Download ab213327 anti-Zika virus IgM μ- capture ELISA kit

Version 1 Last updated 12 mayo 2017
ab213327
anti-Zika virus IgM μcapture ELISA kit
Instrucciones de uso:
Para la detección cuantitativa de anticuerpos IgM contra el virus Zika
en plasma o suero humano (citrato, heparina).
Este producto es sólo para investigación y no está diseñado para
diagnóstico.
Copyright © 2017 Abcam. All rights reserved
Tabla de contenidos:
1.
Antecedentes
1
2.
Descripción Del Ensayo
2
3.
Precauciones
3
4.
Conservación Y Estabilidad
3
5.
Limitaciones
4
6.
Reactivos Incluidos
5
7.
Componentes Requeridos, No Incluidos
5
8.
Consejos Técnicos
6
9.
Preparación De Reactivos
7
10. Toma De Muestras Y Conservación
9
11. Procedimiento Del Ensayo
10
12. Cálculos
12
13. Valores Típicos De Las Muestras
14
14. Procedimiento Rápido Del Ensayo
16
15. Resolución De Problemas
17
16. Interferencias
19
17. Notes
21
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1. Antecedentes
El kit de Abcam Anti-Zika Virus IgM μ-capture in vitro Human ELISA
(Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) kit (ab213327) está diseñado
para la determinación cuantitativa de anticuerpos de clase IgM frente
al virus Zika en muestras de suero y plasma humano (citrato, heparina).
El kit incluye una placa de 96 pocillos que han sido recubiertos con
anticuerpos anti-Human de clase IgM que se unen a los anticuerpos
presentes en la muestra. Tras los lavados de los pocillos para descartar
la muestra que no se ha unido específicamente, se añade el antígeno
de virus Zika conjugado a HRP (horseradish peroxidase). El antígeno
conjugado se une a los anticuerpos IgM capturados específicamente.
En un segundo paso de lavado se elimina el conjugado que no se ha
unido. El complejo inmunológico formado por el conjugado unido se
visualiza añadiendo el substrato Tetramethylbenzidina (TMB) que da
lugar a un producto azul. Finalmente, se añade ácido sulfúrico para
parar la reacción, lo que da lugar a un color final amarillo. Usando un
lector de placas de pocillo ELISA se mide la absorbancia a 450/620
nm.
La intensidad de este producto es proporcional a la cantidad de
anticuerpos específicos IgM en la muestra.
El virus Zika (ZIKV) es un virus un virus monocatenario de ARN de la
familia Flaviviridae (género Flavivirus). Se aisló por primera vez en 1947
de un macaco Rhesus durante un estudio de fiebre amarilla en los
bosques Zika de Uganda.
ab213327 anti-Zika virus IgM μ-capture ELISA Kit
1
2. Descripción Del Ensayo
Prepare todos los reactivos, muestras, controles y estándares.
Añada las muestras, estándares y controles a los pocillos.
Añada el conjugado marcado con HRP a cada pocillo. Incube a
37ºC.
Después del lavado, añada substrato TMB a cada pocillo.
Incube a temperatura ambiente. Añada la Stop Solution a cada
pocillo. Mida la absorbancia inmediatamente.
ab213327 anti-Zika virus IgM μ-capture ELISA Kit
2
3. Precauciones
Por favor lea estas instrucciones antes de comenzar el ensayo.





Todos los componentes del kit han sido formulados y testados para
funcionar como un kit.
Entendemos que ocasionalmente los protocolos han de ser
modificados para adaptarlos a circunstancias experimentales
especiales. Sin embargo, no podemos garantizar que el producto
vaya a funcionar fuera de las condiciones que se detallan en este
protocolo.
Los reactivos tienen que ser tratados como mutágenicos y deben
ser manejados con precaución y desechados apropiadamente.
Por favor revise con atención la ficha de seguridad (Safety
Datasheet: SDS) que se adjunta con el producto para obtener más
información sobre los componentes específicos.
Siga buenas prácticas de laboratorio. Use siempre guantes, bata
de laboratorio y gafas de protección. No pipetee nunca con la
boca. No coma, beba o fume dentro del área de laboratorio.
Todos los materiales biológicos deben ser considerados como
potencialmente peligrosos y ser tratados como tal. Deben ser
desechados de acuerdo con los procedimientos locales de
seguridad establecidos.
4. Conservación Y Estabilidad
Guarde el kit a 4°C inmediatamente después de recibirlo.
Por favor, consulte la lista de materiales incluidos para ver las
condiciones de almacenamiento de cada componente. La
información sobre la conservación de cada componente del kit se
encuentra en la sección de “Reactivos Incluidos”.
Alicuotee los componentes en volúmenes de trabajo adecuados
antes de almacenarlos a la temperatura indicada.
ab213327 anti-Zika virus IgM μ-capture ELISA Kit
3
5. Limitaciones








Este kit de ELISA está diseñado para investigación, no para su
utilización en ensayos diagnósticos.
Todos los componentes de origen humano utilizados para la
producción de estos reactivos han sido testados para la detección
de anticuerpos anti-HIV, anti-HCV y anti HBsAg siendo negativos.
Sin embargo, todos los componentes deben tratarse y manipularse
como potencialmente infecciosos.
Utilice solamente pipetas y material limpio.
No intercambie los tapones de los reactivos para evitar
contaminación cruzada.
Cierre los viales de reactivos inmediatamente después de su uso
para evitar evaporación y contaminación microbiológica.
Revise los viales de conjugado y controles después de abrirlos por
primera vez y sucesivas veces para descartar contaminación
microbiológica.
Para evitar contaminación cruzada y falsos positivos, pipetee las
muestras y el conjugado cuidadosamente en el fondo del pocillo
sin salpicaduras.
Contaminación bacteriológica o ciclos de congelado y
descongelado de la muestra puede afectar los valores de
absorbancia.
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6. Reactivos Incluidos
Componente
Anti-Human IgM coated
Microplate (12 x 8 wells)
IgM Sample Diluent
Stop Solution
20X Wash Buffer
Concentrate
Zika Virus Conjugate
TMB Substrate Solution
Zika Virus IgM Positive
Control
Zika Virus IgM Cut-off
Control
Zika Virus IgM Negative
Control
Papel de cobertura
Cantidad
Conservación
(antes de la
preparación)
Conservación
(después de la
preparación)
96 pocillos
4⁰C
4⁰C
100 mL
15 mL
4⁰C
4⁰C
4⁰C
4⁰C
50 mL
4⁰C
4⁰C
15 mL
15 mL
4⁰C
4⁰C
4⁰C
4⁰C
2 mL
4⁰C
4⁰C
3 mL
4⁰C
4⁰C
2 mL
4⁰C
4⁰C
1 Unidad
4⁰C
4⁰C
7. Componentes Requeridos, No Incluidos
Estos componentes no están incluidos en el kit pero son necesarios
para realizar el ensayo:

Lector de microplacas capaz de medir absorbancias a 450 nm/
620 nm.

Incubador de 37°C

Pipetas de un canal y multicanal para volúmenes de entre 10 µL y
1000 µL

Opcional: Lavador de placas automático

Vortex

Agua desionizada (MilliQ) o agua destilada reciente (ddH2O)

Tubos desechables
ab213327 anti-Zika virus IgM μ-capture ELISA Kit
5
8. Consejos Técnicos








Evite la formación de burbujas al mezclar o reconstituir los
reactivos.
Evite la contaminación cruzada de muestras y reactivos
cambiando las puntas entre la adición de las muestras, los
estándares y los reactivos.
Asegúrese de que las placas están bien selladas o cubiertas
durante las incubaciones.
La retirada completa de las soluciones durante los lavados es
necesaria para obtener lecturas precisas.
La adición de la solución de substrato TMB inicia una reacción
quinética que finaliza cuando se añade la Stop Solution. Por lo
tanto, las soluciones de substrato TMB y Stop deben ser añadidas
en la misma secuencia para evitar variaciones de tiempo.
Es importante que el tiempo de incubación en cada pocillo sea
constante para obtener resultados reproducibles. El pipeteo de las
muestras no debe ser extendido a más de diez minutos para evitar
variaciones de incubación. Si se necesitan más de diez minutos,
siga el mismo orden de pipeteo. Si se utiliza más de una placa, se
recomienda repetir la curva de respuesta a dosis en cada una.
La eliminación incompleta del líquido de los pocillos puede
influenciar la precisión del ensayo y/o incrementar el ruido de
fondo.
El formato de este kit se basa en el número de ensayos. Un ensayo
se refiere a un solo pocillo. El número de pocillos que contienen la
muestra, los controles y los estándares puede variar dependiendo
del ensayo. Se recomienda revisar el protocolo de forma completa
para confirmar que este kit se adapta a sus necesidades. Por favor,
contacte con nuestro servicio de Soporte Técnico si necesita
cualquier información adicional.
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9. Preparación De Reactivos

9.1
Centrifugue de manera breve los viales pequeños a baja
velocidad antes de abrirlos.
Placa de pocillos Zika Virus IgM:
La placa consiste en tiras de pocillos que se pueden separar las
unas de otras y se pueden usar directamente. Estos pocillos están
recubiertos con anticuerpos anti-Human de clase IgM.
Inmediatamente después de separar las tiras que se vayan a
utilizar, el resto de tiras debe ser resellado con el papel de
aluminio junto al desecante que se provee y almacenado a 4°C.
9.2
IgM Sample Diluent:
Una botella con 100 mL de tampón de fosfato (10 mM) para
diluir las muestras; pH 7.2 ± 0.2; de color verde; para su uso
directo y almacenado a 4°C.
9.3
Stop Solution:
Una botella con 15 mL de ácido sulfúrico, 0.2 ml/L; para su uso
directo y almacenado a 4⁰C.
9.4
20X Wash Buffer Concentrate:
Una botella con 50 mL de un concentrado (20x) de tampón de
fosfato (0.2M); pH 7.2 ± 0.2; para el lavado de pocillos y
almacenado a 4°C. Diluir el concentrado de lavado 1 + 19; por
ejemplo: 10 mL de concentrado de solución de lavado + 190 mL
de agua destilada. El tampón diluido es estable durante 5 días a
temperatura ambiente.
9.5
Zika Virus Conjugate:
Una botella con 15 mL de antígeno de virus Zika conjugado con
peroxidasa (HRP) de color rojo; para su uso directo y
almacenado a 4°C.
9.6
TMB Substrate Solution:
Una botella con 15 mL de 3,3',5,5'-tetramethylbenzidine (TMB) <
0.1%; para su uso directo y almacenado a 4°C protegido de la
luz. La solución debe ser incolora o puede tener un ligero tono
azul. Si el substrato se vuelve azul, puede estar contaminado y
debe ser desechado.
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9.7
Zika Virus IgM Positive Control:
Una botella con 2 mL de control (suero o plasma humano); de
color amarillo; para su uso directo y almacenado a 4°C.
9.8
Zika Virus IgM Cut-off Control:
Una botella con 3 mL de control (suero o plasma humano); de
color amarillo; para su uso directo y almacenado a 4°C.
9.9
Zika Virus IgM Negative Control:
Una botella con 2 mL de control (suero o plasma humano); de
color amarillo; para su uso directo y almacenado a 4°C.
9.10 Cover foil:
Papel de aluminio; para su uso directo y almacenado a 4°C
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10. Toma De Muestras Y Conservación



Utilizar muestras de suero o plasma (citrato o heparina) para este
ensayo. Si el ensayo se realiza durante los primeros 5 días después
de la obtención de la muestra, ésta debe guardarse a 4°C. Si no, la
muestra debe ser alicuotada y congelada (-70°C a -20°C). Si las
muestras han sido congeladas, después de la descongelación
deben mezclarse bien antes de realizar el ensayo. Se deben evitar
los ciclos repetidos de congelación-descongelación.
No se recomienda la utilización de muestras que han sido
inactivadas por calor.
Antes de empezar el ensayo, todas las muestras deben ser diluidas
1/100 con IgM Sample Diluent. Añadir 10 µL de muestra a 1 mL de
Sample Diluent para obtener una dilución 1/100. Mezclar bien
usando un vortex.
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11. Procedimiento Del Ensayo






Por favor, lea el protocolo detenidamente antes de realizar el
ensayo. La fiabilidad del ensayo depende del seguimiento estricto
del protocolo descrito.
Este protocolo ha sido validado para procedimiento manual. Si
realiza el ELISA con sistemas automatizados, recomendamos
incrementar los pasos de lavado de tres a cinco y el volumen de
Washing Solution de 300 µL a 350 µL.
Antes de comenzar el ensayo, planee cuidadosamente la
distribución e identificación para todas las muestras y
estándares/controles (en duplicado). Seleccione el número
requerido de tiras de pocillos e insértelas en el portaplacas.
Realice todos los pasos del ensayo en el orden correcto y sin
retrasos.
Utilice una punta de pipeta desechable para cada muestra,
estándar/control.
Ajuste la temperatura de la incubadora a 37°C ± 1 °C.
11.1 Añadir 100 µL de los estándares/controles y de las muestras
diluidas a los pocillos correspondientes. Reservar un pocillo (A1)
para el control negativo de sustrato (Subtrate Blank).
11.2 Cubrir los pocillos con el papel de aluminio (cover foil) que se
adjunta con el kit.
11.3 Incubar 1 hora ± 5 min a 37°C ± 1°C.
11.4 Retirar la lámina, aspirar el contenido de los pocillos y lavarlos 3
veces con 300 µL de Washing Solution. Evitar salpicar los otros
pocillos durante los lavados. El tiempo de cada lavado debe ser
al menos superior a cinco segundos. Después del último lavado,
retirar la Washing Solution por aspiración o decantación. Invertir
la placa y depositarla sobre papel limpio para retirar el exceso
de líquido.
 Nota: La retirada total de líquido en cada paso es esencial para el
buen funcionamiento del ensayo.
11.5 Añadir 100 µL del Conjugate en todos los pocillos excepto a los
controles negativos de substrato A1 (Substrate Blank well A1)
11.6 Incubar 30 min a temperatura ambiente. No exponer a la luz
directa del sol.
11.7 Repetir el paso 11.4
11.8 Añadir 100 µL de TMB Substrate Solution en todos los pocillos.
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11.9 Incubar exactamente 15 min a temperatura ambiente en la
oscuridad. Se desarrollará un color azul debido a la reacción
enzimática.
11.10 Añadir 100 µL de Stop Solution en todos los pocillos en el mismo
orden seguido al añadir el TMB Substrate, lo que desarrollará el
cambio de color de azul a amarillo.
11.11 Medir la absorbancia a 450/620 nm en los próximos 30 min
después de añadir la Stop Solution.
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12. Cálculos
Ajustar el lector de placas ELISA a cero usando el Substrate Blank. Si el
lector no puede ser ajustado a cero usando el Substrate Blank,
substraer el valor de la absorbancia del blanco a todos los demás
valores para obtener resultados fiables.
Medir la absorbancia de todos los pocillos a 450 nm y escribir estos
valores para cada control y muestra en el plano de la placa.
Se recomienda las mediciones bicromáticas usando como referencia
la longitud de onda de 620 nm.
Cuando sea posible, calcular el valor medio de absorbancia de todos
los duplicados.
Para que el ensayo se considere válido es necesario que se cumplan
los siguientes criterios:




Control negativo de sustrato: Valor de la absorbancia <0.100
Control negativo: Valor de la absorbancia <cut-off
Control Cut-off: Valor de la absorbancia 0.150-1.300
Control positivo: Valor de la absorbancia >cut-off
Si estos criterios no se cumplen, el ensayo no es válido y debe repetirse.
Cálculo de los resultados
El valor del control cut-off es la absorbancia media de los pocillos con
el control cut-off.
Ejemplo: Valor absorbancia control Cut-off 0.44 + valor absorbancia
control Cut-off 0.42 = 0.86/ 2 = 0.43
Cut-off = 0.43
Resultados en unidades Abcam [AU]
Muestra (media) valor de absorbancia x 10 = [Abcam Units = AU]
Cut-off
Ejemplo: 1.591 x 10 = 37 AU (Unidades)
0.43
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Interpretación de Resultados
Result
Value
Cut- off
10 AU
Positive
> 11 AU
Equivocal
9 – 11 AU
Negative
< 9 AU
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13. Valores Típicos De Las Muestras
PRECISIÓN
Intra-Ensayo
Muestra
N
CV (%)
1
24
2.7
2
24
1.65
3
24
1.92
Muestra
N
CV (%)
1
2
3
12
12
12
8.02
5.59
9.17
Inter-Ensayo
Sensibilidad y especificidad en muestras de pacientes
El propósito de este estudio es determinar la eficiencia del ensayo
para discriminar entre muestras clínicas positivas y negativas.
Para evaluar el rendimiento del kit anti-Zika Virus IgM μ-capture ELISA
(ab213327), estudios internos se realizaron con muestras bien definidas.
Muestras de recién nacidos e individuos inmunocomprometidos fueron
excluidas de este ensayo, ya que los datos serológicos de estos
pacientes tienen valores limitados.
122 muestras:

Muestras definidas ZIKV (virus Zika) positivas: 13 muestras

Muestras definidas negativas: 43 muestras de embarazadas
(mujeres sanas, Alemania)

4 Muestras de sangre negativas (Frankfurt, Alemania)

Panel de reactividad cruzada: 62 muestras (incluyendo EEUU,
Uganda, Guadalupe, New Caledonia)
ab213327 anti-Zika virus IgM μ-capture ELISA Kit
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Positivo
anti-Zika Virus
IgM μ-capture
ELISA Kit
Negativ
o
Total
Positivo
9
2
11
Negativo
0
110
110
Total
9
112
121
(Los resultados ambiguos no han sido incluidos en los cálculos)
SENSIBILIDADLa sensibilidad es >90% y se define como la probabilidad de que el
ensayo resulte positivo en presencia del analito específico. En este
caso, es del 100% (9/9).
ESPECIFICIDADLa especificidad es >90% y se define como la probabilidad de que el
ensayo resulte negativo en ausencia del analito específico. En este
caso es del 98.2% (110/112).
Concordancia 98.3% (119/121).
ab213327 anti-Zika virus IgM μ-capture ELISA Kit
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14. Procedimiento Rápido Del Ensayo
 Nota: Este protocolo es una referencia rápida para usuarios
experimentados. Siga el protocolo detallado cuando realice el ensayo
por primera vez.
14.1 Diluir las muestras 1/100 con IgM Sample Diluent.
14.2 Añadir 100 µL estándares/controles y muestras diluidas en sus
pocillos respectivos. Dejar el pocillo A1 para el control negativo
de substrato (Substrate Blank)
14.3 Cubrir los pocillos con el papel de aluminio que se adjunta con el
kit.
14.4 Incubar 1 hora ± 5 min a 37°C ± 1°C.
14.5 Aspirar y lavar 3 veces con 300 µL of Washing Solution. Volcar la
placa sobre papel absorbente para retirar el líquido restante
antes del siguiente paso.
14.6 Añadir 100 µL de Conjugate en todos los pocillos exceptuando el
Substrate Blank A1.
14.7 Incubar 30 min a temperatura ambiente. No exponer a la luz
directa del sol.
14.8 Repetir el paso de lavado.
14.9 Añadir 100 µL de TMB Substrate Solution en todos los pocillos.
14.10 Incubar 15 min a temperatura ambiente en la oscuridad.
14.11 Añadir 100 µL de Stop Solution en todos los pocillos en el mismo
orden y velocidad utlizados para el TMB Substrate.
14.12 Medir la absorbancia a 450/620 nm durante los siguientes 30 min
después la adición de la Stop Solution.
ab213327 anti-Zika virus IgM μ-capture ELISA Kit
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15. Resolución De Problemas
Problema
Señal
débil
Causa
Tiempo de incubación muy
corto
Puede formarse un
precipitado después de
añadir el sustrato si la
concentración de la diana
es muy alta
Muestra utilizada es
incompatible
Muestra preparada de
manera incorrecta
Burbujas en los pocillos
Todos los pocillos no han
sido lavados igual
CV alto
Mezcla de reactivos
incompleta
Pipeteo inconsistente
Preparación o conservación
inconsistente de las
muestras
Solución
Incubar toda la noche a 4°C
Incrementar el factor de
dilución de las muestras
La detección puede ser
reducida o nula en tipos de
muestras no probadas
anteriormente
Asegurar la preparación y
dilución correcta de las
muestras
Asegurar que no hay burbujas
en los pocillos al medir las
absorbancias
Comprobar que los canales
del lavador de placas no
están obstruidos. Lavar bien
tal y como está recomendado
Asegurar que todos los
reactivos están bien
mezclados
Utilizar pipetas calibradas para
asegurar un pipeteo preciso
Asegurar la preparación
consistente de las muestras y
las condiciones de
conservación óptimas (por
ejemplo, minimizar los ciclos
de
congelación/descongelación)
ab213327 anti-Zika virus IgM μ-capture ELISA Kit
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Problema
Ruido de
fondo alto
(background
)
Baja
sensibilidad
Causa
Solución
Los pocillos no
están
suficientemente
lavados
Lavar bien los pocillos tal y
como recomienda el
protocolo
El Wash Buffer está
contaminado
Preparar Wash Buffer nuevo
Se ha esperado
demasiado para
leer la placa
después de añadir
la Stop Solution
Leer la placa
inmediatamente después de
añadir la Stop Solution
Conservación
incorrecta del kit
de ELISA
Guardar todos los reactivos
tal y como se recomienda.
Puede ser que no todos los
reactivos deban guardarse
en las mismas condiciones
Muestra utilizada es
incompatible (ej.
Suero vs extracto
celular)
La detección puede ser
reducida o nula en tipos de
muestras no probadas
anteriormente
ab213327 anti-Zika virus IgM μ-capture ELISA Kit
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16. Interferencias
Altas concentraciones de materiales que pueden causar interferencias
tales como triglicéridos, bilirrubina o hemoglobina pueden interferir con
el ensayo y a dar lugar a falsos negativos o falsos positivos.
Para investigar esta posibilidad, se indagó en las publicaciones
científicas disponibles en combinación con una investigación de
aproximadamente 100 parametros:





Se usaron diferentes kits de ELISA incluyendo los kits de detección
de diferentes isotipos de anticuerpos (IgA, IgG, IgM, IgG + IgM)
contra bacterias, virus, hongos y parásitos, así como un kit ELISA
para la detección de TSH.
Se utilizaron muestras definidas para controles positivos, negativos y
ambiguos.
Se añadió una cantidad determinada de una substancia
potencialmente interferente a cada muestra. La concentración
final de cada sustancia está en rango patológico que ha sido
descrito por otros proveedores (10 mg/mL hemoglobin, 0.5 mg/mL
bilirubin and 5 mg/mL triglycerides). Los resultados obtenidos en la
muestra con el añadido interferente deben estar alrededor del 60140 % del resultado de la muestra sin tratamiento para cumplir los
requerimientos.
Las especificaciones internas de 60-140 % se cumplieron siempre.
No se observaron interferencias con muestras hemolíticas,
lipémicas, ictéricas a una concentración menor de 10 mg/mL
hemoglobina, 0.5 mg/mL bilirubina y 5 mg/mL triglicéridos.
REACTIVIDAD CRUZADA

Se utilizó un panel de 62 especímenes de pacientes confirmados
con otras enfermedades diferentes de infección con Zika (ZIKV)
para establecer la especificidad analítica de este kit anti-Zika Virus
IgM μ-capture ELISA kit.
ab213327 anti-Zika virus IgM μ-capture ELISA Kit
19

Estos especímenes provienen de pacientes con patógenos que
pueden causar síntomas parecidos a los producidos por ZIKV (ej.
DENV, CHIV) o de individuos con enfermedades o condiciones que
tienen una reactividad cruzada potencial tales como otros virus de
la familia Flaviviridae (WNV, TBEV, YFV) o patógenos relacionados
en la activación policlonal de las células B (virus Epstein-Barr, EBV).
Tipo de patógeno o
enfermedad
Número de
muestras
Resultados
Positivos
Dengue virus (DENV)
12
0/12
West Nile virus (WNV)
20
1/20
Tick borne encephalitis virus
(TBEV)
3
0/3
Chikungunya virus (CHIKV)
5
0/5
Yellow Fever virus (YFV)
12
1/12
Epstein-Barr virus
4
0/4
Rheumatoid Factor
5
0/5
ANA
1
0/1
Total
62
2/62

En un panel de especímenes con anticuerpos con posible
reactividad cruzada, sólo mostraron reactividad cruzada mínima
las muestras de West Nile virus (WNV) y Yellow Fever virus (YFV).

Por tanto, en áreas endémicas, infecciones dobles e infecciones
anteriores con otros flavivirus deben tenerse en consideración.
ab213327 anti-Zika virus IgM μ-capture ELISA Kit
20
17. Notes
ab213327 anti-Zika virus IgM μ-capture ELISA Kit
21
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