Download SotomayorAPLICACIONES DEL DIAGNÓSTICO

DIAGNÓSTICO
MOLECULAR GENERADO
POR LA UNAM
MVZ Alicia Sotomayor González
Agente Etiológico
•  Orden :Nidovirales
▫  Familia: Arteriviridae
(Jerusalén, agosto de 1996)
–  Género: Arterivirus
•  Caracteristicas:
▫  Alta variabilidad genética y
antigénica
▫  Infectar macrófagosmonocitos induciendo
infecciones persistentes
▫  Modular el sistema
inmunológico
▫  Capacidad de producir
viremia prolongada
Imagen obtenida de:
www.revistas.uchile.cl
Agente Etiológico
•  8 marcos de lectura abiertos (ORF “open reading frame”)
Genoma del virus de PRRS
RNA polimerasa
Genes
estructurales
codifican la RNA polimerasa viral
codifica para la estructura proteica
GP2
codifica para la estructura proteica
GP3
codifica para la estructura proteica
GP4
reconocer el receptor de células blanco
e induce apoptosis
liberación y ensamblaje de nuevas
partículas virales
Codifica para la proteína N
Agente Etiológico
ORF
5
Codifica para la
proteína de la
envoltura GP5.
ORF
7
Codifica para la proteína
N
Glicoproteína de 200
aminoácidos.
Induce una producción
elevada de anticuerpos
sin actividad protectora
evidente
Es el gen más
variable.
Interactúa con el ARN
viral para el conjunto de
partículas infecciosas.
Se encarga de
reconocer el
receptor celular de
las células blanco e
inducir apoptosis.
Es la más pequeña (20 al
40% de la proteína total
que contiene el virión)
Agente Etiológico
•  Designación de dos serotipos principales
de referencia:
▫  Americano
▫  Europeo
•  Entre ellos la variabilidad genética
puede llegar a ser muy alta (80%).
•  El virus evoluciona por mutaciones al
azar y recombinación antigénica.
Diagnóstico
Diagnóstico:
Detección de
anticuerpos
contra el virus
(serología)
Reacción en
cadena de la
Polimerasa con
Transcriptasa
Reversa (RT PCR)
Identificación:
Aislamiento viral en células
MARK 145
RT-PCR
Secuenciación
RFLP (polimorfismo de
longitud en fragmentos
mediante el uso de patrones
de corte con enzimas de
restricción )
RT-PCR
•  Técnica rápida
•  Elevada especificidad y sensibilidad
•  Útil para la detección del virus
El ARN viral se convierte en ADN
complementario por la enzima RT
Es amplificado por la enzima
Taq polimerasa
Diagnóstico en el DMZ:C
•  Laboratorio BSL-3
Procedimiento para el
Diagnóstico Molecular
del Arterivirus Porcino
Diseño de Oligonucleótidos
ClonManager Versión 7.0
170 secuencias de linaje
americano
50 secuencias de linaje
europeo.
PRIMER
Confirmación de la
alineación.
•  Oligonucleotidos utilizados:
Basic Local Alignment Sequence
Tool (BLAST) del National Center
for Biotechnology Information
(NCBI)
Validar su especificidad única hacia
secuencias de PRRS, así como la
especificidad del linaje origen.
▫  Sotomayor et al., 2011 (Tesis de licenciatura).
Diseño de Oligonucleótidos
•  Basic Local Alignment Sequence Tool (BLAST) del National
Center for Biotechnology Information (NCBI).
▫  Validar su especificidad única hacia secuencias de PRRS,
así como la especificidad del linaje origen.
Procedimiento
1.  Extracción viral
▫  Gibco Life Technologies 1996.
▫  PureLink, RNA/DNA extraction.
2.  RT-PCR. Kit RT-PCR One Step Invitrogen®
3.  Gel de electroforesis horizontal.
Extracción de RNA
•  Gibco Life Technologies (1996)
La muestra de tejido se
pulveriza con nitrógeno
líquido en un mortero
estéril
Se coloca en un tubo
eppendorf de 1.5 ml
Se le adicionan 700 µl
de Trizol y se mezcla
perfectamente hasta
diluir la muestra
Se deja incubar por 10
minutos a 4°C
Se centrifuga a 12,000
rpm durante 15 min a
4°C
Se deja incubar a 4°C
durante 10
Se agita en vortex
durante 15 segundos
Se adicionan 200 µl de
cloroformo puro
El sobrenadante se
deposita en otro tubo
eppendorf de 1.5 ml
Se le adiciona 1
volumen de isopropanol
(1:1)
Se incuba por 15 min a
4°C
Se centrifuga a 12,000
rpm durante 10 min a
4°C
Una vez seca, la pastilla
de RNA se resuspende
en 20 µl de H2O DEPC
(0.1%).
Se lava la pastilla
(RNA) con 200 µl de
etanol al 70%, mediante
una centrifugación a
12,000 rpm por 10 min
a 4°C.
Beneficios de los
Oligonucleótidos
Utilizados
•  Rápida identificación de muestras positivas.
▫  Rápida toma de decisiones
•  Cantidad mínima de muestra. (.5 ml)
•  Reproducibilidad
Estandarización.
•  Elevada especificidad para una diagnostico preciso del
genoma viral.
•  Procesamiento de distintos tipos de muestras:
▫  Órganos y tejidos (pulmón, cornete nasal, linfonodo, cordón
umbilical)
▫  Semen
▫  Suero
▫  Hisopo nasal
▫  Hisopo oral
▫  Fluidos orales
O
R
F
5
Oligon. Americano+
Control Americano
5 exL A 5 5 exA A L A 5 A A 5 esL E 5 exA E 5 L E Marcador de
Peso
Molecular
Oligon. Americano+
Control Europeo
Oligon. Europeo +
Control Europeo
Oligon. Americano+
Control Europeo
Oligon. Europeo +
Control Europeo
Oligon. Americano+
Control Americano
Oligon. Europeo +
Control Americano
Oligon. Europeo +
Control Americano
Marcador de
Peso
Molecular
•  Especificidad
5 A E Identificación de cepas americana y europea sin reacción cruzada.
•  Diferenciación
O
R
F
VPA
ORF 7
VPE
ORF 7
7
Diferente tamaño de amplicon para diferenciar la cepa americana de la
europea, con un mismo par de oligonucleótidos.
Diferenciación entre cepa vacunal y
cepas de campo
Vacuna
Cepas de
campo
Id
Muestra
Procedencia
Fecha de
(estado)
Muestreo
1
pulmón y linfonodo
Hidalgo
18-Abr-11
2
pulmón y linfonodo
Hidalgo
18-Abr-11
3
pulmón
Guanajuato
20-Abr-11
4
pulmón
Guanajuato
20-Abr-11
5
cornetes nasales
Guanajuato
20-Abr-11
6
2 hisopos nasales
Sonora
25-Abr-11
7
2 pulmones, 1 linfonodo
Puebla
25-Abr-11
8
3 pulmones
Veracruz
25-Abr-11
9
2 pulmones
Veracruz
25-Abr-11
10
2 pulmones, 1 linfonodo
Veracruz
25-Abr-11
11
2 pulmones
Veracruz
25-Abr-11
12
2 pulmones
Puebla
25-Abr-11
13
3 pulmones; 1 linfonodo
Veracruz
25-Abr-11
14
2 pulmones
Puebla
25-Abr-11
15
2 pulmones, 1 linfonodo
Veracruz
25-Abr-11
16
2 pulmones
Puebla
25-Abr-11
17
1 pulmón
Puebla
25-Abr-11
18
1 pulmón
Morelos
27-Abr-11
19
1 pulmón
Morelos
27-Abr-11
20
1 pulmón
Morelos
27-Abr-11
21
1 semen
Morelos
27-Abr-11
22
6 pulmones
Estado de México
09-Sep-09
23
3 pulmones, 1 tráquea
Tamaulipas
23-Sep-09
24
4 pulmones
Veracruz
25
1 pulmón, 1 tonsila
Jalisco
19-Jul-09
26
1 pulmón, 1 tonsila
Jalisco
19-Jul-09
27
1 pulmón, 1 tonsila
Michoacán
21-Jul-09
Oct-09
Muestras
31
5 pulmones
Edo. de México
09-Sep-09
32 3 pulmones
Tamaulipas
21-Sep-09
33
Tamaulipas
22-Sep-09
34 5 pulmones
Veracruz
22-Sep-09
35
Veracruz
22-Sep-09
36 1 pulmón, 1 tonsila
Guanajuato
14-Jul-09
37
Jalisco
19-Jul-09
38 1 pulmón, 1 tonsila
Michoacán
20-Jul-09
39 1 pulmón, 1 tonsila
Michoacán
21-Jul-09
40 13 pulmones
Veracruz
04-Nov-09
41
Veracruz
05-Nov-09
Veracruz
10-Nov-09
3 pulmones
2 pulmones, 2 tráqueas
1 pulmón, 1 tonsila
23 pulmones, 23 tráqueas
42 20 pulmones
43 5 pulmones, 5 tráquea, 5 Edo. de México
10-Nov-09
tonsilas
44 3 pulmones, 3 tonsilas
Oaxaca
45
Edo. de México
01-Mar-10
46 63 pulmones
Jalisco
14-Ene-10
47
Jalisco
21-Ene-10
48 80 pulmones
Veracruz
21-Ene-10
49 80 pulmones
Veracruz
21-Ene-10
50 80 pulmones
Querétaro
21-Ene-10
51
30 pulmones
Edo. de México
21-Ene-10
52
50 pulmones
Querétaro
02-Feb-10
53
125 pulmones
Guanajuato
02-Feb-10
54
34 pulmones
Veracruz
02-Feb-10
55
10 pulmones
Michoacán
02-Feb-10
56
140
6 pulmones
100 pulmones
pulmones,
1 4 0 Yucatán
Dic-09
19-Feb-10
Muestras
86
1 hisopo nasal
Estado de México
01-Jun-11
87
1 pulmón
Estado de México
01-Jun-11
59
1 semen
Edo. de México
Jun-10
88
1 pulmón
Veracruz
01-Jun-11
60
aislamiento viral
Edo. de México
Sep-10
89
1 pulmón
Veracruz
01-Jun-11
61
2 pulmones, 2 tonsilas
Estado México
Sep-10
90
1 lechón
Veracruz
01-Jun-11
62
10 hisopos nasales
Estado de México
Sep-10
91
1 lechón
Veracruz
01-Jun-11
63
15 pulmones
Distrito Federal
Nov-10
92
1 lechón
Hidalgo
02-Jun-11
64
1 pulmón, 1 tráquea
Guerrero
Oct-10
93
pulmón
DF
19-Ene-11
65
15 pulmones
Tlaxcala
Nov-10
94
pulmón
Tlaxcala
19-Ene-11
66
10 pulmones
Puebla
Nov-10
95
pulmón
Puebla
19-Ene-11
67
20 sueros
Sonora
Oct-10
96
4 pulmones
Guanajuato
17-Jun-11
68
3 pulmones
Guerrero
Nov-10
97
4 pulmones
Guanajuato
17-Jun-11
69
3 pulmones
Hidalgo,
27-Ene-11
98
hisopos nasales
Hidalgo
17-Jun-11
70
3 cordones umbilicales
Morelos
27-Ene-11
99
hisopos nasales
Hidalgo
17-Jun-11
71
1 pulmón
Estado México
07-Oct-10
100
hisopos nasales
Hidalgo
17-Jun-11
72
1 pulmón
Estado México
07-Oct-10
101
hisopos nasales
Hidalgo
17-Jun-11
73
1 pulmón
Estado México
07-Oct-10
102
hisopos nasales
Hidalgo
17-Jun-11
74
1 pulmón
Estado México
07-Oct-10
103
hisopos nasales
Hidalgo
17-Jun-11
75
1 pulmón
Estado México
07-Oct-10
104
pulmón
Hidalgo
17-Jun-11
76
1 pulmón
Estado México
07-Oct-10
105
pulmón
Hidalgo
17-Jun-11
77
1 hisopo nasal
Sonora
31-May-11
78
1 hisopo nasal
Sonora
31-May-11
106
1 pulmon
Sonora
22-Jun-11
79
1 hisopo nasal
Sonora
31-May-11
107
1 pulmón
Sonora
22-Jun-11
80
1 hisopo nasal
Sonora
31-May-11
108
hisopos nasales
Sonora
22-Jun-11
81
1 hisopo nasal
Sonora
31-May-11
109
hisopos nasales
Sonora
22-Jun-11
82
1 pulmón
Sonora
31-May-11
110
hisopos nasales
Sonora
22-Jun-11
83
1 pulmón
Sonora
31-May-11
111
pulmón
Jalisco
01-Jul-11
84
1 hisopo nasal
Estado de México
01-Jun-11
112
pulmón
Jalisco
01-Jul-11
85
1 hisopo nasal
Estado de México
01-Jun-11
113
4 pulmones
Jalisco
01-Jul-11
114
2 pulmones
Jalisco
01-Jul-11
Resultados
Distribución de las Variantes Encontradas
•  Árbol filogenético
derivado de ORF
5.
•  Estudio realizado
en España para
evaluar la
influencia del
tiempo en la
heterogenicidad
genética del virus.
Prieto, 2009
Secuenciación
•  La secuenciación del virus de PRRS es cada vez más
utilizada como una herramienta para mejorar
la comprensión del virus que está circulando
activamente dentro de una piara, sistema de
producción o región geográfica.
•  Puede ayudar a los médicos veterinarios y a los
productores porcinos a comprender el origen, la
evolución y el movimiento del virus PRRS en,
dentro y entre piaras.
•  El aumento de análisis de secuenciación genética
que se realizan es debido al número de proyectos
de control de área regionales.
Rodger Main, 2012.
Filogenia esquemática de los subtipos
americano y europeo del virus de PRRS
•  Una línea de tiempo se muestra en el centro de la figura.
•  El lado izquierdo muestra el tiempo de divergencia del subtipo (1) estimada por Hanada et
al. (2005) utilizando el pariente más cercano, el LDEV, para deducir la secuencia de
nucleótidos del ancestro.
•  En el lado de la derecha se muestran las estimaciones del tiempo de divergencia de los
subtipos (1) y de linajes dentro de subtipos (MRCAs locales) (2 y 3).
Forsberg, 2005
Conclusiones
•  Oligonucleótidos específicos.
▫  Permiten identificar cepas de campo y vacunales
(americana o europea).
Secuenciación
–  Cambios genéticos-cambios antigénicos.
–  Formación de variantes endémicas.
Colaboradores:
Dr. J. Iván Sánchez Betancourt
Dra. María Elena Trujillo Ortega
M. En C. Carmen Mercado García
MVZ Paulina Avalos Guzmán
Gracias
mvzaliciasotomayor@gmail.com