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DIAGNÓSTICO MOLECULAR GENERADO POR LA UNAM MVZ Alicia Sotomayor González Agente Etiológico • Orden :Nidovirales ▫ Familia: Arteriviridae (Jerusalén, agosto de 1996) Género: Arterivirus • Caracteristicas: ▫ Alta variabilidad genética y antigénica ▫ Infectar macrófagosmonocitos induciendo infecciones persistentes ▫ Modular el sistema inmunológico ▫ Capacidad de producir viremia prolongada Imagen obtenida de: www.revistas.uchile.cl Agente Etiológico • 8 marcos de lectura abiertos (ORF “open reading frame”) Genoma del virus de PRRS RNA polimerasa Genes estructurales codifican la RNA polimerasa viral codifica para la estructura proteica GP2 codifica para la estructura proteica GP3 codifica para la estructura proteica GP4 reconocer el receptor de células blanco e induce apoptosis liberación y ensamblaje de nuevas partículas virales Codifica para la proteína N Agente Etiológico ORF 5 Codifica para la proteína de la envoltura GP5. ORF 7 Codifica para la proteína N Glicoproteína de 200 aminoácidos. Induce una producción elevada de anticuerpos sin actividad protectora evidente Es el gen más variable. Interactúa con el ARN viral para el conjunto de partículas infecciosas. Se encarga de reconocer el receptor celular de las células blanco e inducir apoptosis. Es la más pequeña (20 al 40% de la proteína total que contiene el virión) Agente Etiológico • Designación de dos serotipos principales de referencia: ▫ Americano ▫ Europeo • Entre ellos la variabilidad genética puede llegar a ser muy alta (80%). • El virus evoluciona por mutaciones al azar y recombinación antigénica. Diagnóstico Diagnóstico: Detección de anticuerpos contra el virus (serología) Reacción en cadena de la Polimerasa con Transcriptasa Reversa (RT PCR) Identificación: Aislamiento viral en células MARK 145 RT-PCR Secuenciación RFLP (polimorfismo de longitud en fragmentos mediante el uso de patrones de corte con enzimas de restricción ) RT-PCR • Técnica rápida • Elevada especificidad y sensibilidad • Útil para la detección del virus El ARN viral se convierte en ADN complementario por la enzima RT Es amplificado por la enzima Taq polimerasa Diagnóstico en el DMZ:C • Laboratorio BSL-3 Procedimiento para el Diagnóstico Molecular del Arterivirus Porcino Diseño de Oligonucleótidos ClonManager Versión 7.0 170 secuencias de linaje americano 50 secuencias de linaje europeo. PRIMER Confirmación de la alineación. • Oligonucleotidos utilizados: Basic Local Alignment Sequence Tool (BLAST) del National Center for Biotechnology Information (NCBI) Validar su especificidad única hacia secuencias de PRRS, así como la especificidad del linaje origen. ▫ Sotomayor et al., 2011 (Tesis de licenciatura). Diseño de Oligonucleótidos • Basic Local Alignment Sequence Tool (BLAST) del National Center for Biotechnology Information (NCBI). ▫ Validar su especificidad única hacia secuencias de PRRS, así como la especificidad del linaje origen. Procedimiento 1. Extracción viral ▫ Gibco Life Technologies 1996. ▫ PureLink, RNA/DNA extraction. 2. RT-PCR. Kit RT-PCR One Step Invitrogen® 3. Gel de electroforesis horizontal. Extracción de RNA • Gibco Life Technologies (1996) La muestra de tejido se pulveriza con nitrógeno líquido en un mortero estéril Se coloca en un tubo eppendorf de 1.5 ml Se le adicionan 700 µl de Trizol y se mezcla perfectamente hasta diluir la muestra Se deja incubar por 10 minutos a 4°C Se centrifuga a 12,000 rpm durante 15 min a 4°C Se deja incubar a 4°C durante 10 Se agita en vortex durante 15 segundos Se adicionan 200 µl de cloroformo puro El sobrenadante se deposita en otro tubo eppendorf de 1.5 ml Se le adiciona 1 volumen de isopropanol (1:1) Se incuba por 15 min a 4°C Se centrifuga a 12,000 rpm durante 10 min a 4°C Una vez seca, la pastilla de RNA se resuspende en 20 µl de H2O DEPC (0.1%). Se lava la pastilla (RNA) con 200 µl de etanol al 70%, mediante una centrifugación a 12,000 rpm por 10 min a 4°C. Beneficios de los Oligonucleótidos Utilizados • Rápida identificación de muestras positivas. ▫ Rápida toma de decisiones • Cantidad mínima de muestra. (.5 ml) • Reproducibilidad Estandarización. • Elevada especificidad para una diagnostico preciso del genoma viral. • Procesamiento de distintos tipos de muestras: ▫ Órganos y tejidos (pulmón, cornete nasal, linfonodo, cordón umbilical) ▫ Semen ▫ Suero ▫ Hisopo nasal ▫ Hisopo oral ▫ Fluidos orales O R F 5 Oligon. Americano+ Control Americano 5 exL A 5 5 exA A L A 5 A A 5 esL E 5 exA E 5 L E Marcador de Peso Molecular Oligon. Americano+ Control Europeo Oligon. Europeo + Control Europeo Oligon. Americano+ Control Europeo Oligon. Europeo + Control Europeo Oligon. Americano+ Control Americano Oligon. Europeo + Control Americano Oligon. Europeo + Control Americano Marcador de Peso Molecular • Especificidad 5 A E Identificación de cepas americana y europea sin reacción cruzada. • Diferenciación O R F VPA ORF 7 VPE ORF 7 7 Diferente tamaño de amplicon para diferenciar la cepa americana de la europea, con un mismo par de oligonucleótidos. Diferenciación entre cepa vacunal y cepas de campo Vacuna Cepas de campo Id Muestra Procedencia Fecha de (estado) Muestreo 1 pulmón y linfonodo Hidalgo 18-Abr-11 2 pulmón y linfonodo Hidalgo 18-Abr-11 3 pulmón Guanajuato 20-Abr-11 4 pulmón Guanajuato 20-Abr-11 5 cornetes nasales Guanajuato 20-Abr-11 6 2 hisopos nasales Sonora 25-Abr-11 7 2 pulmones, 1 linfonodo Puebla 25-Abr-11 8 3 pulmones Veracruz 25-Abr-11 9 2 pulmones Veracruz 25-Abr-11 10 2 pulmones, 1 linfonodo Veracruz 25-Abr-11 11 2 pulmones Veracruz 25-Abr-11 12 2 pulmones Puebla 25-Abr-11 13 3 pulmones; 1 linfonodo Veracruz 25-Abr-11 14 2 pulmones Puebla 25-Abr-11 15 2 pulmones, 1 linfonodo Veracruz 25-Abr-11 16 2 pulmones Puebla 25-Abr-11 17 1 pulmón Puebla 25-Abr-11 18 1 pulmón Morelos 27-Abr-11 19 1 pulmón Morelos 27-Abr-11 20 1 pulmón Morelos 27-Abr-11 21 1 semen Morelos 27-Abr-11 22 6 pulmones Estado de México 09-Sep-09 23 3 pulmones, 1 tráquea Tamaulipas 23-Sep-09 24 4 pulmones Veracruz 25 1 pulmón, 1 tonsila Jalisco 19-Jul-09 26 1 pulmón, 1 tonsila Jalisco 19-Jul-09 27 1 pulmón, 1 tonsila Michoacán 21-Jul-09 Oct-09 Muestras 31 5 pulmones Edo. de México 09-Sep-09 32 3 pulmones Tamaulipas 21-Sep-09 33 Tamaulipas 22-Sep-09 34 5 pulmones Veracruz 22-Sep-09 35 Veracruz 22-Sep-09 36 1 pulmón, 1 tonsila Guanajuato 14-Jul-09 37 Jalisco 19-Jul-09 38 1 pulmón, 1 tonsila Michoacán 20-Jul-09 39 1 pulmón, 1 tonsila Michoacán 21-Jul-09 40 13 pulmones Veracruz 04-Nov-09 41 Veracruz 05-Nov-09 Veracruz 10-Nov-09 3 pulmones 2 pulmones, 2 tráqueas 1 pulmón, 1 tonsila 23 pulmones, 23 tráqueas 42 20 pulmones 43 5 pulmones, 5 tráquea, 5 Edo. de México 10-Nov-09 tonsilas 44 3 pulmones, 3 tonsilas Oaxaca 45 Edo. de México 01-Mar-10 46 63 pulmones Jalisco 14-Ene-10 47 Jalisco 21-Ene-10 48 80 pulmones Veracruz 21-Ene-10 49 80 pulmones Veracruz 21-Ene-10 50 80 pulmones Querétaro 21-Ene-10 51 30 pulmones Edo. de México 21-Ene-10 52 50 pulmones Querétaro 02-Feb-10 53 125 pulmones Guanajuato 02-Feb-10 54 34 pulmones Veracruz 02-Feb-10 55 10 pulmones Michoacán 02-Feb-10 56 140 6 pulmones 100 pulmones pulmones, 1 4 0 Yucatán Dic-09 19-Feb-10 Muestras 86 1 hisopo nasal Estado de México 01-Jun-11 87 1 pulmón Estado de México 01-Jun-11 59 1 semen Edo. de México Jun-10 88 1 pulmón Veracruz 01-Jun-11 60 aislamiento viral Edo. de México Sep-10 89 1 pulmón Veracruz 01-Jun-11 61 2 pulmones, 2 tonsilas Estado México Sep-10 90 1 lechón Veracruz 01-Jun-11 62 10 hisopos nasales Estado de México Sep-10 91 1 lechón Veracruz 01-Jun-11 63 15 pulmones Distrito Federal Nov-10 92 1 lechón Hidalgo 02-Jun-11 64 1 pulmón, 1 tráquea Guerrero Oct-10 93 pulmón DF 19-Ene-11 65 15 pulmones Tlaxcala Nov-10 94 pulmón Tlaxcala 19-Ene-11 66 10 pulmones Puebla Nov-10 95 pulmón Puebla 19-Ene-11 67 20 sueros Sonora Oct-10 96 4 pulmones Guanajuato 17-Jun-11 68 3 pulmones Guerrero Nov-10 97 4 pulmones Guanajuato 17-Jun-11 69 3 pulmones Hidalgo, 27-Ene-11 98 hisopos nasales Hidalgo 17-Jun-11 70 3 cordones umbilicales Morelos 27-Ene-11 99 hisopos nasales Hidalgo 17-Jun-11 71 1 pulmón Estado México 07-Oct-10 100 hisopos nasales Hidalgo 17-Jun-11 72 1 pulmón Estado México 07-Oct-10 101 hisopos nasales Hidalgo 17-Jun-11 73 1 pulmón Estado México 07-Oct-10 102 hisopos nasales Hidalgo 17-Jun-11 74 1 pulmón Estado México 07-Oct-10 103 hisopos nasales Hidalgo 17-Jun-11 75 1 pulmón Estado México 07-Oct-10 104 pulmón Hidalgo 17-Jun-11 76 1 pulmón Estado México 07-Oct-10 105 pulmón Hidalgo 17-Jun-11 77 1 hisopo nasal Sonora 31-May-11 78 1 hisopo nasal Sonora 31-May-11 106 1 pulmon Sonora 22-Jun-11 79 1 hisopo nasal Sonora 31-May-11 107 1 pulmón Sonora 22-Jun-11 80 1 hisopo nasal Sonora 31-May-11 108 hisopos nasales Sonora 22-Jun-11 81 1 hisopo nasal Sonora 31-May-11 109 hisopos nasales Sonora 22-Jun-11 82 1 pulmón Sonora 31-May-11 110 hisopos nasales Sonora 22-Jun-11 83 1 pulmón Sonora 31-May-11 111 pulmón Jalisco 01-Jul-11 84 1 hisopo nasal Estado de México 01-Jun-11 112 pulmón Jalisco 01-Jul-11 85 1 hisopo nasal Estado de México 01-Jun-11 113 4 pulmones Jalisco 01-Jul-11 114 2 pulmones Jalisco 01-Jul-11 Resultados Distribución de las Variantes Encontradas • Árbol filogenético derivado de ORF 5. • Estudio realizado en España para evaluar la influencia del tiempo en la heterogenicidad genética del virus. Prieto, 2009 Secuenciación • La secuenciación del virus de PRRS es cada vez más utilizada como una herramienta para mejorar la comprensión del virus que está circulando activamente dentro de una piara, sistema de producción o región geográfica. • Puede ayudar a los médicos veterinarios y a los productores porcinos a comprender el origen, la evolución y el movimiento del virus PRRS en, dentro y entre piaras. • El aumento de análisis de secuenciación genética que se realizan es debido al número de proyectos de control de área regionales. Rodger Main, 2012. Filogenia esquemática de los subtipos americano y europeo del virus de PRRS • Una línea de tiempo se muestra en el centro de la figura. • El lado izquierdo muestra el tiempo de divergencia del subtipo (1) estimada por Hanada et al. (2005) utilizando el pariente más cercano, el LDEV, para deducir la secuencia de nucleótidos del ancestro. • En el lado de la derecha se muestran las estimaciones del tiempo de divergencia de los subtipos (1) y de linajes dentro de subtipos (MRCAs locales) (2 y 3). Forsberg, 2005 Conclusiones • Oligonucleótidos específicos. ▫ Permiten identificar cepas de campo y vacunales (americana o europea). Secuenciación Cambios genéticos-cambios antigénicos. Formación de variantes endémicas. Colaboradores: Dr. J. Iván Sánchez Betancourt Dra. María Elena Trujillo Ortega M. En C. Carmen Mercado García MVZ Paulina Avalos Guzmán Gracias mvzaliciasotomayor@gmail.com