓN Y ESTABILIDAD
REACTIVOS INCLUIDOS
COMPONENTES REQUERIDOS, NO INCLUIDOS
LIMITACIONES
CONSEJOS TÉCNICOS
5
5
5
6
6
7
PREPARACION DEL ENSAYO
9.
10.
11.
12.
PREPARACIÓN DE REACTIVOS
TOMA DE MUESTRAS Y CONSERVACIÓN
PREPARACIÓN DE MUESTRAS
PREPARACIÓN DE LAS PLACAS
8
8
9
9
PROCEDIMIENTO DEL ENSAYO
13.
PROCEDIMIENTO DEL ENSAYO
10
ANALISIS DE DATOS
14.
15.
CÁLCULOS
VALORES TÍPICOS DE LAS MUESTRAS
13
15
RECURSOS
16.
17.
18.
19.
ESPECIFICACIONES ANALÍTICAS DEL ENSAYO
INTERFERENCIAS
RESOLUCIÓN DE PROBLEMAS
NOTAS
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15
17
17
19
1
INTRODUCCION
1.
ANTECEDENTES
El kit de Abcam Anti-Chikungunya Virus IgM Human ELISA (EnzymeLinked Immunosorbent Assay) está diseñado para la determinación
cuantitativa de anticuerpos de clase IgM frente al virus Chikungunya
en muestras de suero y plasma humano.
El kit incluye una placa de 96 pocillos que ha sido cubierta con
anticuerpos anti-Human que se unen a los anticuerpos presentes en la
muestra. A continuación, los controles y las respectivas muestras se
añaden a los pocillos y se realiza una incubación. Tras un primer
lavado, el antígeno del virus Chikungunya se añade a los pocillos y se
realiza otra incubación. A continuación, los pocillos se lavan de nuevo
y se añaden anticuerpos anti-Chikungunya biotinilados. Después de la
incubación y un lavado final, se añade el conjugado “Streptavidine
peroxidase (SP)” que se une a los anticuerpos biotinilados específicos
para el virus Chikungunya. El TMB es catalizado por la enzima SP
para generar un producto color azul que cambia a amarillo cuando se
añade la solución ácida de parada (Stop Solution). La densidad de
color amarillo es directamente proporcional a la cantidad de
anticuerpos IgM anti Chikungunya capturados en la placa.
El virus Chikungunya es un virus del género Alphavirus (familia
Togaviridae) llevado por artrópodos (arthropod borne virus). El género
Alphavirus contiene al menos 24 especies. Consisten en viriones
envueltos en lípidos con un diámetro entre 50 y 60 nm y se transmiten
por la picadura de mosquitos infectados. Tras un periodo de
incubación de 1 a 12 días se desarrolla la fiebre Chikungunya.
Chikungunya significa “enfermedad del hombre retorcido”, en
referencia a los síntomas incapacitantes que genera. La enfermedad
consiste en una infección viral aguda caracterizada por una rápida
transición entre un estado saludable y un estado que incluye dolores
articulares severos y fiebre alta. La temperatura sube rápidamente,
hasta incluso 40°C, y se acompaña frecuentemente de escalofríos y
temblores. Después de varios días, la fiebre puede ir y venir durante
varios ciclos. El dolor articular se da preferentemente en las
articulaciones pequeñas y en zonas con lesiones anteriores. Los
pacientes normalmente evitan el
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2
INTRODUCCION
movimiento lo máximo posible. Las articulaciones pueden inflamarse y
mostrar acumulación de fluidos. Estos síntomas pueden durar desde 1
semana hasta varios meses y están acompañados de mialgia. La
enfermedad cursa con la aparición de una erupción cutánea que suele
aparecer el primer día de la enfermedad, aunque a veces lo haga
posteriormente. Normalmente aparece como un enrojecimiento en la
cara y el cuello, que evoluciona a una erupción maculopapular o
macular que puede ser pruriginosa. Esta última lesión suele aparecer
en el tronco, las extremidades, cara, palmas de las manos y plantas
de los pies, por orden de frecuencia. En ocasiones también se
observan petequias. Otros síntomas son dolor de cabeza, fotofobia,
dolor retro-orbital, inflamación de garganta con signos de faringitis,
náuseas y vómitos. Ocasionalmente, sin embargo, se observa artralgia
y poliartritis (que duran meses o incluso años), a veces con
destrucción de articulaciones. Otras secuelas muy poco frecuentes
son la encefalitis y meningoencefalitis, ambas con altos niveles de
mortalidad. El virus tiene una gran importancia en África y Asia. Entre
el 20% y más del 90% de la población tropical y subtropical muestra
signos serológicos de infección. El incremento de la prevalencia de
mosquitos Aedes en el Norte de África y en Sudamérica aumenta la
posibilidad de epidemias. Infecciones por el Virus Chikungunya
pueden ocurrir en Europa Central debido a viajeros que vuelven de
países tropicales o subtropicales.
Especies
Enfermedad
Virus
Chikungunya
(Alphavirus)
Fiebre
Chikungunya
Síntomas
Fiebre, exantema, dolor
articular, artralgia y
poliartritis, a veces con
destrucción de
articulaciones. En raras
ocasiones encefalitis y
meningoencefalitis.
Mecanismo de
infección
Transmisión por la
picadura de mosquito
Aedes albopictus
(Africa)
Aedes aegypti (Africa,
Asia)
La presencia de infección viral puede ser identificada por

Serología: Detección de anticuerpos por IF, ELISA.
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3
INTRODUCCION
2. DESCRIPCIÓN DEL ENSAYO
Preparar todos los reactivos, muestras, controles y
estándares.
Añadir las muestras, estándares y controles a los
pocillos.
Después de lavar, añadir el anticuerpo biotinilado a
cada pocillo e incubar.
Después de lavar, añadir el SP-Conjugate a cada
pocillo e incubar.
Después de lavar, añadir el sustrato TMB a cada
pocillo. Incubar a temperatura ambiente. Añadir la
Stop Solution a cada pocillo. Medir inmediatamente.
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4
INFORMACION GENERAL
3. PRECAUCIONES
Por favor lea las instrucciones antes de comenzar el ensayo.
Todos los componentes del kit han sido formulados y testados para
funcionar como un kit. Cualquier modificación en los componentes o
procedimientos puede resultar en una disminución de la eficacia del
kit.
4. CONSERVACIÓN Y ESTABILIDAD
Guarde el kit a 2-8°C inmediatamente después de recibirlo.
La información sobre la conservación de cada componente del kit se
encuentra en la lista de reactivos incluidos. Las condiciones de
conservación de los reactivos preparados se encuentran en la sección
9. Preparación de reactivos.
5. REACTIVOS INCLUIDOS
Componente
Cantidad
Conservación
(antes de la
preparación)
IgM Sample Diluent***
96
pocillos
100 mL
Stop Solution
15 mL
2-8°C
20X Washing Solution*
Chikungunya Virus antigen Solution 1
(Liofilizado)****
Chikungunya Virus biotinylated antibody Solution
2****
Streptavidin Conjugate**
50 mL
2-8°C
6 tubos
2-8°C
6 mL
2-8°C
6 mL
2-8°C
TMB Substrate Solution
15 mL
2-8°C
Chikungunya Virus IgM Positive Control****
1.5 mL
2-8°C
Chikungunya Virus IgM Cut-off Control****
2 mL
2-8°C
Chikungunya Virus IgM Negative Control***
1.5 mL
2-8°C
Anti-Human (IgM) Coated Microplate (12 x 8 wells)
*
2-8°C
2-8°C
Contiene 0.1% Bronidox L después de la dilución
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5
INFORMACION GENERAL
**
Contiene 0.2% Bronidox L
***
Contiene 0.1% Kathon
****
Contiene 0.02% Kathon y 0.02% Bronidox L después de la
reconstitución
6. COMPONENTES REQUERIDOS, NO INCLUIDOS
Estos componentes no están incluidos en el kit pero son necesarios
para realizar el ensayo:

Lector de microplacas capaz de medir absorbancias a 450 nm o
620 nm.

Incubador de 37°C

Pipetas de un canal y multicanal para volúmenes de entre 10 µL y
1000 µL

Opcional: Lavador de placas automático

Vortex

Agua desionizada o agua destilada reciente

Tubos desechables

Cronómetro
7. LIMITACIONES

Este kit de ELISA está diseñado para investigación, no para su
utilización en ensayos diagnósticos.

Todos los componentes de origen humano utilizados para la
producción de estos reactivos han sido testados para la detección
de anticuerpos anti-HIV, anti-HCV y anti HBsAg siendo negativos.
Sin embargo, todos los componentes deben tratarse y
manipularse como potencialmente infecciosos.

El componente Chikungunya Virus antigen Solution 1 está
inactivado. Sin embargo, todos los componentes deben tratarse y
manipularse como potencialmente infecciosos. Es necesario llevar
guantes durante la realización del ensayo. Se recomienda
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6
INFORMACION GENERAL
manipular la Chikungunya Virus antigen Solution 1 en una cabina
de seguridad BSL2.





Utilize solamente pipetas y material limpio.
No intercambie los tapones de los reactivos para evitar
contaminación cruzada.
Cierre los viales de reactivos inmediatamente después de su uso
para evitar evaporación y contaminación microbiológica.
Revise los viales de conjugado y controles después de abrirlos por
primera vez y sucesivas veces para descartar contaminación
microbiológica.
Para evitar la contaminación cruzada y falsos positivo, pipetee las
muestras y el conjugado, sin salpicar, en la parte más baja del
pocillo.
8. CONSEJOS TÉCNICOS





Evite la formación de burbujas al mezclar o reconstituir los
reactivos.
Evite la contaminación cruzada de muestras y reactivos
cambiando las puntas entre la adición de las muestras, los
estándares y los reactivos.
Asegúrese de que las placas están bien selladas o cubiertas
durante las incubaciones.
La retirada completa de las soluciones durante los lavados es
necesaria para obtener lecturas precisas.
El formato de este kit se basa en el número de ensayos. Un
ensayo se refiere a un solo pocillo. El número de pocillos que
contienen la muestra, los controles y los estándares puede
variar dependiendo del ensayo. Se recomienda revisar el
protocolo de forma completa para confirmar que este kit se
adapta a sus necesidades. Por favor, contacte con nuestro
servicio de Soporte Técnico si necesita cualquier información
adicional.
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7
PREPARACION DEL ENSAYO
9. PREPARACIÓN DE REACTIVOS
Equilibrar todos los reactivos, muestras y controles a temperatura
ambiente (18-25°C) antes de su utilización.
9.1
1X Washing Solution:
Preparar 1X Washing Solution diluyendo 20X Washing
Solution con agua desionizada. Para preparar 200 mL de 1X
Washing Solution es necesario mezclar 10 mL de 20X
Washing Solution con 190 mL de agua desionizada. Mezclar
bien cuidadosamente.
9.2

1X Chikungunya Virus Solution 1:
Añadir 1 mL de 1X Washing Solution a cada vial. Incubar
durante 15 minutos a temperatura ambiente con agitación
lenta. La solución reconstituida es estable durante 24 horas
a 2-8°C.
Las demás soluciones se encuentran ya preparadas listas para su
uso.
10.TOMA DE MUESTRAS Y CONSERVACIÓN

Utilizar muestras de suero o plasma (citrato) para este ensayo. Si
el ensayo se realiza durante los primeros 5 días después de la
obtención de la muestra, ésta debe guardarse a 2-8°C. Si no, la
muestra debe ser alicuotada y congelada (-20°C a -80°C). Si las
muestras han sido congeladas, después de la descongelación
deben mezclarse bien antes de realizar el ensayo.
Se deben evitar los ciclos repetidos de congelacióndescongelación.
No se recomienda la utilización de muestras que han sido
inactivadas por calor.
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8
ASSAY PRE
PREPARACION DEL ENSAYO
11.PREPARACIÓN DE MUESTRAS

Antes del ensayo, las muestras deben ser diluidas 1:100 con IgM
Sample Diluent. Añadir 10 µL de muestra a 1 mL de IgM Sample
Diluent para obtener una dilución 1:100. Mezclar bien
cuidadosamente.
12.PREPARACIÓN DE LAS PLACAS



La placa de 96 pocillos incluida en el kit está preparada y lista
para su uso. No es necesario lavar la placa antes de su utilización.
Las tiras que no se utilicen deben meterse de nuevo en su
envoltorio y deben ser guardadas a 4°C.
Para cada ensayo, al menos 1 pocillo debe ser utilizado como
blanco, omitiendo la adición de la muestra y el conjugado. Por
razones estadísticas, se recomienda que cada estándar y cada
muestra se ensaye un mínimo de dos veces (por duplicado).
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9
PROCEDIMIENTO DEL ENSAYO
13.PROCEDIMIENTO DEL ENSAYO





Equilibre todos los materiales y reactivos preparados a
temperatura ambiente antes de su utilización.
Por favor, lea el protocolo detenidamente antes de realizar el
ensayo. La fiabilidad del ensayo depende del seguimiento
estricto del protocolo descrito.
Si se realiza el ensayo ELISA en un sistema automático
recomendamos incrementar el número de lavados de 3 a 5 y
el volumen de la solución de lavado (Washing Solution) de
300 µL a 350 µL.
Todos los controles
(Chikungunya Virus IgM Positive,
Chikungunya Virus IgM Negative y Chikungunya Virus IgM
Cut-off ) deben ser incluidos en cada ensayo.
Se recomienda realizar los ensayos de los estándares,
controles y muestras por duplicado.
13.1
Preparar todos los reactivos, estándares y muestras como
se ha indicado previamente.
13.2
Separar las tiras que no se vayan a utilizar del resto de la
placa y guardarlas de nuevo en su envoltorio conteniendo
el desecante, sellar y guardar a 4°C.
13.3
Añadir 50 µL de los controles o de las muestras diluidas a
los pocillos correspondientes. Reservar un pocillo para el
blanco de sustrato.
13.4
Cubrir los pocillos con la lámina que contiene el kit e
incubar durante 1 hora a 37°C.Measure output on a
microplate reader.
13.5
Retirar la lámina, aspirar el contenido de los pocillos y
lavarlos 3 veces con 300 µL de 1X Washing Solution. Evitar
salpicar los otros pocillos durante los lavados. El tiempo de
cada lavado debe ser al menos superior a cinco segundos.
Después del último lavado, retirar la 1X Washing Solution
por aspiración o decantación. Invertir la placa y depositarla
sobre papel limpio para retirar el exceso de líquido.
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10
ASSAY PRE
PROCEDIMIENTO DEL ENSAYO
Nota: La retirada total de líquido en cada paso es esencial
para el buen funcionamiento del ensayo.
13.6
Añadir 50 µL de 1X Chikunguya Virus Solution 1 a todos
los pocillos excepto al blanco. Cubrir con la lámina.
13.7
Incubar 30 minutos a temperatura ambiente. No exponer a
la luz directa.
13.8
Repetir los lavados descritos en el paso 13.5.
13.9
Añadir 50 µL de 1X Chikunguya Virus Solution 2 a todos
los pocillos excepto al blanco. Cubrir con la lámina. Incubar
30 minutos a temperatura ambiente. No exponer a la luz
directa.
13.10 Repetir los lavados descritos en el paso 13.5.
13.11 Añadir 50 µL de SP Conjugate a todos los pocillos excepto
al blanco. Cubrir con la lámina. Incubar 30 minutos a
temperatura ambiente. No exponer a la luz directa.
13.12 Repetir los lavados descritos en el paso 13.5.
13.13 Anadir 100 µL de TMB Substrate Solution a todos los
pocillos.
13.14 Incubar durante 15 minutos exactos a temperatura
ambiente en oscuridad.
13.15 Añadir 100 µL de Stop Solution a todos los pocillos en el
mismo orden y a la misma velocidad que se ha añadido la
TMB Substrate Solution.
Nota: Todo el color azul que aparece durante la incubación se
convierte en amarillo. Las muestras con una señal positiva muy fuerte
pueden causar una precipitación oscura que corresponde al
cromógeno. Estos precipitados influyen en las medidas de densidad
óptica. En estos casos se recomienda la predilución de las muestras
con PBS, por ejemplo 1:1. Después se debe diluir la muestra 1:100
con IgM Sample Diluent y multiplicar los resultados de Unidades
Estándar por 2 (ver sección 14. Cálculos).
13.16 Medir la absorbancia a 450 nm durante los 30 minutos
después de la adición de la Stop Solution.
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11
ASSAY PRE
PROCEDIMIENTO DEL ENSAYO
Se recomienda la lectura dual de la absorbancia tomando
620 nm como longitud de onda de referencia.
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12
ANALISIS DE DATOS
14.CÁLCULOS
Para que el ensayo se considere válido es necesario que se cumplan
los siguientes criterios:




Blanco de sustrato: Valor de la absorbancia <0.100
Control negativo: Valor de la absorbancia <cut-off
Control Cut-off: Valor de la absorbancia 0.150-1.300
Control positivo: Valor de la absorbancia >cut-off
Si estos criterios no se cumplen, el ensayo no es válido y debe
repetirse.
Cálculo de resultados
Calcular la media de las absorbancias de cada muestra restando el
blanco y comparar con el valor del control Cut-off.
El valor del control cut-off es la absorbancia media de los pocillos con
el control cut-off.
Ejemplo:
Absorbancia de control cut-off Pocillo 1 = 0.156
Absorbancia de control cut-off Pocillo 2 = 0.168
Media del control Cut-off: (0.156+0.168)/2=0.162
Interpretación de los resultados
Se considera que una muestra es positiva si la absorbancia es al
menos un 10% mayor que el valor de cut-off.
Las muestras con un valor por debajo del 10% más que el Cut-off o
por debajo del mismo deben considerarse no concluyentes (zona gris),
es decir, ni positivas ni negativas. Se recomienda en estos casos
repetir el ensayo utilizando muestras frescas. Si los resultados del
segundo ensayo están de nuevo por debajo del 10% más que el Cutoff o por debajo del Cut-off la muestra ha de considerarse negativa.
Una muestra se considera negativa cuando la absorbancia es menor
que el 10% menos que el Cut-off.
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13
ANALISIS DE DATOS
Resultados en Unidades Estándar
(𝑚𝑒𝑑𝑖𝑎) 𝑥10 = 𝑈𝑛𝑖𝑑𝑎𝑑𝑒𝑠 𝐸𝑠𝑡á𝑛𝑑𝑎𝑟
(𝐴𝑏𝑠𝑜𝑟𝑏𝑎𝑛𝑐𝑖𝑎 𝑑𝑒𝑙𝐶𝑢𝑡𝑝𝑎𝑐𝑖𝑒𝑛𝑡𝑒
)
‒ 𝑜𝑓𝑓
Ejemplo:
𝑥10
(1.786
0.38 ) = 47 𝑈𝑛𝑖𝑑𝑎𝑑𝑒𝑠 𝐸𝑠𝑡á𝑛𝑑𝑎𝑟
Cut-off:
10
Unidades Estándar
Zona Gris:
9-11
Unidades Estándar
Negativo:
<9
Unidades Estándar
Positivo:
>11
Unidades Estándar
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14
ANALISIS DE DATOS
15.VALORES TÍPICOS DE LAS MUESTRAS
PRECISIÓN-
Suero Positivo Débil
n=
Media
%CV
Intra-ensayo
23
0.62
4.8
Inter-ensayo
3
0.61
7.3
Suero Positivo Fuerte
n=
Media
%CV
Intra-ensayo
24
1.36
3.4
Inter-ensayo
3
1.36
2.9
16.ESPECIFICACIONES ANALÍTICAS DEL ENSAYO
ESPECIFICIDADLa especificidad es >90% y se define como la probabilidad de que el
ensayo resulte negativo en ausencia del analito especifico.
SENSIBILIDADLa sensibilidad es >90% y se define como la probabilidad de que el
ensayo resulte positivo en presencia del analito específico.
REACTIVIDAD CRUZADANo se ha observado reactividad cruzada usando muestras Rf y
muestras conteniendo anticuerpos frente a Bordetella pertusssis,
Chlamydia trachomatis, Chlamydia pneumoniae, Dengue Virus, TBE,
Helicobacter pylori, HSV 2, Leishmania, Mycoplasma y Schistosoma.
No se puede descartar la reactividad cruzada con anticuerpos frente a
Borrelia, CMV y Toxoplasma.
Es probable encontrar interferencia con la estimulación policlonal de
las infecciones por EBV. En presencia de Mononucleosis infecciosa
(Pfeiffer ́s Disease, infección por EBV) puede ocurrir una estimulación
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15
ANALISIS DE DATOS
policlonal de linfocitos B. Esto puede resultar en reacciones no
específicas en la detección de anticuerpos de la clase IgM. Por este
motivo se recomienda excluir la infección por EBV por diagnóstico
diferencial.
La reactividad con anticuerpos frente al Virus O ́Nyong Nyong no
puede descartarse.
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16
RECURSOS
17.INTERFERENCIAS
No se observaron interferencias al añadir triglicéridos, bilirrubina o
hemoglobina en exceso a las muestras.
18.RESOLUCIÓN DE PROBLEMAS
Problema
Señal
débil
Causa
Tiempo de incubación
muy corto.
Puede formarse un
precipitado después
de añadir el sustrato si
la concentración de la
diana es muy alta.
Utilización de tipo de
muestra incompatible.
Muestra preparada de
manera incorrecta.
Burbujas en los
pocillos.
Todos los pocillos no
han sido lavados
igual.
CV alto
Mezcla de reactivos
incompleta.
Pipeteo inconsistente.
Preparación o
conservación
inconsistente de las
muestras.
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Solución
Intentar incubación toda la
noche a 4°C.
Incrementar el factor de dilución
de las muestras.
La detección puede ser reducida
o nula en tipos de muestras no
probadas anteriormente.
Asegurar la preparación y
dilución correcta de las
muestras.
Asegurar que no hay burbujas
en los pocillos al medir las
absorbancias.
Comprobar que los canales del
lavador de placas no están
obstruidos. Lavar bien tal y
como está recomendado.
Asegurar que todos los reactivos
están bien mezclados.
Utilizar pipetas calibradas para
asegurar un pipeteo preciso.
Asegurar la preparación
consistente de las muestras y
las condiciones de conservación
óptimas (por ejemplo, minimizar
los ciclos de
congelación/descongelación).
17
RECURSOS
Problem
Cause
Los pocillos no
están
suficientemente
lavados.
Ruido de
El Wash Buffer
fondo
está contaminado.
(background)
Se ha esperado
demasiado para
leer la placa
después de añadir
la Stop Solution.
Baja
sensibilidad.
Conservación
incorrecta del kit
de ELISA.
Utilización de tipo
de muestra
incompatible.
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Solution
Lavar bien los pocillos tal y
como recomienda el
protocolo.
Preparar Wash Buffer nuevo.
Leer la placa
inmediatamente después de
añadir la Stop Solution.
Guardar todos los reactivos
como se recomienda. Puede
ser que no todos los
reactivos deban guardarse
en las mismas condiciones.
La detección puede ser
reducida o nula en tipos de
muestras no probadas
anteriormente.
18
RECURSOS
19.NOTAS
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19
RECURSOS
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RECURSOS
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21
RECURSOS
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